Галофильные микробные сообщества и их биоразнообразие в засушливых регионах Прикаспийской низменности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского научного центра РАН

ГАЛОФИЛЬНЫЕ МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА И ИХ БИОРАЗНООБРАЗИЕ В ЗАСУШЛИВЫХ РЕГИОНАХ ПРИКАСПИЙСКОЙ НИЗМЕННОСТИ

Э.А. Халилова, С.Ц. Котенко,

Э.А. Исламмагомедова, Р.З. Гасанов,

А.А. Абакарова, Д.А. Аливердиева

Аннотация

галофильный микробный засоленный прикаспийский

Проведены исследования пространственного распределения галофильных микробных сообществ засоленных почв и высокоминерализованных озер в засушливых регионах Прикаспийской низменности. Обнаружено, что основными компонентами микробной флоры Терско-Кумской и Терско-Сулакской провинций являются хемоорганогетеротрофные бактерии родов Virgibacillus, Bacillus, Halomonas и Salimicrobium из филумов Firmicutes и Proteobacteria. Штаммы демонстрировали способность к продуцированию каталазы, протеазы, амилазы и восприимчивость к 14 антибиотикам из групп фторхинолонов, цефалоспоринов, макролидов. Полученные данные представляют научный и практический интерес для изучения пространственного распределения галофильных бактерий в аридных условиях и их биотехнологической значимости.

Ключевые слова: микробное разнообразие, галофильные бактерии, экосистемы, засоленные почвы, высокоминерализованные озера, концентрация солей.

Основная часть

Изучение структуры галофильных микробных сообществ представляет интерес для фундаментальной микробиологии, в том числе эволюционной, так как многие обитающие в засушливых условиях микроорганизмы относятся к эволюционно древним ветвям бактерий и архей (Durvasul, Rao, 2018; Namita et al., 2018). Регион исследования является уникальной природной провинцией России с многообразием природных ландшафтов, обусловленных эрозионной деятельностью текучих вод, повторяющимися трансгрессиями и регрессиями Каспийского моря и засушливым климатом. Особый интерес представляют экосистемы Терско-Кумской и Терско- Сулакской низменности Западного Прикаспия, которые находятся под воздействием природных и антропогенных факторов со сформировавшимися микробиоценозами, близкими по своим показателям к классическим образцам полупустынь. Абразинно-аккумулятивные равнины с современными четвертичными песчаными отложениями изучаемых экосистем включают в себя гиперсоленые озера, эфемерные водоемы и засоленные почвы различного типа в качестве компонентов ландшафта. Широкий диапазон экстремофильных биотопов в единой географической зоне способствует созданию в регионе соответствующих условий для изучения биоразнообразия галофильных микроорганизмов.

Галофильные микроорганизмы являются объектом исследований многих ведущих лабораторий мира на протяжении последних 30 лет, однако разнообразие их в природе, экологическая роль и метаболизм изучены недостаточно. Большая заслуга в изучении природных микробных сообществ принадлежит российским ученым (Заварзин, 2004; Намсараев, 2018). Известны фундаментальные работы, посвященные генетическому разнообразию и структуре микробных сообществ засоленых почв (Plassart et al., 2019; Zhang et al., 2019) и соленых озер (Yang et al., 2017), где экстремофильные микроорганизмы могут рассматриваться как значимые компоненты биогеоценозов. Благодаря уникальному метаболизму галофильные микробы являются продуцентами ценных промышленно значимых ферментов, антибиотиков, могут участвовать в биоразложении нефти, обладают повышенной устойчивостью к загрязнению посторонней микрофлорой.

В рамках настоящего исследования изучено биоразнообразие и биотехнологический потенциал микробного компонента аридных биогеоценозов в засушливых регионах Терско-Кумской и Терско- Сулакской низменностей Западного Прикаспия.

Объекты и методы исследования

Исследовались бактерии, выделенные из соленых озер Берикейского (Дербентский район) и Тарумовского месторождений (Тарумовский район) и солончаков (Тарумовский район, Кочубейская биосферная станция Прикаспийского института биологических ресурсов ДНЦ РАН). Экспериментальные полигоны расположены в экстразасушливых условиях, где коэффициент увлажнения характеризуется величиной К<0.3.

В Терско-Кумской низменности распространены засоленные почвы и эфемерные водоемы, в том числе высокоминерализованное озеро Тарумовского месторождения. Образцы почвы типичного солончака (фото а) отобраны на юго-западе в 3 км от Кочубейской биосферной станции; образцы почвы из солончака коркового (фото б) и воды эфемерного водоема - в 40 км на север от Кочубея. По геологической структуре территория представляет Новокаспийские отложения, являясь частью Терско-Каспийской впадины (Быкова, 2003).

а) б)

Фото. Объекты исследования экстремофильных микроорганизмов: а) опустыненный ландшафт Терско-Кумской низменности, б) озеро Берикейского месторождения

Терско-Сулакская низменность представлена дельтовым и полупустынным ландшафтами, грунтовые воды минерализованы, почвы в различной степени засолены. Берикейское озеро расположено в центральной части Западного Прикаспия, имеет техногенное происхождение (фото б), здесь сосредоточено более 260 неуправляемых редкометальных газофлюидных грифонов с глубины 2473 м.

Подготовка образцов почвы, исследование солевого состава почв и инициация микробной сукцессии проводились согласно традиционно используемым методикам (Звягинцев, 1992). Физикохимические показатели воды определены стандартными методами (Государственный контроль..., 2003). Для выделения и дифференцированного учета галофильных бактерий использованы стандартные среды (Лалов и др., 1998; Кузнецов, Каленов, 2008).

Фенотипические свойства микроорганизмов: G+C, продуцирование ферментов каталазы, амилазы, протеазы, солеустойчивость, термотолерантность, восприимчивость к антибиотикам, проявляемые в засушливых климатических условиях, - изучены с использованием стандартных методов (Нетрусов и др., 2005; Хоулт и др., 1997).

Видовая идентификация микроорганизмов осуществлена сравнением полученных нуклеотидных последовательностей с данными, размещенными в генбанке NCBI (National Center..., 2018) и базе данных CBS (Westerdijk Fungal..., 2019). Выделение ДНК из образцов осуществлено модифицированным методом щелочного определения ДНК Бирнбойма-Доли (Birnboim, Doly, 1979) и Wizard-технологии фирмы Promega (США). Секвенирование продуктов амплификации проведено в Центре «Биоинженерии» РАН (Москва) по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977) на генетическом анализаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA). Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S РНК изучаемых штаммов проведен с помощью программного пакета BLAST (Van de Peer, 1994).

Результаты и их обсуждение

Для исследований выбраны биотопы единого региона: Терско-Кумский (солончаки типичные и корковые, природное соленое озеро) и Терско-Сулакский (техногенное соленое озеро), отличающиеся низким содержанием питательных веществ и высокими концентрациями тяжелых металлов. Из биотопов изолировано 10 видов галофильных бактерий, принадлежащих к филумам Firmicutes и Proteobacteria. В таксономическом отношении и степени приспособленности к засушливым условиям они представлены видами Virgibacillus salaries, V. marismortui, V. olivae, Bacillus cereus, B. clausii, B. pumilus, Halomonas ventosae, H. gomseomensis, H. elongata, Salimicrobium halophilum (табл. 1).

Таблица 1

Галофильные микроорганизмы, выделенные из степных и водных биогеоценозов аридных экосистем Западного Прикаспия

Представленные типичными солончаками, засоленные почвы Терско-Кумской низменности сложены легким и тяжелым суглинком, выделяются признаки оглеения. Распределение солей отмечается по всему профилю. Химизм засоления позволяет установить характерный для солончакового опустынивания хлоридно-сульфатно-натриевый тип засоления (табл. 2), обусловленный климатическими условиями и морским происхождением почвообразующих пород, тяготеющих к остепнению и аридизации (Залибеков, 2010). Солевому составу корковых солончаков (б) характерно гидроморфное сульфатно-хлоридно-натриевое засоление на тяжелосуглинистых древнеаллювиальных отложениях (табл. 2). Поверхностный слой сложен порошистой дефлируемой массой солевых скоплений.

Состав микробиоты солончаковых почв, характеризующихся воздействием климат ического режима и антропогенной нагрузки за счет высоких концентраций солей, представлен бактериями родов Salimicrobium, Bacillus и Halomonas (табл. 1). Из результатов исследований (табл. 1, 2) следует, что изолированные бактерии Bacillus clausii и B. pumilus приурочены к солончаку типичному с хлоридно-сульфатным и солончаку корковому с сульфатно-хлоридным типом засоления почвы. Отличительной особенностью солончака типичного является присутствие нитритрезистентного Halomonas elongate, для солончака коркового - хемоорганотрофа Salimicrobium halophilum.

По классификации химического состава воды высокоминерализованных озер Тарумовского и Берикейского месторождений их можно отнести к хлоридно-гидрокарбонатно-сульфатно-натриевым (табл. 3). По степени минерализации изучаемые водоемы относятся к категории рассолов; в водах преобладает кальциевая жесткость, которая может быть обусловлена растворением известняка и мела, разложением органических веществ. Озера аридной зоны, формирующиеся в условиях концентрирования солей за счет процессов испарения, богаты биогенными элементами Na, Ca, K, Mg, Sr, Li и анионами Cl^-, HCO^-3, SO^2-4, способными контролировать уровень биологической продуктивности микробных сообществ. В эту группу можно отнести кремниевую кислоту в качестве источника кремния и аммонийный азот в качестве источника азота (табл. 3).

Таблица 2

Результаты химического анализа водной вытяжки засоленных почв

Отличительной особенностью химического состава воды Берикейского озера по сравнению с Тарумовским является вдвое большее количество органических веществ, присутствие аммонийного азота, кремниевой и борной кислот, элементов Ba, Br, В, Fe, J, Rb, Cs, As, содержание которых может быть обусловлено геологическими показателями водовмещающих пород, сложенных песчаниками и мергелями.

Содержание микроорганизмов в водоемах аридных регионов коррелирует с макрокомпонентным составом воды, где микрофлора является индикатором их химического состава. Высокоминерализованное озеро Тарумовского месторождения - эфемерный биотоп с быстро меняющимися засушливыми условиями и лимитированным временем существования микроорганизмов. В таких водоемах видовой состав экстремофильных бактерий с определенными жизненными стратегиями специфичен.

По результатам молекулярно-генетического анализа микробов идентифицированы виды Bacillus cereus, Halomonas ventosae, H. gomseomensis, Virgibacillus olivae, V. salaries, V. marismortui. Причем галофильные грамотрицательные у-протеобактерии семейства Halomonadaceae, включая представителей родов Halomonas, были присущи только микробному сообществу Тарумовского озера, грамположительные бактерии Virgibacillus - Берикейского озера. Несмотря на то что бактерии Bacillus, обладая высоким биологическим потенциалом, присутствовали во всех образцах почвы и воды, главной средой их обитания являлась почва.

Сходство между бактериальными сообществами в большей степени может быть обусловлено экологическими факторами регионов (Fierer, Jackson, 2006; Lauber et al., 2009).

По результатам исследований обнаружена следующая закономерность: засоленные почвы и озера регионов по химическому составу имели тенденцию повышенного количества катионов Na⁺, Ca²⁺, K⁺, Mg²⁺ и анионов Cl^-, НСО3^-, SO4^2-, что может быть обусловлено формированием факторов почвообразования низменности в аридных условиях, напряженностью геохимических и биологических процессов. Можно полагать, к таким неисчерпаемым источникам элементов, участвующих в процессах соленакопления и седиментации, относятся древнекаспийские четвертичные засоленные породы, погребенные современными дельтовыми отложениями, подпор вод Каспийского моря, разложение богатых катионами растительных остатков галофитов, метаболизм бактерий-деструкторов органического вещества, сезонная миграционная способность и эоловый перенос веществ (Залибеков, 2000).

Таблица 3

Химический состав воды соленых озер Берикейского и Тарумовского месторождений, расположенных в засушливых регионах

Установлены фенотипические признаки новых видов галофильных бактерий (табл. 4) родов Bacillus, Virgibacillus и Halomonas: V. salaries, B. clausii, H. ventosae, V. marismortui, V. olivae, H. elongata, H. gomseomensis, S. halophilum. Более полная характеристика микробиологических свойств галофильных бактерий (Халилова и др., 2017) показала, что бактерии являлись спорообразующими, мезофильными и умеренно галофильными. Вместе с тем продемонстрирована характерная для промышленных штаммов потенциальная ферментативная активность, а именно: каталазная, протеазная и амилазная.

Таблица 4

Определение фенотипических свойств галофильных бактерий родов Virgibacillus, Bacillus, Halomonas и Salimicrobium

Примечания к таблице 4. Для исследований ферментативной активности: плюс - положительный, минус - отрицательный. Восприимчивость к антибиотикам: плюс - положительный, минус - отрицательный, плюс/минус - вариабельный признаки.

Результаты исследований показали, что почти все штаммы демонстрировали устойчивый рост к 5-25% NaCl, причем особую активность в присутствии 25% NaCl проявляли штаммы H. elongata и H. gomseomensis. Это является следствием особенностей генетического механизма бактерий, позволяющего увеличить толерантность к соли в экстремальных условиях засушливости. Штамм S. halophilum отличался ростом практически на всех средах с NaCl, образуя тонкую или плотную пленку роста. Наряду с этим, рост колоний B. dausii, H. ventosae и V. marismortui характерен в присутствии только низких показателей соли.

Микробы засушливой зоны могут изменяться не только под воздействием внешних условий, но и менять среду обитания в соответствии со своими особенностями, выделяя продукты обмена, которые изменяют химический состав, реакцию и соотношение различных веществ. Исследование восприимчивости галофильных бактерий к антибиотикам позволило расположить их по ряду патогенности, как генетическому признаку, в убывающей последовательности следующим образом: B. cereus > H. ventosae > H. elongata > V. olivae > V. marismortui > V. salaries > B. clausii > S. halophilum > B. pumilus > H. gomseomensis (табл. 4). Отмечена восприимчивость их, за исключением B. cereus, к триметоприму из группы сульфаниламидов. Средняя восприимчивость характерна для штаммов V. salaries, B. clausii к кларитромицину из группы макролидов и цефалоспоринам 2-го поколения (наряду с H. ventosae). Отрицательная - выявлена для B. clausii, V. salaries, V. olivae, H. ventosae, H. elongata к 3-му поколению цефалоспоринов; V. salaries, V. marismortui, V. olivae, S. halophilum - к 4-му поколению цефалоспоринов; B. clausii, V. marismortui, V. olivae, S. halophilum, H. gomseomensis - к клоритримазолу из группы производных имидазола; V. marismortui, V. olivae - к ампицилину из группы пенициллинов.

Заключение

В результате проведенных исследований микробной флоры засоленных почв и высокоминерализованных озер аридного региона Прикаспийской низменности представилась возможность определить пространственное распределение более 40 видов галофильных бактерий. Отмечено участие почвы в жизни элементарных единиц биогеоценозов, представляющих собой единство живых организмов и среды их обитания на небольших однородных территориях. В солончаках микробное сообщество угнетено, выявлено минимальное разнообразие галофильных микроорганизмов.

Основными представителями бактерий изучаемых регионов являлись штаммы родов Virgibacillus, Bacillus, Halomonas и Salimicrobium. Штаммы демонстрировали солетолерантность, способность к продуцированию каталазы, протеазы, амилазы; восприимчивость к 14 антибиотикам широкого антимикробного спектра из групп фторхинолонов, цефалоспоринов, сульфаниламидов и макролидов. Выявление доминантов уникальных галофильных микробных сообществ в Терско- Кумской и Терско-Сулакской провинциях является одним из репрезентативных показателей таксономической структуры микробных комплексов, тесно связанных с формированием аридных экосистем.

Общим для биотопов является влияние эрозии почв; трансгрессивной и регрессивной динамики Каспийского моря; засушливого климата. Благодаря адаптивной стратегии взаимодействия со средой, микробы, перемещаясь и колонизируя среду обитания в борьбе с другими видами, приобретают свойства, помогающие им выжить в засушливых условиях (Sriswasdi et al., 2017). Обнаружена также значительная корреляция между изолированными микробными сообществами и концентрациями элементов Na, K, Ca, Mg, Cl, Cu, Sr, SO4, Cl, HCO3, как одних из главных регуляторов микробиологической активности в почвах и озерах.

Засоленные почвы и водоемы Прикаспийской низменности представляют территориально изолированные друг от друга и различающихся по физико -химическим, геологическим и трофическим характеристикам биотопы, но олицетворяющие собой при этом единую сложную систему аридных биоценозов. Всестороннее изучение аборигенных микробных сообществ представляет научный и практический интерес в рамках изучения пространственного распределения микробов в различных биотопах отдельно взятой экосистемы; оценки их биоразнообразия и перспективы использования в биотехнологиях различного назначения.

Список литературы

1. Быкова Е.П. 2003. Эволюционные ряды почв и аппликации процессов почвообразования равнинного Дагестана в среднем и позднем голоцене // Роль почв в биосфере. Труды Института почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова и РАН. М.: Издательство Института почвоведения МГУ-РАН. Вып. 2. Географическое разнообразие почв. Почвы и биоты. С. 209-234.

2. Государственный контроль качества воды. Сборник государственных стандартов (Справочник технического комитета по стандартизации). 2003. Изд. 2, перераб. и доп. М.: Издательство стандартов. 775 с.

3. Заварзин Г.А. 2004. Изучение микробного разнообразия в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского // Микробиология. Т. 73. № 5. С. 598-612.

4. Залибеков З.Г. 2000. Процессы опустынивания и их влияние на почвенный покров. М.: Издательство РАН. 220 с.

5. Залибеков З.Г. 2010. Почвы Дагестана. Махачкала: Наука. 243 с.

6. Звягинцев Д.Г. 1992. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Издательство МГУ. 304 с. Кузнецов А.Е., Каленов С.В. 2008. Способ получения биомассы галобактерий. Патент РФ № 2323226. Лалов В.В., Осокина Н.В., Пиорунский Д.А., ЧижиковМ.А. 1998. Способ получения биомассы галобактерий. Патент РФ №. 2115722.

7. Намсараев З.Б. 2018. Микробные сообщества озер центральной Азии - индикаторы климатических и экологических изменений региона // Микробиология. Vol. 87. № 4. P. 393-396.

8. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. 2005. Практикум по микробиологии: учебное пособие для студентов высших учебных заведений. М.: Академия. 607 с.

9. Халилова Э.А., Котенко С.Ц., Исламмагомедова Э.А., Гасанов Р.З., Абакарова А.А., Аливердиева Д.А. 2017. Экстремофильные микробные сообщества засоленных почв и их разнообразие в регионах Прикаспийской низменности // Аридные экосистемы. Т. 23. № 71 (2). С. 116-120. [Khalilova E.A., Kotenko S.Ts., Islammagomedova E.A., Gasanov R.Z., Abakarova A.A., Aliverdieva D.A. 2017. Extremophilic microbial communities of saline soils and their diversity in the regions of the Caspian Depression // Arid Ecosystems. Vol 7. No. 2. P. 116-120.]

10. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П.Г.А., Стэйли Дж.Т., Уиллиамс С.Т. 1997. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 2. М.: Мир. 368 с. [Holt J.G., Krig N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T, Williams S.T. 1997. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. МMoscow: Міг. Vol. 2. 368 р. In russian.]

11. Birnboim H.C., Doly J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Research. Vol. 7. No. 6. P. 1513-1523.

12. Durvasula R. V., Rao D. V.S. 2018. Extremophiles: From Biology to Biotechnology. CRC Press. 437 p.

13. Fierer N., Jackson R.B. 2006. The diversity and biogeography of soil bacterial communities // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Vol. 103. P. 626-631.

14. Lauber CL, Hamady M, Knight R., Fierer N. 2009. Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale // Applied and Environmental Microbiology. Vol. 75. P. 5111-5120.

15. Namita S., Govinda C., Bhuvan V., Navanietha R., Rajesh K.S., Venkataramana G. 2018. Extremophiles for microbial-electrochemistry applications: A critical review // Bioresource technology. Vol. 255. P. 318-330.

16. National Center for Biotechnology Information. 2018 [Электронный ресурс www.ncbi.nlm.nih.gov (дата обращения 10.05.2018)].

17. Plassart P., Prevost-Boure N.C., Uroz S., Dequiedt S., Stone D., Creamer R., Griffiths R.I., Bailey M.J., RanjardL., Lemanceau P. 2019. Soil parameters, land use, and geographical distance drive soil bacterial communities along a European transect // Scientific Reports. Vol. 9. P. 605-622.

18. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Vol. 84. P. 5463-5467.

19. Sriswasdi S., Yang C., Iwasaki W. 2017. Generalist species drive microbial dispersion and evolution // Nature communications. Р. 1-8.

20. Van de Peer Y. 1994. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Computer Applications in the Biosciences. Vol. 10. P. 569-570.

21. Westerdijk Fungal Biodiversity Institute. 2019. [Электронный ресурс cbs.knaw.nl (дата обращения 11.04.2019)].

22. Yang J., Zhu T.F., Walker V.K., Hepburn H., Lui C., Zuber M.T., Ruvkun G., Carr C.E. 2017. Microbial diversity in a hypersaline sulfate lake: a terrestrial analog of ancient mars // Frontiers in microbiology. Vol. 8 (1). P. 1819-1831.

23. Zhang K., Shi Y., Cui X., Yue P., Li K., Liu X., Tripathi B.M., Haiyan C. 2019. Salinity Is a Key Determinant for Soil Microbial Communities in a Desert Ecosystem // Applied and Environmental Science. Vol. 4. No. 1. Р. 1-12.

Размещено на Allbest.ru