Активность цитоплазматической и связанной с клеточными стенками β-глюкозидазы в онтогенезе растений Pisum Sativum L

Размещено на http://www.allbest.ru/

Активность цитоплазматической и связанной с клеточными стенками в-глюкозидазы в онтогенезе растений Pisum Sativum L

А.Н. Ершова,

Н.В. Винокурова,

О.Н. Баркалова

ФБОУ ВО "Воронежский государственный педагогический университет"

Аннотация

Определяли активность цитоплазматической и связанной с клеточными стенками молекулярные формы в-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21), расщепляющей специфический для растений гороха изосукцинимид-в-гликозид (ИС-гликозид), в процессе прорастания и роста растений Pisum sativum L. Растения гороха (Рамонский 77) выращивали методом гидропоники или в условиях мел- коделяночного опыта до стадии созревания семян. Активность р-глюкозидазы определяли, используя в качестве субстрата ИС-гликозид, по количеству образовавшейся глюкозы. Адсорбированную р-глюкозидазу выделяли промыванием осадка клеточных стенок 0.1 М фо с фатно-цитратным буфером (pH 6.0), а ионносвязанную форму - раствором 1М NaCl. Одновременно в растениях определяли содержания ИС-гликозида и растворимых сахаров с использованием метода тонкослойной хроматографии. Показано, что в надземной части 5-дневных проростков гороха активность связанной с клеточной стенкой р-глюкозидазы была выше, чем цитоплазматической. Она возрастала в 1.5-3 раза, достигая у 10-дневных проростков для ионно-связанной с клеточной стенкой величины 18.50±0.14, а адсорбированной - 10.6±0.09 ФЕ мг-1 белка. Однако затем начинала резко снижаться. В сухих семенах активность р-глюкозидазы не обнаруживалась, но она присутствовала в семенах на стадии молочной спелости (1.89±0.06 ФЕ мг-1 белка). Активность цитоплазматической р-глюкозидазы в листьях 2-недельных проростков составила 4.30±0.14 ФЕ мг-1 белка и оставалась достаточно высокой до цветения (фаза бутонизации), при этом в корнях она была на порядок ниже. ИС-гликозид также не обнаруживался в сухих семенах. Содержание ИС-гликозида в листьях 10-дневных проростков составляло 5.76±0.06 мг.г-1сыр.массы, что было немногим меньше глюкозы и превышало уровень сахарозы. В корнях содержание ИС-гликозида было всегда более низким, так же как и активность цитоплазматической р-глюкозидазы. Полученные нами результаты позволяют заключить, что цитоплазматическая и связанные с клеточной стенкой молекулярные формы р-глюкозидазы выполняют различные функции в онтогенезе растений гороха. Достаточно высокая активность цитоплазматической р-глюкозидазы в листьях на всех этапах роста позволяет пополнять фонд глюкозы для дыхательного метаболизма клеток растений гороха за счет гидролиза специфического ИС-гликозида, а также участвовать в реакции трансгликозидирования с образованием других гликозидов. Связанные же с клеточной стенкой адсорбированная и ионно-связанная молекулярные формы р-глюкозидазы, активность которых значительно уменьшается с возрастом, обеспечивают участие ИС-гликозида, как поставщика глюкозы, в формировании веществ клеточных стенок у молодых, активно растущих проростков гороха.

Ключевые слова: р-глюкозидаза, цитоплазматическая, связанная с клеточными стенками, активность, изосукцинимид-р-гликозид, онтогенез, растения гороха.

CYTOPLASMIC AND CELL WALL-BOUND В -GLUCOSIDASE ACTIVITY DURING ONTHOGENESIS IN PLANTS OF

PISUM SATIVUM L.

A. N. Ershova, N. V Vinokurova, O. N. Barkalova

Voronezh State Pedagogical University

Activity of cytoplasmic and cell wall-bound molecular forms of в-glucosidase (EC 3.2.1.210) which is degrading plant specific isosuccinimide-в-glucoside (IS-glycoside) during germination and growth of Pisum sativum L. was determined. Pea plants (Ramonskiy 77) were grown hydroponically or during small plot experiments until ripening stage. в-glucosidase activity was determined with IS-glucoside used as a substrate by the amount of glucose formed. Adsorbed в-glucosidase was extracted by cell wall residue washing with 1 M of phosphate-citric buffer (pH 6.0) and ion-bound form with 1 M of NaCl. Simultaneously in plants the content of IS-glucoside and soluble sugars were measured by thin layer chromatography method. It was shown that in over ground part of 5-day-old pea seedlings the activity of cell wall-bound в-glucosidase was higher than cytoplasmatic one. It was 1.5-3-fold increasing and for 10-day-old seedlings for ion-bound with cell wall was 18.50±0.14 and for adsorbed 10.6±0.09 EU mg-1. But later it started sharply decreasing. In dry seeds the activity of в-glucosidase was not detected but it was diagnosed in seeds on milky stage (1.89±0.06 EU mgг-1 of protein). Activity of cytoplasmic в-glucosidase in leaves of 2-week-old seeds was 4.30±0.14 EU mg-1 of protein and remained relatively high till flowering (bud-formation period) though in roots it was substantially lower.IS-glycoside was also not detected in dry seeds. Amount of IS-glycoside in leaves of 10-day-old seedlings was 5.76±0.06 mg g-1 of we weight which was little lower of glucose but exceeded the level of saccharose. In roots the content of IS-glycoside was always lower as cytoplasmic в-glucosidase activity. Our results show that cytoplasmic and cell wallbound molecular forms of в-glucosidase are responsible for different functions in ontogenesis of pea plants. Relatively high activity of cytoplasmic в-glucosidase in leaves during all growth stages allows to refill a fund of glucose for respiratory cell metabolism in pea plants through specific IS-glycoside hydrolysis and be involved in transglycosidation reaction with formation of other glycosides. Cell wall-bound adsorbed and ion-bound molecular forms of в-glucosidase which activity is significantly decreasing with aging, provide participation of IS-glycoside as a glucose supplier in construction of cell wall substances in young and actively growing pea seedlings.

Keywords: в-glucosidase, cytoplasmic, cell ontogenesis, pea plants.

р - глюкозидаза (р - D - глюкозид-глюкогидролазы КФ 3.2.1.21) катализирует гидролитическое расщепление р-гликозидной связи между двумя остатками гликона или связи между глюкозой и алкил- или арилагликоном. [1]. Фермент относится к группе гликозидгидролаз, которые обнаружены в представителях всех царств живых организмов, включая растения [2]. Физиологические функции растительных р-глюкозидаз разнообразны [3]. Они участвуют в регуляции биологической активности фитогормонов растений, расщепляя транспортные формы в виде р^-гликозидов [4] и обеспечивают химическую защиту растений от фитопатогеннов, освобождая активные агликоны [5]. P-Глюкозидазы могут локализоваться в различных компартментах растительной клетки [6,7]. Так, P-глюкозидазы расщепляющие салицин, которые обнаружены в листьях овса, присутствовали в основном во фракции клеточных стенок [8], в тоже время у других растений они могли быть локализованы в цитоплазме или в вакуоле, где находились расщепляемые ими гликозиды [9]. Показано, что активность в-глюкозидаз увеличивается в период роста растений, индуцированного ауксинами [8,10].

В последние годы были получены экспериментальные доказательства того, что в различных видах высших растений присутствуют как арил- в-глюкозидазы с широким спектром расщепляемых субстратов [11], так и высокоспецифичные в-глюкозидазы, действие которых направлено на гликозиды, которые присущи данному виду растений [12]. Так, в листьях и корневищах диоскореи был найден фермент олигофуростанозид-специфичная в-глюкозидаза, расщепляющий исключительно стероидные гликозиды фурастанового ряда, присутствующие в корневищах и листьях этого растения [5].

В проростках гороха нами была обнаружена в-глюкозидаза [13], расщепляющая специфический для этого растения изосукцинимид-в-гликозид (ИС- гликозид). Установлено, что предшественником агликона ИС-гликозида является циклическое производное у-аминомасляной кислоты [14]. В проростках гороха обнаружена как растворимая (цитоплазматическая) в-глюкозидаза, так и связанные с клеточной стенкой адсорбированная и ионно-связанные молекулярные формы фермента [15], расщепляющие ИС-гликозид с большей скоростью, чем другие арил- и алкил-в-О-глюкопиранозиды. Цитоплазматическая в-глюкозидаза гороха проявляла и трангликозидазную активность [16] подобно другим в- глюкозидазам [17] и на ее активность влияли факторы внешней среды (гипоксия). Исследовали активность в - глюкозидазы разной клеточной локализации в процессах прорастания и роста растений гороха. Одновременно анализировали содержание растворимых углеводов и специфического для этого растения ИС-гликозида, как субстрата, расщепляемого в- глюкозидазой.

Методика эксперимента

Растения гороха (Рамонский 77) выращивали методом гидропоники при температуре +250С и освещенности 1000 люкс/см-2 (12-час. фотопериод) до 27 дней или в условиях мелкоделяночно- го опыта до созревания семян. Для определения активности в-глюкозидазы навеску листьев или корней гомогенизировали с четырехкратным объемом среды выделения: 0.1 М фос фатно-цитратный буфер (pH 6.0) с 0.4 М сахарозой и 0.01 М фосфатом калия. Экстракт фильтровали и центрифугировали. В гомогенате определяли активность растворимой (цитоплазматической) в-глюкозидазы. Для определения активности связанных с клеточными стенками молекулярных форм в-глюкозидазы, осадок клеточных стенок отмывали буфером и получали адсорбированную форму в-глюкозидазы. После обработке раствором 1 М NaCl в 0.1 М фосфатно-цитратном буфере в течение 4-х часов при постоянном перемешивании получали фракции ионно-связанной с клеточными стенками форму в-глюкозидазы [13]. Активность в-глюкозидазы определяли с использованием глюкозооксидазного теста [15]. Инкубационная среда для цитоплазматической в-глюкозидазы содержала 0.1 тМ раствор ИС-гликозида в 0.1 М фосфатно-цитратного буфера (рН 5.2) и 0.1 мл ферментативной вытяжки. Для связанных с клеточными стенками молекулярных форм в-глюко- зидазы инкубационная среда, содержала 0.1 mM ИС-гликозида в 0.1 М фосфатно-цитратном буфере (pH 4.6-4.8) и 0.1 мл ферментативной вытяжки. Реакцию останавливали добавлением 0.5 мл

0. 2 М Na2CO3 [13]. Количество образовавшейся глюкозы определяли с использованием глюкозо-оксидазного теста ("GLUCOSE "E-D"Ј¬OLVEX DIAGNOSTICUM, Россия). Активность фермента рассчитывали в ФЕ на мг белка, количество которого определяли методом Lowry. В качестве субстрата использовали ИС-гликозид, который выделяли из спирторастворимой фракции проростков гороха с использованием метода препаративной бумажной хроматографии ранее отработанным методом [18].

Для определения содержания ИС-глюкозида и растворимых сахаров навеску растений (0.8-1.0 г) фиксировали десятикратным объемом 96% - этанола, нагретого до +60°С, экстрагировали спиртом и фильтровали. Спиртовой экстракт выпаривали (+60 °С), растворяли в 2 мл 10%-изопропанола и далее проводили разделение методом тонкослойной хроматографии на пластинках "SilufOl" ("Chemapol", Чехия). Локализацию углеводов определяли после проявления свидетелей универсальным проявителем (4% раствор дифениламина в этаноле), по величине Rf и поглощению в УФ. Количественное определение кетосахаров проводили резорциновым методом, а альдоз после проявления анилинфталатным реактивом. Содержание ИС-глюкозида и агликона определяли по поглощеию при 212 нм для гликозида и 208 нм для агликона на СФ-56 ("ЛОМО", Россия) [19]. Расчет содержания соединений проводили по калибровочным кривым и выражали в мг на 1 г сырой массы. горох глюкозидаза клеточный

Все определения проводили в двух биологических и двух аналитических повторностях. В таблицах представлены данные одного из типичных опытов в виде средних арифметических значений и их стандартных отклонений.

Обсуждение результатов

В результате проведенных исследований было показано (табл. 1), что при прорастании семян в надземной части 5-дневных проростков гороха активность всех молекулярных форм связанной с клеточной стенкой в - глюкозидазы была выше, чем цитоплазматической формы. Максимальная активность принадлежала ионно-связанной с клеточной стенкой форме в - глюкозидазы и составляла у 10-дневных растений 18.5 ФЕ мг-1 белка. Для адсорбированной на клеточной стенке молекулярной формы в-глюкозидазы она в этот период достигала величины 10.6 ФЕ мг-1 белка. Для цитоплазматической в-глюкозидазы удельная активность низкой и составляла 2.31 ФЕ мг-1 белка. Активность связанных с клеточной стенкой молекулярных форм в-глюкозидазы при росте проростка возрастала в 1.5-3 раза, но только до 10-дневного возраста, а затем начинала снижаться. К 16 дню роста проростка активность ионно-связанной с клеточной стенкой в-глюкозидазы составила только 32% от исходной и далее оставалась такой же низкой. В тоже время активность цитоплазматической в-глюкозидазы оставалась высокой до конца опыта и составляла 70% от исходной активности.

В процессе вегетационного периода при выращивании растений гороха в условиях мелкоде- ляночного опыта активность цитоплазматической в-глюкозидазы, начиная с 2-х недельного возраста и до периода формирования семян, значительно изменялась (табл.2). В сухих семенах активность в-глюкозидазы не обнаруживалась, хотя ее можно было определить в семенах на стадии молочной спелости на уровне 1.89±0.06 ФЕ мг-1 белка. Активность фермента в листьях 2-недельных проростков составляла 4.30±0.14 ФЕ мг-1 белка и оставалась достаточно высокой до цветения растений (фаза бутонизации). В то же время в цветах активность в-глюкозидазы отсутствовала. В корнях 2-недельных растений гороха активность в-глюкозидазы была в два раза ниже, чем в листьях проростков.

Одновременно провели изучение содержания специфического для растений гороха ИС - гликозида, расщепляемого в-глюкозидазой, и растворимых углеводов в ходе прорастания и роста растений гороха (табл.3). Как показали наши исследования, в сухих семенах и в семядолях ИС - гликозид и его агликон отсутствовали. Следовые количества их появлялись только на четвертый день, т.е. в момент появления корня. Наибольшее количество гликозида (до 5.76+0.06 мг г-1 сыр. массы) и его агликона (4.76+0.15 мг г-1 сыр. массы) были обнаружены в зеленых частях проростков гороха на 5 день прорастания. Содержание этих соединений было немногим меньше глюкозы и превышало уровень сахарозы. В корнях содержание агликона ИС-гликозида изменялось от

0. 84+0.07 до 0.46+0.02 мг г-1 сыр. массы.

Заключение