Выделение активных компонентов из слизи кожи рыб разных видов и изучение их гемостатической активности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Статья по теме:

Выделение активных компонентов из слизи кожи рыб разных видов и изучение их гемостатической активности

ФГБОУВО «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия имени Н. В. Верещагина»

ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики лечения»

Фомина Любовь Леонидовна, к. б. н., доцент каф. внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства

КулаковаТатьянаСергеевна, к. с.-х. н., доценткаф. зоотехнииибиологии

Жунина Ольга Александровна, к. б. н., зав. отделом биотехнологических и доклинических исследований

Ошуркова Юлия Леонидовна, к. б. н., доцент каф. внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства

Вайцель Анастасия Эдуардовна, аспирант факультета ветеринарной медицины и биотехнологий

Аннотация

В работе приведены результаты оценки гемостатической активности слизи кожи рыб разных видов в отношении нативной крови овец, коров и собак. Установлено, что наиболее активна в гемостатическом отношении оказалась слизь африканского клариевого сома. Свертывание крови овец под ее воздействием происходило на 58 % быстрее, коров - на 62 % и собак на 76 % быстрее нативной. Заморозка и разведение слизи кожи рыб буферным раствором не повлияли на ее гемостатическую способность, а в некоторых случаях свертывающая способность слизи под влиянием этих факторов усилилась. Качественный анализ слизи кожи рыб дот-блот-иммуноанализом показал наличие в ней таких белков, как протромбопластин и тромбопластин - инициаторов свертывания крови, а электрофорез подтвердил наличие в слизи белков с массой, соответствующей этим белкам. Иммуноблоттинг образцов слизи кожи рыб показал, что большая концентрация тромбопластина (TF) содержится в слизи севрюги, а протромбопластина (F11) больше в слизи африканского клариевого сома.

Ключевые слова: рыбы, слизь, кровь, гемостаз, иммуноблоттинг, электрофорез

Summary

ISOLATION OF ACTIVE COMPONENTS FROM THE SKIN SLIME OF FISH OF DIFFERENT SPECIES AND STUDY OF THEIR HEMOSTATIC ACTIVITY

FSBEIHE “Vologda State Dairy Farming Academy named after N. V. Vereshchagin”

Russian Research Center for Molecular Diagnostics and Therapy, Public Company

Fomina Lyubov Leonidovna, PhD of Biology Science, Associate Professor of the Internal Non-communicable Diseases, SurgeryandObstetricsDept.

Kulakova Tatyana Sergeevna, PhD ofВgricultural Science, Associate Professor of the Zootechnics and Biology Dept.

Zhunina Olga Aleksandrovna, PhD of Biology Science, Head of Biotechnology and Preclinical Research Dept.

Oshurkova Yulia L., PhD in Biology Science, Associate Professor of the Internal Non-communicable Diseases, Surgery and Obstetrics Dept.

Vaytsel Anastasiya Eduardovna, Post-Graduate Student of the Faculty of Veterinary Medicine and Biotechnology.

The work presents the results of evaluating the hemostatic activity of the mucus of the skin offish of different species in relation to the native blood of sheep, cows and dogs. It was established that the most active in the hemostatic relation was the mucus of African clary catfish. Blood coagulation of sheep under its influence occurred 58 % faster, cows - 62 % and dogs 76 % faster than native. Freezing and breeding of fish skin mucus with a buffer solution did not affect its hemostatic ability, and in some cases, the coagulation ability of mucus increased under the influence of these factors. A qualitative analysis of the mucus of the skin offish by dot-blot immunoassays showed the presence ofproteins such as prothromboplastin and thromboplastin, the initiators of blood coagulation, and electrophoresis confirmed the presence of proteins with a mass corresponding to these proteins in the mucus. Immunoblotting offish skin mucus samples showed that a high concentration of thromboplastin (TF) was found in stellate mucus, and prothromboplastin (F11) was found in African mucous catfish mucus.

Keywords: fish, slime, blood, hemostasis, immunoblotting, electrophoresis

Введение

Сфера приложения биотехнологии и биотехнологических процессов c каждым годом расширяется: медицина и фармакология, сельское хозяйство, промышленность, охрана окружающей среды и др. Наиболее широко биотехнология применяется в трех отраслях народного хозяйства - медицине, сельском хозяйстве и промышленности [5]. В последние годы все чаще она начинает применяться для решения проблем аквакультуры [3].

В качестве основы биопрепаратов для разработки новых способов лечения все чаще используют слизь, вырабатываемую различными живыми организмами.

Исследование специалистов из Массачусетского технологического института показало, что слизь человека является не просто физическим барьером, который задерживает бактерии и вирусы, но она также может разоружать патогенные микроорганизмы и предотвращать их развитие. Дальнейшее направление их исследований связано с созданием искусственной слизи, которая может предложить новый способ лечения заболеваний [7].

Исследование, опубликованное в Британском журнале биомедицинских наук, показало, что белки, содержащиеся в вырабатываемой улитками слизи, могут привести к появлению нового противомикробного средства для глубоких ожоговых ран и аэрозоля для инфекций лёгких, наблюдаемых у пациентов с муковисцидозом [4].

Ученые из Американского химического общества (ACS) сделали заявление, что слизь рыбы является неиспользованным источником потенциальных новых антибиотиков. Подробности научной работы опубликованы в издании Eurekalert[8].

Кожу тилапии используют как в гуманной, так и в ветеринарной медицине для заживления ожоговых ран и регенерации кожи, так как коллаген тилапии практически не отторгается организмом млекопитающих, иммунитет не рассматривает его в качестве чужеродного агента [1].

Вследствие того, что рыбы обитают в водной среде, у них в процессе эволюции выработалось множество защитных механизмов. Известно, что слизь рыб обладает бактерицидными свойствами, а так как в водной среде процесс свертывания крови затруднен, возможно, слизь выполняет и гемостатическую функцию. В 1958 году советские ученые Б. А. Кудряшов, Г. В. Андреенко, П. Д. Улитина нашли, что слизь с кожи трески, даже разведенная в 10 раз, способна свертывать оксалатную плазму в течение 12-13 сек и предположили, что она является богатым источником протромбокиназы [2].

При этом результаты предыдущих собственных исследований демонстрируют потенциально высокую гемостатическую активность нативной слизи кожи рыб в отношении системы гемостаза млекопитающих в условиях invitro[6, 9].

Целью исследования было изучение системной гемостатической активности слизи кожи рыб, выделение и оценка гемостатических компонентов слизи кожи рыб разных видов.

Материалы и методы

Исследовательская работа проведена в два этапа:

этап включал оценку возможности применения слизи кожи рыб разных видов для активации свертывания крови млекопитающих invitro. Для исследования использовали слизь с кожи 12 экземпляров карпов (Cyprinuscarpiocarpio Linnaeus, 1758) и 9 экземпляров африканских клариевых сомов (Clariasgariepinus Burchell, 1822). Рыбы содержались в аквариумах и УЗВ, расположенных в АкваБиоЦентре ФГБОУ ВО Вологодская ГМХА. Слизь получали по методике Шультца и др. (Schultzet al., 2007), где слизь собиралась в полиэстеровые губки, нарезанные на кусочки 2х2х1 см. Влияние слизи на цельную кровь млекопитающих определяли следующим способом: на одно предметное стекло наносили автоматическим дозатором каплю нативной крови животных (овцы, коровы, собаки) в объеме 100 мкл, на второе предметное стекло - 50 мкл крови и 50 мкл слизи кожи рыб в свежем виде, после заморозки при температуре -20°С и разведенную фосфатно-солевым буфером, рН = 7.4 в соотношении 1:1. Каждые 30 сек. определяли, при осторожном наклоне стекла, образование плотного сгустка. Точность метода оценивалась на основании результатов повторных определений гемостатической активности слизи с одной и той же порцией крови донора.

этап состоял в определении наличия в слизи кожи рыб гемостатически активных белков - тромбопластина (фактор свертывания III, тканевой фактор, TF) и протром-бопластина (фактор свертывания XI, F11) методами дот-блота, электрофореза и иммуноблоттинга (вестерн-блота) с использованием поликлональных антител (АТ) кролика, специфичных к тромбопластину и протром-бопластину. Для исследования использовали слизь с кожи пяти экземпляров разных видов рыб: севрюги (AcipenserstellatusPallas, 1771), номера образцов слизи 11, 12, 13, 14, 15; белуги (HusohusoLinnaeus, 1758), номера образцов слизи 21, 22, 23, 24, 25; карпа (CyprinuscarpiocarpioLinnaeus, 1758), номера образцов слизи 31, 32, 33, 34, 35, выращенных в промышленных условиях в рыбоводческом хозяйстве ООО РТФ «Диана» Кадуйского района Вологодской области, и африканского клариевого сома (ClariasgariepinusBurchell, 1822), номера образцов слизи 41, 42, 43, 44, 45, выращенного в ООО «Аквакультура» Череповецкого района Вологодской области.

Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью программного пакета Statistica6.1. и с помощью программного пакета MicrosoftExcel. Значения полученных результатов в работе представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (M± m). Сравнение данных проводилось с применением U-критерия Манна - Уитни для независимых групп. Значение Pприняли равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Анализируя результаты предыдущего исследования гемостатической активности слизи кожи карпов, мы установили, что цельная кровь овец под ее воздействием сворачивается быстрее [6]. В данной работе мы сравнили время свертывания нативной крови разных видов животных (овец, коров, собак) при воздействии на нее слизи кожи карпов (CyprinuscarpiocarpioLinnaeus, 1758) и африканских клариевых сомов (ClariasgariepinusBurchell, 1822).

Результаты оценки влияния слизи кожи рыб разных видов на нативную кровь животных представлены в таблице 1.

Анализируя данные таблицы, можно отметить присутствие гемостатической активности слизи кожи рыб разных видов сопоставимой с коллагеном - сильнейшим активатором агрегации тромбоцитов млекопитающих. Наиболее активна в гемостатическом отношении оказалась слизь африканского клариевого сома (ClariasgariepinusBurchell, 1822). Свертывание крови овец под ее воздействием происходило на 58 % быстрее, чем нативной и на 12 % быстрее, чем при воздействии коллагена. Кровь коров и собак также сворачивалась при воздействии слизи кожи сомов - на 62 % и 76 % быстрее нативной соответственно. Можно отметить, что заморозка слизи и разведение буферным раствором не повлияли на ее гемостатическую способность, а в некоторых случаях свертывающая способность слизи под влиянием этих факторов усилилась.

Результаты исследования состава слизи кожи разных видов рыб с использованием поликлональных АТ кролика, специфичных к тромбопластину и протромбопластину, методом дот-блота представлены на рисунке 1.

Таблица 1 - Время свертывания крови животных под воздействием слизи кожи рыб разных видов

* - Различия с нативной кровью достоверны, (р<0,05)

Полученные данные свидетельствуют о том, что все исследуемые образцы слизи (даже при разведении в несколько раз) образовали иммунореплику с поликлональными АТ кролика, специфичными к тромбопластину и протромбопластину (отмечалось наличие бледно- или ярко-розовых точек (дотов) во всех квадратах, в которые вносили образцы слизи).

Результаты электрофоретического разделения белков, содержащихся в образцах слизи кожи рыб, представлены на рисунках 2, 3 и 4.

Рис. 1 - Результаты дот-блота. Нитроцеллюлозная мембрана (НЦ) с нанесенным TF: 1 - образец с шифром 11 - исходный, далее разведение в 2 раза; 2 - образец с шифром 21 - исходный, далее разведение в 2 раза; 3 - образец с шифром 31 - исходный, далее разведение в 2 раза; 4 - образец с шифром 41 - исходный, далее разведение в 2 раза; 5 - образцы (неразведен- ные) с шифра 12 по 45 по порядку сверху вниз НЦ. НЦ с нанесенным F11: 1 - образцы (неразведенные) с шифра 11 по 35 по порядку; 2 - образцы (неразве- денные) с шифра 41 по 45 (в повторе)

Рис. 2 - 1 - маркёры молекулярных масс (MW); 2 - образец 11; 3 - образец 12; 4 - образец 13; 5 - 14; 6 - образец 15; 7 - образец 21; 8 - образец 22; 9 - образец 23; 10 -

Рис. 3 - 1 - образец 31; 2 - образец 32; 3 - образец 33; 4 - образец 34; 5 - образец 35; 6 - маркёры молекулярных масс (MW); 7 - образец 24; 8 - образец 25; 9; 10

Рис. 4 - 1 -; 2 - образец 41; 3 - маркёры молекулярных масс (MW); 4 - образец 42; 5 - образец 43; 6 - образец 44; 7 - образец 45; 8 - образец 44 (повтор); 9 - образец 45 (повтор); 10

Рис. 5 - Иммуноблоттинг образцов слизи кожи рыб

Как видно из представленных на электрофореграммах данных, все исследуемые образцы слизи кожи рыб содержали сходный белковый состав, обладающий различными молекулярными массами (в диапазоне - более 116 кДа и менее 14.4 кДа). Однако, интенсивность окраски полос в образцах отличалась, что может быть связано с различным количественным содержанием белков в исследуемых образцах.

Как известно из литературных данных, искомые белки - тромбопластин и протромбопластин имеют молекулярные массы 33 и 29 кДа, соответственно.

На электрофореграммах имеются полосы, соответствующие указанным массам, которые, вероятно, могут соответствовать искомым в образцах белкам, в частности - практически во всех образцах отчетливо выражена белковая составляющая с массой в диапазоне 25-35 кДа, что может соответствовать массе как тромбопластина, так и протромбопластина.

Следующим этапом было постановка иммуноблоттинга образцов №№ 11, 21, 31 и 41.

Полученные результаты представлены на рисунке 5.

Данный вид анализа продемонстрировал наличие в исследуемых образцах слизи кожи рыб искомых белков - тромбопластина и протромбопластина, о чем можно судить по наличию иммунореплик с поликлональными АТ кролика, специфичными к тромбопластину и протромбопластину.

Иммунореплики имели вид полос от бледно до ярко-розового цвета, соответствующих молекулярным массам 33 и 29 кДа.

Однако, тромбопластин (TF) удалось детектировать только в образце № 11 (слизи севрюги (AcipenserstellatusPallas, 1771) что, вероятно, связано с его низкой концентрацией в остальных образцах.

Протромбопластин (F11) был идентифицирован в образцах №№ 11 и 41 (слизи севрюги (AcipenserstellatusPallas, 1771) и африканского клариевого сома (ClariasgariepinusBurchell, 1822) соответственно).

Таким образом, полученные результаты подтверждают наличие в составе слизи кожи рыб искомых белков, которые способны к иммобилизации на носителе (НЦ) с сохранением своих антигенных свойств.

Заключение

Наиболее активной в гемостатическом отношении, особенно при воздействии на кровь собак, оказалась слизь кожи африканского клариевого сома (ClariasgariepinusBurchell, 1822) Это, по-видимому, связано с тем, что у данного вида рыб отсутствует чешуя и защитные свойства слизи должны проявляться ярче.

Качественный анализ слизи кожи рыб дот-блот-иммуноанализом показал наличие в ней таких белков, как протромбопластин и тромбопластин - инициаторов свертывания крови, а электрофорез подтвердил наличие в слизи белков с массой соответствующей этим белкам. Иммуноблоттинг образцов слизи кожи рыб показал, что большая концентрация тромбопластина (TF) содержится в слизи севрюги (AcipenserstellatusPallas, 1771), а протромбопластина (F11) больше в слизи африканского клариевого сома (ClariasgariepinusBurchell, 1822), что делает данные виды рыб более предпочтительными продуцентами слизи как возможной основы гемостатического препарата.

Результаты проведённых исследований раскрывают потенциальную гемостатическую активность слизи кожи рыб и убеждают в необходимости дальнейшего изучения ее состава для создания на ее основе селективных корректоров системы гемостаза. Кроме этого, использование слизи в качестве основы гемостатического препарата актуально для развития ряда направлений биотехнологии: красной (применение биотехнологии в медицине), зеленой (процессы биотехнологии, применяемые в сельском хозяйстве) и синей (процессы биотехнологии, применяемые в аквакультуре), а возможность снижения количества отходов при выращивании рыбы в установках замкнутого водоснабжения внесет в охрану природы и окружающей среды существенный вклад. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Вологодской области в рамках научного проекта № 18-44-350002.

Список литературы

кожа рыба слизь белок

1. Кожу рыбы тилапии будут использовать для лечения ожогов. Режим доступа.

2. Кудряшов Б. А. Тромботропин и протромбоки- наза морских рыб / Б. А. Кудряшов, Г В. Андреенко, П. Д. Улитина // Докл. высш. школы, биол. науки. 1958. №3.

3. Рыбаков С. С. Курс лекций по основам биотехнологии. В 2 ч. Ч. 2. Применение биотехнологии / С. С. Рыбаков. Владимир: Изд-во Владим. гос. ун-та, 2010. 127 с.

4. Садовые улитки, возможно, дадут людям новый антибиотик. Режим доступа.

5. Учёные назвали точки роста рынка биотехнологий в России. Режим доступа.

6. Фомина Л. Л. Оценка гемостатической активности слизи кожи рыб invitro/ Л. Л. Фомина, Т С. Кулакова, О. А. Жунина, Ю. Л. Ошуркова, А. Е. Вайцель // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2018. № 4(40). С. 7-11.

7. Trafton А. Study reveals how mucus tames microbes // MIT News Office. October, 2019. Режимдоступа[URL]: http://news.mit.edu/2019/how-mucus- tames-microbes-1014.

8. Fish slime: An untapped source of potential new antibiotics. Режимдоступа[URL]: https://phys.org/ news/2019-03-fish-slime-untapped-source-potential. html.

9. Fomina L. L. Hemostatic activity of the м^шof the skin of fish / L. L. Fomina, T. S. Kulakova, O. A. Zhu- nina, Ju. L. Oshurkova, A. E. Vaytsel // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, November-December. 2018. RJPBCS. 9(6) Page No. 1130-1136.

Размещено на Allbest.ru