Филогеномика бактериофагов Р22-типа для разработки препаратов, модифицирующих иммунную систему молодняка птицы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Филогеномика бактериофагов Р22-типа для разработки препаратов, модифицирующих иммунную систему молодняка птицы

Василенко Олег Викторович

канд. биол. наук

Зимин Андрей Антонович

канд. биол. наук

Назипова Нафиса Наиловна

канд. физ.-мат. наук

Введение

филогеномика бактериофаг иммуномодулирующий

Важной задачей для преодоления бактериальных инфекций сельскохозяйственных животных в условиях широкого распространения генов устойчивости к антибиотикам является поиск альтернатив низкомолекулярным антибиотикам [1,2]. Одним из таких средств защиты сельскохозяйственной птицы от патогенных бактерий могут быть бактериофаги [3,4]. Сальмонеллезные инфекции являются одной из наиболее распространенных причин болезней пищевого происхождения в России, а ряд штаммов могут колонизировать кишечный тракт сельскохозяйственной птицы. Контроль сальмонелл у птицы имеет решающее значение для снижения заболеваемости сальмонеллезом у людей. Иммунный ответ у куриц можно модифицировать применением фагов Р22-типа [5,6]. Ранее было показано влияние фага Р22 на иммунную систему с участием макрофагов HD-11 при ответе куриной иммунной системы, как на внутриклеточное, так и на межклеточное развитие бактерий S. typhimurium LT2. В данном исследовании мы оценивали ответ куриных макрофагов HD-11 и влияние фага P22 на вне- и внутриклеточное развитие штамма LT2. Было проведено 4 опыта по экспериментальному заражению птицы LT2: 1) HD-11 клетки в качестве контроля, 2) HD-11 клетки с LT2, 3) HD-11 клетки с LT2 и Р22, а также 4) HD-11 клетки с Р22. Уровень интерлейкина 8 измеряли с помощью ELISA. Кроме того, с помощью QRT-PCR были определены уровни экспрессии генов четырех цитокинов (IL4, IL8, IL10 и гамма-интерферона) в присутствии LT2 и/или Р22. Оказалось, что фаг P22 лизировал как вне-, так и внутриклеточные LT2, которые были сорбированы макро-15 фагами HD-11. С помощью ELISA было выявлено, что макрофаги HD-11 производят значительно больше интерлейкина 8 в присутствии Р22. Эти результаты коррелировали с измерением уровня транскрипции соответствующего гена с помощью QRT-PCR [5]. Для бактериофагов, родственных бактериофагу Р22, также показано наличие ассоциированной с фагом нейроамидазной активности [6]. Эта ферментативная активность обеспечивает разрушение бактериальных пленок, что существенно для проведения терапевтической антибактериальной обработки сельскохозяйственной птицы. Было бы интересно использовать другие, родственные Р22 бактериофаги для модификации и усиления иммунного ответа сельскохозяйственной птицы. Нами проведено сравнение опубликованных геномов фагов, родственных Р22, для оценки вариабельности этих вирусов в природе и выбора новых фагов для усиления иммунного ответа на заражение сальмонеллой у сельскохозяйственной птицы.

В данной работе мы поставили задачу исследования сходства полных геномов бактериофагов группы бактериофага P22 методами биоинформатики без использования множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей геномов этих бактериофагов для прогнозирования выбора дополнительных средств для разработки препаратов, модифицирующих иммунную систему выращиваемой сельскохозяйственными предприятиями птицы.

Материалы и методы

Было проведено сравнение генома бактериофага Р22 с таксономической группой геномов хвостатых бактериофагов из базы данных GenBank. Из результатов работы программного средства Blastn [7] нами были отобраны 15 геномов. В таблице 1 приведен список геномов, отобранных нами для анализа, в последней колонке указан код доступа геномной сборки из базы данных GenBank/ENA/DDBJ.

Таблица 1 - Список геномов, использованных в работе

Полногеномный филогенетический анализ вирусов был выполнен на основе дистантного подхода через вычисление средней идентичности нуклеотидов (Average Nucleotide Identity ? ANI) [8]. Этот метод был впервые применен для сравнения геномов прокариот [9], мы уже применяли его ранее в работе с фаговыми геномами [10], где cреднюю идентичность нуклеотидов для каждой пары фаговых геномов вычисляли с применением алгоритма BLAST (ANIb, в процентах) программой JSpecies v.1.2.1 [8]. Матрицу значений ANIb преобразовывали в таблицу межгеномных расстояний, по которой строили филогеномное дерево методом присоединения соседей (Neighbor-Joining Method) [11]. Построение дерева было проведено с помощью пакета программ MEGA6 [12].

Результаты исследований

Сравнительный анализ геномов бактериофагов P22-группы без использования множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей

Работа по анализу геномов бактериофагов группы Р22 для подбора кандидатов для использования в экспериментах по иммуномодулирующей терапии молодняка сельскохозяйственной птицы проводилась в несколько этапов.

Сначала был проведен анализ базы данных GenBank на наличие полных геномов бактериофагов группы Р22. Затем была сформирована выборка из 15 геномов бактериофагов группы Р22, которые перечислены в таблице 1.

Расчет эволюционных расстояний между геномами этих фагов проводилось с помощью программы JSpecies v.1.2.1. Геномы сравнили друг с другом попарно каждый с каждым, для каждой пары было получено среднее значение величины ANIb.

Алгоритм вычисления среднего значения идентичности для пары геномов схематически можно представить так. Первый геном из пары разбивается на фрагменты длиной 1000 пар нуклеотидов и для каждого такого олигонуклеотида выполняется поиск гомологов во второй геномной последовательности с помощью программы Blastn. Значения нуклеотидной идентичности, вычисленные Blastn для лучших хитов, фильтруются с помощью настроек программы, т.е. низкие значения, которые портят общую картину отбрасываются, и по оставшимся значениям вычисляется усеченное среднее ANIb1. Затем второй геном разбивается на фрагменты, проводится поиск гомологов каждого фрагмента в первом геноме, и вычисляется значение ANIb2. Значение средней идентичности для данной пары геномов ANIb = (ANIb1 + ANIb2)/2. Полученные результаты представлены в виде таблицы 2, где приведены средние значения идентичности олигонуклеотидов ANIb, в % для геномов бактериофагов группы бактериофага P22, цифрами обозначен процент сходства полных геномов бактериофагов полученный с помощью программы JSpecies v.1.2.1.

На следующем этапе с помощью пакета программ MEGA6 строилось дерево эволюционных отношений между геномами исследуемой группы бактериофагов. Оно представлено на рисунке 1.

Рисунок 1 ? Филогеномное дерево бактериофагов.

Дерево построено на основе относительных межгеномных расстояний, вычисленных из таблицы ANIb (Таблица 2).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблица 2 - Значения величин средней идентичности ANIb для пар геномов бактериофагов группы P22

Размещено на http://www.allbest.ru/

Дерево не укоренено. Статистический метод присоединения соседей использовался в пакете MEGA6, средствами которого также выполнена графика. Обозначения фагов как в таблице 1.

На основе анализа дерева эволюционных отношений между геномами, полученного пакетом программ MEGA6 и таблицы эволюционных расстояний основных кластеров геномов бактериофагов, полученной с помощью программы JSpecies v.1.2.1, можно сделать прогноз терапевтической эффективности при комплексном лечении молоди сельскохозяйственной птицы с использованием иммуномодулирующих бактериофагов группы Р22.

Очевидно, что вирусы группируются в ряд кластеров с близкородственными геномами. Полученное дерево содержало две основные ветви. Это была ветвь фагов близких к Р22 и ветвь фагов близких к бактериофагу epsilon34. Наиболее родственными к Р22 оказались две пары практически идентичных фагов Phi20-Phi75 и Sp25-Sp34, далее была удалена от Р22 пара sal4-sal5 и ветвь трех фагов ST104,ST160 и SE1, фаг SPN9CC образовал отдельную подветвь. Близкородственные фаги g341c и epsilon34 вместе с фагами Emek и SEN22 образовали другую ветвь, удаленную от Р22-ветви.

Выводы

1. На основе сравнительного биоинформационного анализа этой группы бактериофагов показана близость всех геномов фагов Р22-группы друг к другу. На основе этого можно прогнозировать выделение перспективных для иммуномодулирующей терапии бактериофагов при исследовании экологии желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственной птицы.

2. Сравнительный анализ геномов фагов группы Р22 позволяет предложить для терапевтических исследований наиболее перспективными фаги: Phi20, Phi75, Sp25, Sp34, sal4, sal5, ST104, ST160 и SE1.

3. Хотя сам бактериофаг Р22 нельзя применять на практике, так как Р22 с высокой эффективностью трансдуцирует гены, включая гены патогенности болезнетворных бактерий, но поиск среди родственных фагов нетрансдуцирующих бактериофагов может принести интересный, перспективный для применения в терапии птицы результат.

4. Данное исследование показало возможность успешного расчета эволюционных расстояний между данными средней длины геномами бактериофагов с помощью программы JSpecies v.1.2.1. Что существенно сокращает время расчетов и позволяет использовать для сравнительного анализа геномов мощные настольные компьютеры, а не суперкомпьютеры или кластеры серверов.

Благодарности. Исследование Василенко О.В. выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-04-01347. Исследование Зимина А.А. выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-54-53018 и частично поддержано бюджетом ИБФМ РАН. Исследование Скобликова Н.Э. выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №19-44-230040 при поддержке администрации Краснодарского края. Исследование Назиповой Н.Н. выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №19-07-00996. Для Кощаева А. Г. работа поддержана грантом Кубанского научного фонда МФИ-20.1/80 и выполнена им в рамках этого проекта.

Список литературы

1. Aminov R. History of antimicrobial drug discovery: Major classes and health impact. // Biochem Pharmacol. ? 2017. ? Jun 1. ? № 133. ?P. 4-19.

2. Зимин А. А. Использование бактериофагов для борьбы с колибактериозом и кампилобактериозом в птицеводстве / А. А. Зимин, Ф. В. Кочетков, С. И. Кононенко, Д. В. Осепчук, Н. Э. Скобликов // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. ? 2016. ? № 123. ? С. 421-432.

3. Никулин Н. А. Конструирование терапевтических фаговых коктейлей на основе бактериофагов Т4: преимущества и недостатки / Н. А. Никулин, С. И. Кононенко, А. Г. Кощаев, А. А. Зимин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2017. - №09(133). ? С. 823-849. Doi: 10.21515/1990-4665-133-063.

4. Зимин А. А. Конструирование мутантов бактериофага Т4 со сниженной антигенностью / Зимин А. А., Бутанаев А. М., Сузина Н. Е., Скобликов Н. Э., Сахабутдинова Л. Р., Присяжная Н. В., Кононенко С. И., Кощаев А. Г. // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2017. ? № 134(10). ? С. 404-426. Doi: 10.21515/1990-4665-134-034.

5. Ahn J. Influence of bacteriophage P22 on the inflammatory mediator gene expression in chicken macrophage HD11 cells infected with Salmonella Typhimurium./ J. Ahn, D. Biswas // I FEMS Microbiol Lett. ? 2014. ? Mar. ? 352(1). ? P. 11-17.

6. Tombinson S. Neuraminidase associated with coliphage E that specifically depolymerizes the Escherichia coli K1 capsular polysaccharide / S. Tombinson, P.W. Taylor// J. Virol. ? 1985 - V. 55. - № 2. - P. 374-378.

7. Altschul S. F., Madden T. L., Schдffer A. A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. ? 1997. ? № 25. ? P. 3389-3402.

8. Goris J., Konstantinidis K. T., Klappenbach J. A., Coenye T., Vandamme P., Tiedje J. M. / DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities // Int J Syst Evol Microbiol. ? 2007. ? № 57(Pt 1). P. 81-91.

9. Richter M., Rossellу-Mуra R. Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition // Proc Natl Acad Sci USA. ? 2009. ? 106(45). P. 19126-19131.

10. Зимин А. А., Кудрявцева А. В., Василенко О. В., Салямов В. И., Летаров А. В., Летарова М. А., Куликов Е. Е., Скобликов Н. Э. Сравнительная геномикаТ4-подобныхбактериофагов (Myoviridae, Caudovirales), выделенных из желудочно-кишечного тракта свиней // Материалы 2-й Пущинской школы-конференции "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов. ? 2015. - С. 132-134.

11. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. ? 1987. ? № 4. P. 406-425.

12. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. // Molecular Biology and Evolution. ? 2013. № 30. P. 2725-2729.

References

1. Aminov R. History of antimicrobial drug discovery: Major classes and health impact. // Biochem Pharmacol. ? 2017. ? Jun 1. ? № 133. ?P. 4-19.

2. Zimin A. A. Ispol'zovanie bakteriofagov dlja bor'by s kolibakteriozom i kampilobakteriozom v pticevodstve / A. A. Zimin, F. V. Kochetkov, S. I. Kononenko, D. V. Osepchuk, N. Je. Skoblikov // Politematicheskij setevoj jelektronnyj nauchnyj zhurnal Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. ? 2016. ? № 123. ? S. 421-432.

3. Nikulin N. A. Konstruirovanie terapevticheskih fagovyh koktejlej na osnove bakteriofagov T4: preimushhestva i nedostatki / N. A. Nikulin, S. I. Kononenko, A. G. Koshhaev, A. A. Zimin // Politematicheskij setevoj jelektronnyj nauchnyj zhurnal Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2017. - №09(133). ? S. 823-849. Doi: 10.21515/1990-4665-133-063.

4. Zimin A. A. Konstruirovanie mutantov bakteriofaga T4 so snizhennoj antigennost'ju / Zimin A. A., Butanaev A. M., Suzina N. E., Skoblikov N. Je., Sahabutdinova L. R., Prisjazhnaja N. V., Kononenko S. I., Koshhaev A. G. // Politematicheskij setevoj jelektronnyj nauchnyj zhurnal Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2017. ? № 134(10). ? S. 404-426. Doi: 10.21515/1990-4665-134-034.

5. Ahn J. Influence of bacteriophage P22 on the inflammatory mediator gene expression in chicken macrophage HD11 cells infected with Salmonella Typhimurium./ J. Ahn, D. Biswas // I FEMS Microbiol Lett. ? 2014. ? Mar. ? 352(1). ? P. 11-17.

6. Tombinson S. Neuraminidase associated with coliphage E that specifically depolymerizes the Escherichia coli K1 capsular polysaccharide / S. Tombinson, P.W. Taylor// J. Virol. ? 1985 - V. 55. - № 2. - P. 374-378.

7. Altschul S. F., Madden T. L., Schдffer A. A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. ? 1997. ? № 25. ? P. 3389-3402.

8. Goris J., Konstantinidis K. T., Klappenbach J. A., Coenye T., Vandamme P., Tiedje J. M. / DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities // Int J Syst Evol Microbiol. ? 2007. ? № 57(Pt 1). P. 81-91.

9. Richter M., Rossellу-Mуra R. Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition // Proc Natl Acad Sci USA. ? 2009. ? 106(45). P. 19126-19131.

10. Zimin A. A., Kudrjavceva A. V., Vasilenko O. V., Saljamov V. I., Letarov A. V., Letarova M. A., Kulikov E. E., Skoblikov N. Je. Sravnitel'naja genomikaT4-podobnyhbakteriofagov (Myoviridae, Caudovirales), vydelennyh iz zheludochno-kishechnogo trakta svinej // Materialy 2-j Pushhinskoj shkoly-konferencii "Biohimija, fiziologija i biosfernaja rol' mikroorganizmov. ? 2015. - S. 132-134.

11. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. ? 1987. ? № 4. P. 406-425.

12. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. // Molecular Biology and Evolution. ? 2013. № 30. P. 2725-2729.

Размещено на Allbest.ru