Сравнение серологических методов оценки серопревалентности T. gondii в популяциях европейской норки

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Сравнение серологических методов оценки серопревалентности T. gondii в популяциях европейской норки

Шамаев Н.Д.

ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Шамаев Н. Д., аспирант, ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».

Аннотация. В статье представлены данные по сравнению серологических методов оценки серопревалентности токсоплазмоза в популяции европейской норки (Mustela lutreola) отдельной зверофермы Республики Татарстан. Произведена оценка методов иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции латекс-агглютинации (РЛА) с использованием образцов сыворотки крови норок. Общая серопревалентность T. gondii среди норок в ходе использования двух методов составила 15,5 % (в диапазоне 7,37-21,56 % для 95 % CI). Высокий показатель линейной зависимости между техниками РЛА и ИФА (R2=0,826, P=0,001) показал достоверное сходство полученных результатов. РЛА и ИФА одинаково позволяют выявлять антитела к T. gondii у норок.

Ключевые слова: Toxoplasma gondii, Mustela lutreola, европейская норка, РЛА, ИФА, сравнительный анализ

COMPARISON OF SEROLOGICAL METHODS FOR ASSESSING T. GONDII SEROPREVALENCE IN POPULATIONS OF THE EUROPEAN MINK

Kazan Federal University, Shamaev N. D., Post-Graduate Student, Kazan Federal University.

Summary. The article presents data on the comparison of serological methods for assessing the seroprevalence of toxoplasmosis in the population of European mink (Mustela lutreola) of a separate fur farm in the Republic of Tatarstan. The methods of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and latex agglutination (LAT) were evaluated using blood serum samples from minks. The overall seroprevalence of T. gondii among minks using the two methods was 15.5 % (range 7.37-21.56 % for 95 % CI). A high indicator of the linear relationship between the techniques of RLA and ELISA (R2 = 0.826, P = 0.001) showed a significant similarity of the results. RLA and ELISA are equally capable of detecting antibodies to T. gondii in minks.

Key words: Toxoplasma gondii, Mustela lutreola, european mink, LAT, ELISA, comparative analysis

Введение

Toxoplasma gondii это паразитарный организм, проникающий и поражающий клетки хозяина. Вид относится к типу Споровики, классу Кокцидиеобразных, отряду Кокцидий [1]. Паразит вызывает инвазию, называемую токсоплазмозом. Это заболевание протекает бессимптомно у взрослых людей с развитым иммунитетом, но представляет серьезную опасность для беременных женщин, детей и лиц с иммунодепрессией.

Паразит имеет сложный биологический цикл, в котором задействовано более 350 видов позвоночных животных, являющихся промежуточными хозяевами, одними из них являются норки [6]. Эти животные представляет большой научный интерес в исследованиях, касающихся распространения T. gondii [5, 7]. Норок выращивают в неволе, то есть доступа к основным объектам окружающей среды, через которое происходит заражение, у животных нет [2]. Мониторинг специфических патогенов поможет оценить загрязнение окружающей среды и уровень риска у популяции норок к распространению паразитической протисты.

На сегодняшний день исследования способов распространения заболевания, вызываемого паразитом T. gondii, актуальны в связи с тем, что происходит возрастание удельного веса этой патологии во многих регионах и странах. Среди методов для скрининга заболевания в условиях лаборатории чаще всего используют такой серологический метод исследования, как иммуноферментный анализ (ИФА) [4]. Как наиболее быстрый и чувствительный метод выявления антител к микроорганизмам при проведении массовых обследований выделяют реакцию латекс-агглютинации (РЛА), используемую для определения титра антител у животных [3]. Но насколько эффективны оба метода для серологического анализа на T. gondii, остается невыясненным. Целью данной работы была сравнительная оценка серологических методов оценки серопревалентности РЛА и ИФА в популяции европейской норки (Mustela lutreola) отдельной зверофермы Республики Татарстан.

Материалы и методы

паразитический агглютинация патоген

Исследованию подверглась популяция норок зверосовхоза Республики Татарстан, основным видом деятельности которого является производство мехов. В хозяйстве также содержатся соболи и песцы. Поголовье норок составляет примерно 8000 голов. Для отбора проб использовали метод случайной выборки. Осенью 2018 было исследовано 100 проб методами ИФА и РЛА. Отбор крови у норок проводили путем сердечной пункции с использованием пробирок Improvacuter с активатором свертывания крови (“Guangzhou Improve Medical Instruments CO., LTD”, Китай) с последующим отделением сыворотки, которую хранили при -20°C до исследования.

Для определения титра специфических антител в сыворотке крови норок использовали серологический метод латекс-агглютинации. В работе использовали набор для постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА) Toxotest - MT (Eiken, Япония) с антигеном Toxoplasma gondii, иммобилизированным на полистироловых латексных бусинах. Постановку реакции осуществляли согласно инструкции производителя. Оценку результатов проводили визуально с использованием цифрового USB-микроскопа Digi Micro Prof. (DigiMicro, Китай) с программным обеспечением Micro Capture Pro Version 2.2. Для интерпретации РЛА результат реакции учитывался по 4 проявлениям агглютинации: 0 (небольшая четкая точка из бусин в центре лунки), 1 (бусины аккуратно лежат на дне лунки в виде круга), 2 (бусины беспорядочно разбросаны по всему дну лунки), 3 (бусины лежат на дне лунки несклеенными, разбросанными, в виде круга неправильной формы). Уровни 1-3 регистрировались как положительный результат для данного разведения сыворотки крови, а уровень 0 - как отрицательный.

Исследованные в реакции латекс-агглютинации сыворотки крови использовали для оптимизации внутреннего ИФА. Антиген разводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в концентрации 0,5 мкг на лунку. Иммобилизацию антигена на поверхность дна лунки планшета (Med Polymer, Россия) проводили при 4°C в течение 16-20 часов. Планшеты трехкратно отмывали ФСБ. Сыворотку норок в разведении 1:100 в ФСБ с 0,05 % Tween 20 (ФСБ-Т) вносили в лунки в объеме 100 мкл, инкубировали в течение 60 минут при 37°C. После инкубации пятикратно промывали ФСБ-Т. 100 мкл конъюгата Protein-A HRP (Sigma, USA) разведенный в ФСБ-Т (1:75,000) вносили в лунки планшет и инкубировали 30 минут при 37°C. Промывали ФСБ-Т пятикратно и вносили субстрат TMB Slow Kinetic (Sigma, USA) и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Останавливали реакцию внесением 100 мкл стоп-реагента (H2SO4). Регистрацию результатов реакции проводили на спектрофотометре при основной длине волны 450 нм и референсном фильтре 620 нм. Результат измерения оптической плотности (ОП) в ИФА считался положительным, когда значение было больше 0,200 [2].

Сравнительный анализ результатов РЛА и ИФА проводили с построением графика линейной зависимости с расчетом коэффициента детерминации R2, определением достоверности по значению p для коэффициента R2, с использованием Microsoft Excel 2018. Расчет 95 % доверительного интервала для значений превалентности T. gondii в популяции норок проводился с помощью онлайн- калькулятора Clinical Research Calculators: Clinical Calculator 1, доступного на сайте VassarStats: Website for Statistical Computation (http://vassarstats.net/).

Результаты исследований

Сыворотка крови норок была исследована в РЛА на наличие специфических антител к антигену T. gondii. В 8 из 100 образцов титр антител составил 1:32, в 3 из 100 образцов титр антител составил 1:64, в 1 из 100 титр антител составил 1:128, 3 из 100 образцов титр антител составил 1:256, в 1 из 100 образцов титр антител составил 1:512, в 2 из 100 образцов титр антител составил 1:1024. Общее количество серопозитивных норок в РЛА составило 18 %.

В ходе ИФА сывороток норок было обнаружено 3 из 100 образцов c ОП в диапазоне 0,574-0,826 оптических единиц (ОЕ), 3 из 100 образцов с ОЕ, в диапазоне 1,158-1,300 ОЕ, 4 из 100 образцов с ОП в диапазоне 1,4772,009 ОЕ. В ИФА было обнаружено 7 образцов из 100 c ОП в диапазоне 0,206-0,326 ОЕ. Общее количество серопозитивных норок в ИФА составило 13 %.

По результатам сравнительной оценки серопревалентности T. gondii в РЛА и ИФА оба метода применимы для исследования норок. Коэффициент детерминации, полученный при определении линейной зависимости РЛА и ИФА, составил выше 80 % (R2=0,826, P=0,001). На графике показана зависимость значений оптической плотности в реакции иммуноферментного анализа от распределения значений титров специфических антител к T. gondii в реакции латекс-агглютинации (Рис. 1).

Обсуждение результатов

Сравнительный анализ показал, что использование обоих методов допустимо для серологического анализа на токсоплазмоз среди норок. Результаты серологической реакции РЛА при низких титрах антител к T. gondii у норок были интерпретированы в ИФА как неспецифические, исходя из чего необходим детальный подход к использованию ИФА. При умеренном соотношении результатов серопревалентности между методами, каждый этап РЛА и ИФА возможно модифицировать при помощи сравнительного компонентного анализа для тестирования антител и антигенов, что повысит специфичность и чувствительность методов. Оба метода доступны для модификаций в компонентном составе, а также позволяют использовать неочищенный антиген [2, 4], что, по нашему мнению, позволит большему количеству образцов иметь достоверное пороговое значение серопозитивности.

Рис. 1. Распределение значений оптической плотности в реакции иммуноферментного анализа по титрам специфических антител к T. gondii в реакции латекс-агглютинации. На оси X показаны значения ОП в ИФА (ELISA). На оси Y показаны титры антител в РЛА (LAT), где 0 - отрицательный результат, 1 - титр 1:32, 2 - 1:64, 3 - 1:256, 4 - 1:512, 5 - 1:1024

Заключение

Проведена сравнительная оценка методов иммуноферментного анализа и реакции латекс-агглютинации с использованием образцов сыворотки крови норок. Общее количество серопозитивных норок в РЛА составило 18 %. Общее количество серопозитивных норок в ИФА составило 13 %. Общая серопревалентность T. gondii среди норок в ходе использования двух методов составила 15,5 % (в диапазоне 7,37-21,56 % для 95 % CI). Высокий показатель линейной зависимости между техниками РЛА и ИФА (R2=0,826, P=0,001) показал согласование между техниками для выявления реакции антиген-антитело для подсчета титра антител к T. gondii у норок. Применение обоих методов доступно для эпизоотологического контроля распространения токсоплазмоза.

Список литературы

1. Андреев В. П. Токсоплазмоз: этиология, эпидемиология, принципы диагностики / В. П. Андреев // Журнал ГрГМУ Беларусь. 2007. №3. С. 112-116.

2. Беспалова Н. С. Использование IMMUNOCOMB BIOGAL для экспресс-диагностики токсоплазмоза кошек / Н. С. Беспалова, С. С. Катков // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана. Казань. 2015. Т. 222(2). С. 24-27.

3. Бровкина А. Н. Разработка метода и тест-системы выявления бактерий рода salmonella на основе латекс- агглютинации. / А. Н. Бровкина // Научный журнал КубГАУ Краснодар. №72(08) 2011. С. 1-2.

4. Катков С. С. Клинические проявления токсо- плазмоза кошек в Воронежской области / С. С. Катков, Н. С. Беспалова // Инновационные технологии и технические средства для АПК : материалы Междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Воронежского ГАУ Воронеж. 2014. Ч. 2. С. 27-31.

5. Shamaev N. D. Prevalence and risk factors of Toxoplasma-like and intestinal parasites in cats from urbanized area of Tatarstan, Russia / N. D. Shamaev, A. Yu. Fedotova, A. V Galiullina, M. N. Mukminov, E. A. Shuralev // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 2018. Vol. 9, Iss. 6. P. 465-471.

6. Shamaev N. D. Seroprevalence and B1 gene genotyping of Toxoplasma gondii in farmed European mink in the Republic of Tatarstan, Russia / N. D. Sha- maev, E. A. Shuralev, S. V Petrov, G. G. Kazaryan, N. M. Aleksandrova, A. R. Valeeva, K. S. Khaertynov, M. N. Mukminov, K. Kitoh, Y. Takashima // Parasitology International. 2020. Vol. 76. Art. 102067. P. 1-5. DOI: 10.1016/j.parint.2020.102067

7. Shuralev E. A. Toxoplasma gondii seroprevalence in goats, cats and humans in Russia / E. A. Shuralev, N. D. Shamaev, M. N. Mukminov, K. Nagamune, Y. Taniguchi, T. Saito, K. Kitoh, M. I. Arleevskaya, A. Y. Fedotova, D. R. Abdulmanova, N. M. Aleksandrova, M. A. Efimova, A. I. Yarullin, A. R. Valeeva, K. S. Khaertynov, Y. Takashima // Parasitology International. 2018. Vol. 67, Is. 2. P. 112-114. DOI: 10.1016/j.parint.2017.10.014.

Размещено на Allbest.ru