Синтез дигуанилатциклазы Thermotoga Maritime и двух химерных белков, используя систему бесклеточного синтеза белка

Размещено на http://www.allbest.ru/

Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси

Синтез дигуанилатциклазы Thermotoga Maritime и двух химерных белков, используя систему бесклеточного синтеза белка

Казловский И. С., магистр биологических наук, научный сотрудник

Бельская И.В., магистр биологических наук, младший научный сотрудник, Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии

Булатовский А.Б.. магистр биологических наук, младший научный сотрудник,

Зинченко А.И., доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией

Kazlouski I.S., Master of Biol. Sci., researcher, Institute of Microbiology, Belarus National Academy of Sciences

Belskaya I. V. Master of Biol. Sci., junior researcher, The Republican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology

Bulatovskiy A.B. Master of Biol. Sci., junior researcher, Institute of Microbiology, Belarus National Academy of Sciences

Zinchenko A.I. Sc.D., professor, head of laboratory, Institute of Microbiology, Belarus National Academy of Sciences

ESCHERICHIA COLI-BASED CELL-FREE SYNTHESIS OF THERMOTOGA MARITIME DIGUANYLATE CYCLASE AND TWO CHIMERIC PROTEINS

Summary. One of the novel promising trends of molecular biotechnology is cell-free synthesis of proteins. The procedure is based on reconstruction in vitro of all stages of protein biosynthesis in a whole cell, including transcription, aminoacylation of tRNA and translation of mRNA by ribosomes. Feasibility of producing diguanylate cyclase (DGC) of Thermotoga maritime and two chimeric proteins: human annexin-A5 fused with adenosine deaminase (A5-ADase) of Escherichia coli, and modified Taq DNA polymerase fused with DNA-affine domain of bacteria Sulfolobus solfataricus (Diamond-DNA polymerase), by cell-free biosynthesis procedure as an alternative to classical submerged fermentation method was evaluated in the present investigation. Chimeric RNA polymerase of T7 bacteriophage, S30-cell extract of Escherichia coli and multicopy plasmid vector pET42mut were engaged for protein synthesis. The completed research resulted in the first successful biosynthesis of these proteins in cell-free system. Under partially optimized process conditions, 1 ml experimental samples of DGC, A5-ADase and Diamond-DNA polymerase with enzyme activities 45 U/ml, 5 U/ml and 250 U/ml, respectively, were produced.

Key words: chimeric protein, diguanylate cyclase, annexin-A5, adenosine deaminase, Diamond-DNA polymerase, Escherichia coli, cell-free protein synthesis system, multicopy plasmidКлючевые слова: химерный белок, дигуанилатциклаза, аннексин-А5, аденозиндезаминаза, Диамант- ДНК-полимераза, Escherichia coli, бесклеточный синтез белка, высококопиийная плазмида

Аннотация

Одним из новых перспективных направлений молекулярной биотехнологии является бесклеточный синтез белка (БСБ). Процедура БСБ основана на реконструкции in vitro всех этапов биосинтеза белка в клетке, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами. В настоящем исследовании в качестве варианта, альтернативного каноническому глубинному культивированию в ферментере, была изучена возможность синтеза в бактериальной системе БСБ дигуанилатциклазы (ДГЦ) бактерии Thermotoga maritime и двух химерных белков: человеческого анннексина-А5, слитого с аденозиндезаминазой Escherichia coli (А5-АДаза), и модифицированной Taq- ДНК-полимеразы, слитой с ДНК-аффинным доменом бактерии Sulfolobus solfataricus (Диамант-ДНК- полимераза). Для синтеза этих белков использовали S30-клеточный экстракт E. coli, химерную РНК- полимеразу бактериофага Т7 и высококопийный плазмидный вектор pET42mut. В результате выполнения работы нами впервые продемонстрирована возможность синтеза данных белков в системе БСБ. При этом в частично оптимизированных условиях проведения процесса получено по 1 мл экспериментальных образцов ДГЦ, А5-АДазы и Диамант-ДНК-полимеразы с активностью 45 Ед/мл, 5 Ед/мл и 250 Ед/мл ферментного препарата, соответственно.

синтез дигуанилатциклаза белок

Введение

В настоящее время для получения лекарственных препаратов пептидной или белковой природы (интерферонов, антигенов, антител, гормонов) широко применяется биотехнология на основе генетической инженерии (выделение и клонирование генов, получение кДНК, введение генов в чужеродные про- или эукариотические клетки, экспрессия гетерологичных белков). Несмотря на значительные достижения, этот подход имеет существенные ограничения: 1) не все гены экспрессируются в «чужом молекулярном окружении» из-за несоответствия элементов регуляции реципиентных клеток и донорских генов; 2) пока не удалось достичь экспрессии полицистронных мРНК; 3) не происходит посттрансляционная модификация и формирование нативной структуры протеинов высших эукариот в бактериальных клетках.

В качестве альтернативы канонической генноинженерной технологии получения хозяйственно важных белков ряд исследовательских групп начали использовать для протеинового синтеза бесклеточные системы [1-3].

Реакционная смесь для бесклеточного синтеза белка (БСБ) - открытая система без физических барьеров, таких как клеточная мембрана. Выход конечного продукта зависит от концентрации каждого компонента, которую можно варьировать в широких пределах, в отличие от ситуации in vivo, то есть варианта с использованием целых клеток. При этом конечная концентрация белка достигает более 2 мг/мл реакционной смеси [4].

Система БСБ предусматривает транскрипцию гена и трансляцию мРНК in vitro - в лизате клеток, в который вносят рекомбинантную ДНК, аминокислоты, нуклеотиды, кофакторы и АТФ- регенерирующую систему. Эндогенная генетическая информация (ДНК и мРНК клетки- хозяина) при этом удаляется.

По сравнению с системами, основанными на целых клетках, системы БСБ обладают рядом преимуществ. Среди них можно выделить:

продукцию исключительно целевого белка, что кардинально облегчает процедуру его выделения и очистки;

возможность синтеза токсичных для клеток белков;

возможность синтеза белков, которые содержат неприродные аминокислоты;

возможность решать проблему агрегации целевого белка путем ввода в реакционную смесь агентов, позволяющих удерживать

синтезирующийся полипептид в растворе.

В настоящее время БСБ стал экономичной и легко масштабируемой технологией для получения препаративных количеств различных белковых продуктов.

Аннексин-А5 представляет собой белок с повышенным сродством к фосфатидилсерину - фосфолипиду, выстилающему поверхность раковых клеток. Поскольку на поверхности большинства здоровых клеток фосфатидилсерин отсутствует, его широко используют в качестве мишени для избирательной доставки в опухоли визуализирующих красителей [5]. Таким образом, аннексин-А5 - привлекательный белок для использования в качестве селективного транспортера в опухоль тех или иных лекарственных соединений. Есть основания полагать, что химерный белок, состоящий из анннексина-А5 и аденозиндезаминазы (А5-АДазы), будет за счет аннексина-А5 связываться с раковыми клетками и устранять аденозин, защищающий раковые клетки от противоопухолевого иммунитета хозяина [6].

Циклический дигуанозинмонофосфат (цикло- диГМФ), согласно литературным данным, продуцируется только бактериями и обладает выраженными стимулирующими свойствами в отношении иммунной системы позвоночных. В настоящее время цикло-диГМФ получают, главным образом, с помощью трудоемкого химического синтеза. В то же время ферментативный синтез с использованием дигуанилатциклазы Thermotoga maritime (ДГЦ) представляет собой одностадийный процесс конденсации двух молекул гуанозин-5'-трифосфата [7].

Диамант-ДНК-полимераза представляет собой химерную ДНК-полимеразу с улучшенными свойствами за счет присоединения к Taq-ДНК- полимеразе ДНК-связывающего домена (SSO7D) бактерии Sulfolobus solfataricus [8].

Целью настоящей работы служило получение в системе БСБ рекомбинантных ДГЦ, А5-Адазы и Диамант-ДНК-полимеразы, синтез которых традиционным способом, предусматривающим использование целых бактериальных клеток, затруднен.

Материалы и методы исследования

Источником генов ДГЦ (TM1788), А5-Адазы (anxA5-add) и Диамант-ДНК-полимеразы (SSO_RS12375-taq) служили ДНК T. maritime, низкокопийные плазмиды pET42-A5-add [9] и pET18b-STaq [8], соответсвенно. Целевые фрагменты ДНК амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием синтетических праймеров. Подбор праймеров проводили с использованием программного обеспечения UGENE 1.22 (UniPro, Россия) на основе нуклеотидных последовательностей целевых генов. На 5'- окончания праймеров были добавлены последовательности, комплементарные плазмиде pET42mut [10]. Амплификацию осуществляли по следующей программе: этап предденатурации (30 с при 98 oC) - 30 циклов амплификации (10 с при 98 °С; 15 с при 55 oC; 1 мин при 72 oC) - финальная элонгация 75 с при 72 оС. На втором этапе линеаризовали плазмиду pET42mut методом, описанным ранее [10].

На следующем этапе собирали линеаризованный вектор и целевые гены методом продолжительной перекрывающейся ПЦР (1111- ПЦР) по следующей программе: этап предденатурации (30 с при 98 oC) - 16 циклов амплификации (10 с при 98 oC; 15 с при 50 oC; 4 мин при 72 0С) - финальная элонгация 5 мин при 72 0С. На этом этапе в качестве матрицы и затравки были использованы фрагменты, полученные на первых двух этапах, в эквимолярных количествах.

Синтезированным в ходе ПП-ПЦР продуктом трансформировали компетентные клетки E. coli XL (Novagen, США) c последующим посевом на плотную селективную питательную среду с добавлением канамицина (100 мкг/мл).

Для определения наличия плазмид, содержащих целевые «вставки ДНК», использовали стандартный метод ПЦР-скрининга.

Клетки, содержащие целевые плазмиды, культивировали в жидкой среде LB с последующим выделением плазмидной ДНК методом щелочного лизиса.

Для синтеза белков использовали следующую реакционную смесь (1.0 мл): 0.25 мл клеточного экстракта S30, 0.65 мл премикса, 5 000 ед. активности РНК-полимеразы бактериофага Т7, 500 нг плазмидной ДНК, полученные на предыдущем этапе работы, и инкубировали при 30 °С в течение 5-6 ч.

Активность ДГЦ, А5-АДазы и Диамант-ДНК- полимеразы определяли согласно методов, описанных в работах [11], [9] и [8].

Результаты и обсуждение

Первый этап работы включал в себя амплификацию генов TM1788, anxA5-add и SSO_RS12375-taq, кодирующих аминокислотные последовательности ДГЦ T. maritime и последовательности химерных белков А5-АДазы и Диамант-ДНК-полимеразы, соответственно.

Постановка горизонтального ДНК- электрофореза в агарозном геле после выделения и амплификации генов позволила убедиться в получении нуклеотидных последовательностей требуемых размеров: TM1788 - 750 п.н., anxA5-add - 2000 п.н. и SSO RS12375-taq - 2800 п.н. (рис. 1).

М- маркер молекулярных масс фрагментов ДНК Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации генов ТМ1788 (1), anxA5-add (2) и SSO_RS12375-taq (3)

На следующем этапе проводили линеаризацию вектора рЕТ42ти с помощью ПЦР. Праймеры для линеаризации вектора подбирали таким образом, чтобы при встраивании в плазмиду на 3'-окончание целевого гена добавлялась последовательность нуклеотидов, обеспечивающая наличие дополнительного октагистидиного олигопептида на С-конце целевого белка.

Затем проводили постановку ПП-ПЦР которая, в отличие от стандартной ПЦР, требует наличия в векторе и вставке перекрывающихся комплементарных участков, добавляемых на стадии клонирования целевых генов. Таким образом, интересующие гены ТМ1788, anxA5-add и SSO_RS12375-taq были встроены в плазмиду рЕТ42тиі Полинуклеотидным материалом, полученным в результате постановки ПП-ПЦР, трансформировали компетентные клетки E. coli XL. Из выросших трансформантов выделили плазмиды, которые в дальнейшем подвергли секвенированию для проверки наличия правильных нуклеотидных последовательностей. В результате были созданы высококопийные плазмиды pET42mut-dgc, pET42mut-A5A и pET42mut-STaq.

На следующем этапе работы проводили оценку эффективности синтеза ДГЦ, А5-АДазы и Диамант-ДНК-полимеразы в системе БСБ на основе S30 экстракта из E. coli. Конечная концентрация компонентов реакции составляла: 100 мМ HEPES-KOH (pH 8.0), 8 мМ ацетат магния, 90 мМ ацетат калия, 20 мМ фосфоенолпируват калия, набор аминокислот (каждая в концентрации 1.3 мМ), 0.15 мг/мл фолиевой кислоты, каждый из четырех рибонуклеозидтрифосфатов в концентрации 1 мМ, 0.05% азид натрия, 2% полиэтиленгликоль-8000, 0.04 мг/мл пируваткиназы, 5.5 мкг/мл 88о7Д-РНК-полимеразы фага Т7 [12], 0.3 мг/мл плазмидной ДНК, содержащей гены, кодирующие интересующие белки, 0.5 мг/мл суммарной тРНК и экстракт S30, полученный из лизата клеток E. coli (30% от общего объема реакционной смеси). Инкубацию проводили в течение 6 ч при 30 °С с умеренным перемешиванием. Для контроля синтеза ферментов, каждый час отбирали по 1 мкл для анализа ферментативной активности синтезируемых белков. В качестве отрицательного контроля использовали реакционную смесь с внесением вместо плазмидной ДНК соответствующего количества буферного раствора. Результаты синтеза Диамант-ДНК-полимеразы представлены на рис. 2; а рис. 3 отражает синтез ДГЦ и А5-АДазы.

Рис. 2. Синтез Диамант-ДНК-полимеразы в системе БСБ

Рис. 3. Синтез ДГЦ и А5Дазы в системе БСБ

Концентрации ДГЦ, А5-АДазы и Диамант- ДНК-полимеразы в результирующих препаратах, полученных при использовании системе БСБ, составили 45 Ед/мл, 5 Ед/мл и 250 Ед/мл реакционных смесей, соответственно. В качестве сравнения следует отметить, что при получении данных белков в цельноклеточных системах экспрессии, их максимальная концентрация в культуральной жидкости составляла соответственно 0.0036 Ед/мл [11], 0.1325 Ед/мл [9] и 240 Ед/мл [8]. Как можно заметить, экспрессия Диамант-ДНК-полимеразы близка к цельноклеточной, что может свидетельствовать о не полностью оптимизиорованном процессе синтеза этого фермента в системе БСБ.

Заключение

Впервые система БСБ использована для получения бактериального фермента ДГЦ T. maritime, и двух химерных белков (аннексина-А5 человека, слитого с АДазой E. coli, и ДНК- полимеразы бактерии T. aquaticus, слитой с ДНК- аффинным доменом бактерии S. solfataricus). После частичной оптимизации условий проведения процесса БСБ получено по 1 мл экспериментальных образцов ДГЦ, А5-АДазы и Диамант- ДНК-полимеразы с активностью 45 Ед/мл, 5 Ед/мл и 250 Ед/мл ферментного препарата, соответственно. По нашему мнению, синтез этих белков в системе БСБ может выступать в качестве варианта, альтернативного глубинному культивированию штаммов-продуцентов в ферментере.

Литература

Gao W., Cho E., Liu Y., Lu Y. Advances and challenges in cell-free incorporation of unnatural amino acids into proteins. Front. Pharmacol. 2019. Vol. 10. Art. 611. doi:10.3389/fphar.2019.00611

Gregorio N.E., Levine M.Z., Oza J.P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Meth. Protoc. 2019. Vol. 2. Art. 24. doi:10.3390/mps2010024

Yue K., Zhu Y., Kai L. Cell-free protein synthesis: chassis toward the minimal cell. Cells. 2019. Vol. 8, № 4. Art. 315. doi:10.3390/cells8040315

Smith M.T., Varner C.T., Bush D.B., Bundy B.C.The incorporation of the A2 protein to produce novel QP virus-like particles using cell-free protein synthesis. Biotechnol. Progr. 2012. Vol. 28, N 2. P. 549-555.

Riedl S., Rinner B., Asslaber M., Schaider H., Walzer S., Novak A., Lohner K., Zweytick D. In search of a novel target - phosphatidylserine exposed by non- apoptotic tumor cells and metastases of malignancies with poor treatment efficacy. Biochim. Biophys. Acta. 2011. Vol. 1808. P. 2638-2645.

Зинченко А.И. Аденозин как потенциальная мишень для биотерапии рака. Весщ НАН Беларуси Сер. бшл. навук. 2016. № 4. С. 118-128.

Rao F., Pasunooti S., Ng Y., Zhuo W., Lim L., Liu A.W., Liang Z.X. Enzymatic synthesis of c-di- GMP using a thermophilic diguanylate cyclase. Anal. Biochem. 2009. Vol. 389. P. 138-142.

Korovashkina A.S., Kvach S.V., Eroshevskaya L.A., Zinchenko A.I. Production of thermostable DNA polymerase suitable for whole-blood polymerase chain reaction. Biochemistry and Biotechnology: Research and Development / Eds: S.D. Varfolomeev, G.E. Zaikov, L.P. Krylova. New York, Nova Science Publishers, Inc. 2012. Р. 1-5.

Булатовский А.Б., Квач С.В., Ерошевская Л.А., Зинченко А.И. Создание штамма-продуцента химерного белка, состоящего из человеческого аннексина и бактериальной аденозиндезаминазы. Докл. Нац. акад. наук Беларуси 2017. Т. 61, № 4. С. 89-95.

Казловский И.С., Рымко А.Н., Зинченко А.И. Модификация экспрессионной pET-системы для использования в бесклеточном синтезе белка. Сб. науч. трудов Института микробиологии НАН Беларуси «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты». Т. 10. Минск, «Беларуская навука». 2018. С. 69-78.

Korovashkina A.S., Rymko A.N., Kvach S.V., Zinchenko A.I. Enzymatic synthesis of c-di-GMP using inclusion bodies of Thermotoga maritima full-length diguanylate cyclase. J. Biotechnol. 2012. Vol. 164, № 2. P. 276-280.

Казловский И.С., Зинченко А.И. Создание штамма-продуцента химерного белка, состоящего из РНК-полимеразы и ДНК-аффинного домена. Докл. Нац. акад. наук Беларуси 2018. Т. 62, № 5. С. 601-607.

Размещено на Allbest.ru