Образование и накопление компонентов катехиновой группы в микропобегах чая при осмотическом стрессе в условиях in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Образование и накопление компонентов катехиновой группы в микропобегах чая при осмотическом стрессе в условиях in vitro

Малюкова Л.С.¹, Самарина Л.С. ¹, Конинская Н.Г. ¹, Притула З.В. ¹,

Гвасалия М.В. ¹, Цюпко Т.Г.², Воронова О.Б. ²

¹ВНИИ цветоводства и субтропических культур

²Кубанский государственный университет

Аннотация

Изучено содержание и соотношение различных компонентов катехиновой группы (эпикатехин, галлокатехин, эпигаллокатехин, эпикатехингаллат, эпигаллокатехингаллат) в микропобегах чая (in vitro) при осмотическом стрессе, вызванном добавлением в питательную среду маннита, хлорида натрия и хлорида кальция в различных концентрациях. Установлено, что осмотический стресс индуцирует в них образование и накопление простых катехинов (эпикатехин, галлокатехин, эпигаллокатехин), при этом содержание галлированных катехинов (эпикатехингаллат, эпигаллокатехингаллат) снижается. Соотношение содержания простых катехинов к галлированным в оптимальных условиях было значительно ниже (0,7-1,6) в сравнении со стрессовыми условиями (2,2-3,7), вызванными добавлением в питательные среды осмотиков.

Ключевые слова: ЧАЙ, IN VITRO, ОСМОТИЧЕСКИЙ СТРЕСС, КАТЕХИНЫ, МАННИТ, ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА

Экологические стрессы, с которыми периодически сталкиваются растения, в том числе и чай, индуцируют накопление различных вторичных метаболитов, в частности, фенольных соединений. Предполагается, что эти вещества играют важную роль в адаптации растений к окружающей среде и в преодолении стрессовых условий, сформированных под влиянием высокой и низкой температуры, УФ-стресса, патогенной инфекции, засухи, засоления, минеральной недостаточности и других факторов [1-11]. Сообщается, что при засухе накапливаются различные соединения фенольной природы (флавоноиды, антоцианы, пигменты и другие), которые, обладая антиоксидантными свойствами, снижают осмотический и окислительный стрессы [1-7]. Растительные вторичные метаболиты также являются уникальными источниками для производства фармацевтических препаратов, пищевых добавок, ароматизаторов и других промышленно важных биохимических веществ [12-14]. При изучении образования и накопления биологически активных веществ наиболее эффективными инструментами являются технологии культивирования растительных клеток, тканей и микропобегов в условиях in vitro [14, 15]. Поэтому изучение физиолого-биохимических реакций растений на различные стрессы в условиях in vitro актуальны с точки зрения понимания адаптации растений к стрессам, поиска информативных индикаторов устойчивости растений, а также факторов, способствующих усилению индукции синтеза этих веществ.

В этой связи была поставлена цель: изучить особенности накопления катехинов в микропобегах чая в условиях in vitro при различной степени осмотического стресса, а также при увеличении концентрации кальция в питательной среде.

Объектом исследования являлись микропобеги чая в культуре in vitro, размноженные на модифицированной питательной среде MS с добавлением регуляторов роста БАП 6 мг/л, НУК 1 мг/л, ГК 2 мг/л [16]. Далее микропобеги пересаживали на питательные среды, в которые вносили различные осмотики и увеличивали концентрацию кальция. Базовой средой для этих экспериментов была 1/2 MS без добавления цитокининов и ауксинов. Первый опыт включал следующие варианты: контроль - среда без добавления осмотиков; варианты с добавлением в питательную среду маннита в концентрациях 36,4 г/л и 54,8 г/л, варианты с добавлением в питательную среду NaCl в концентрациях 2 г/л и 4 г/л. Во 2-ом опыте изучали влияние различных концентраций кальция на образование водорастворимых катехинов в микропобегах чая при осмотическом стрессе (маннит 40 г/л). Исследовали 3 варианта: контроль - CaCl₂ 440 мг/л и варианты с полуторным (CaCl₂ 660 мг/л) и двойным (CaCl₂ 880 мг/л) содержанием кальция в питательной среде. Экспланты культивировали в течение трех (1-й опыт) и двух (2-й опыт) месяцев на питательных средах, после чего определяли в них содержание катехинов (эпикатехина (Эк), галлокатехина (Гк), эпигаллокатехина (ЭГк), эпикатехингаллата (ЭКГ) и эпигаллокатехингаллата (ЭГКГ)). В опыте 1 определение этих органических веществ проводили методом ВЭЖХ на приборе Милихром (ЭкоНова, Новосибирск). Пробоподготовку осуществляли по следующему протоколу: 20 мг свежих листьев растирали в 1 мл 70% этанола, инкубировали 30 минут при 70^оС, центрифугировали 10 минут при 13 000 об/мин. Затем надосадочную жидкость фильтровали через мембрану с размером пор 40 мкм. Во втором опыте определение веществ катехиновой группы проводили методом МЭКХ (мицеллярная электрокинетическая хроматография), за основу была принята методика [17]. Экстракцию катехинов проводили горячей водой на водяной бане в течение 45 минут.

Исследования показали, что при культивировании микропобегов чая в оптимальных условиях (без добавления осмотиков) в составе катехиновой группы преобладали ЭГК и ЭГКГ, что характерно для чайного растения [18-20]. При этом соотношение между простыми (Эк +Гк+ЭГк) и галлированными (ЭКГ, ЭГКГ) катехинами было близко к единице. Известно, что при образовании катехинов вначале синтезируется простейшая катехиновая молекула (-) -эпикатехин, которая затем может либо гидроксилироваться (образование (-)-эпигаллокатехина), либо галлироваться (образование (-)-эпигаллокатехингаллата) [19]. При этом процессы галлирования протекают в чайном растении с меньшей скоростью, чем процессы гидроксилирования [19]. При индукции осмотического стресса in vitro в целом отмечено увеличение суммы катехинов и существенное изменение соотношения разных групп. Так, в микропобегах чая на питательной среде с маннитом 36,4 г/л отмечали достоверное увеличение содержания простых катехинов (рис. 1а), в меньшей степени, - галлированных катехинов, соотношение этих групп было выше 1.

а) б)

Рис. 1. Содержание катехинов (мг/г сырого вещества) в микропобегах чая в культуре катехиновый микропобег маннит стресс

in vitro при добавлении в среду различных концентраций маннита

При усилении осмотического стресса (маннит 54,6 г/л) отмечено более интенсивное образование простых катехинов при снижении доли (соотношение выше единицы) галлированных катехинов (рис. 1, б).

При индукции осмотического стресса посредством засоления (добавление в питательную среду хлорида натрия) регистрировались схожие закономерности. Так, при концентрации 2 г/л (средний стресс) не было выявлено существенного изменения содержания простых катехинов в сравнении с контролем, однако при этом отмечено снижение образования галлированных катехинов (рис. 2, б).

а) б)

Рис. 2. Содержание катехинов (мг/г сырого вещества) в листьях микропобегов чая в культуре in vitro при добавлении в среду различных концентраций хлорида натрия

Увеличение концентрации хлористого натрия в 2 раза в питательной среде сопровождалось усилением накопления как простых, так и галлированных катехинов в сравнении с контролем, однако их соотношение было в пользу простых катехинов. В целом следует отметить, что при осмотическом стрессе соотношение простых катехинов к галлированным существенно возрастало: от 0,7 на контроле до 1,7 и 2,2 (маннит и хлорид калия, соответственно), что свидетельствовало о снижении скорости синтеза галлированных катехинов.

При культивировании микропобегов чая во 2-ом опыте выявленные основные закономерности также подтверждались (рис. 3). Так, в контрольном образце (CaCl₂ 440 мг/л, без добавления маннита) соотношение простых и галлированных катехинов составляло 1,6. На фоне добавления маннита (осмотический стресс) отмечено существенное снижение содержания галлированных катехинов и рост их соотношения с простыми до 2,5. При увеличении концентрации кальция в питательной среде в 1,5 раза (без маннита) отмечено усиление накопления галлированных катехинов при стабильном содержании простых (соотношение простых к галлированным составило 1,3). При 2-кратном увеличении содержания кальция в питательной среде отмечено увеличение накопления простых катехинов (соотношение приближалось к 3) в сравнении с контролем (соотношение 1,6), что, по-видимому, являлось реакцией на химический состав среды.

Рис. 3. Содержание катехинов (мг/г абс. сух. в-ва) в листьях чая в культуре

in vitro при добавлении в среду различных концентраций хлорида кальция

При осмотическом стрессе (маннит 40 мг/л) для всех вариантов опыта (за исключением варианта с 2-кратным увеличением концентрации хлорида кальция) прослеживалась закономерность снижения содержания галлированных катехинов, соотношение их с простыми катехинами было в пределах 2,5-3,7.

Таким образом, установлено, что осмотический стресс, вызванный обезвоживанием или засолением, индуцирует в микропобегах чая в условиях in vitro, преимущественно, накопление простых и, в меньшей степени, галлированных катехинов. Соотношение содержания простых катехинов к галлированным в оптимальных условиях было значительно ниже (0,7-1,6) в сравнении со стрессовыми условиями (2,2-3,7), вызванными добавлением в питательные среды осмотиков.

Благодарности

Исследования выполнены за счет средств грантов Российского научного фонда №18-76-10001 (опыт 1), РФФИ и Администрации Краснодарского края № 19-416-230049 (опыт 2).

Список использованных источников

1. Larson R.A. The antioxidants of higher plants // Phytochemistry. - 1988; №27. - P. 969-978.

2. Anjum F., Yaseen M., Rasul E., Wahid A., Anjum S. Water stress in barley (Hordeum vulgare L.). II. Effect on chemical composition and chlorophyll contents // Pak J. Agric Sci. - 2003, №40. - P. 45-49.

3. Hernaendez I., Alegre L., Munne-Bosch S. Enhanced oxidation of flavan-3-ols and proanthocyanidin accumulation in water-stressed tea plants // Phytochemistry. - 2006; №67. - P. 1120-1126; PMID: 16712885.

4. Xu Z., Zhou G., Shimizu H. Plant responses to drought and rewatering // Plant Signal Behav. - 2010, № 5. - P. 649-654. PMID: 20404516. DOI: 10.4161/psb.5.6.11398.

5. Gosal S.S., Wani S.H., Kang M.S. Water and agricultural sustainability strategies. Kang MS, Ed. CRC Press. - 2010. - 259 p.

6. Akola R., Ravishankar G. A. Influence of abiotic stress signals on secondary metabolites in plants // Plant Signaling Behavior. - 2011, №6:11. - P. 1720-1731. DOI: 10.4161/psb.6.11.17613.

7. Muthukumarasamy M, Gupta SD, Pannerselvam R. Enhancement of peroxidase, polyphenol oxidase and superoxide dismutase activities by tridimefon in NaCl stressed Raphanus sativus L. // Biol. Plant. - 2000, № 43. - P. 317-320.

8. Притула З.В., Малюкова Л.С., Козлова Н.В. Особенности влияния комплекса экологических факторов на биохимические показатели качества чая сорта Колхида в условиях субтропиков России // Субтропическое и южное садоводство России. - 2009, вып. 42, т. 2. - Сочи. - С. 86-101.

9. Белоус О.Г. Биологические особенности культуры чая в условиях влажных субтропиков России: автореф. на соиск. ученой степ. д-ра. биол. наук. - Краснодар: КубГАУ. - 2009. - 24 с.

10. Притула З.В., Великий А.В., Малюкова Л.С. Влияние мезо- и микроудобрений на качество чайного сырья в условиях Черноморского побережья России // Плодоводство и ягодоводство России. - 2014, т. 38, вып. 2. - С. 52-58.

11. Малюкова Л.С., Притула З.В., Козлова Н.В., Керимзаде В.В., Великий А.В. О формировании устойчивости у растений чая Саmellia sinensis (L.) О. Kuntze при недостаточном водообеспечении на фоне корневого внесения кальция в виде природного удобрения // С.-х. биология. - 2016, том 51, № 5. - С. 673-679.

12. Gaurav N., Singh A.P., Srivastava A., Kumar A., Hira S.G. In vitro propagation of Withania somnifera l. (dunal) from callus of embryonic cotyledon explants in B5 medium // Indian Forester. - 2018, № 144 (1). - P. 36-40.

13. Gaurav N., Komal., Juyal P., Tyagi M., Chauhan N., . Kumar A. A review on in vitro propagation of medicinal plants // Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry. - 2018, №7 (6). - P. 2228-2231.

14. Karuppusamy S. A review on trends in production of secondary metabolites from higher plants by in vitro tissue, organ and cell cultures // J Med. Plants Res. - 2009, № 3. - P. 1222-1239.

15. Winkel-Shirley B. Flavonoid biosynthesis, а colorful model for genetics, biochemistry, cell biology and biotechnology // Plant Physiol. - 2001, №26. - P. 485-493. PMID:11402179. DOI: 10.1104/pp.126.2.485.

16. Гвасалия М.В. Клональное микроразмножение растений чая (Thea Sinensis l.) В культуре in vitro // Садоводство и виноградарство. - 2013, № 4. - С. 20-22.

17. Карцова Л.А., Алексеева А.В. Хроматографические и электрофоретические методы определения полифенольных соединений // Журнал аналитической химии. -2008, т. 63, № 11. - С. 1126-1136.

18. Джиджиешвили Г.А., Гугушвили Т.А., Хурцидзе Г.А., Цанава В.П. Фенольные соединения чайного сырья сорта Колхида // Субтропические культуры. - 1984, № 1. - С. 39-43.

19. Джавелидзе Ц.А. Результаты изучения фенольных соединений по элементам чайной флеши // Субтропические культуры. - 1978, № 2-3. - С. 209-211.

20. Малюкова Л.С., Цюпко Т.Г., Притула З.В., Воронова О.Б., Гущаева К.С., Великий А.В. Состав и содержание флавоноидов в готовом чае, выращенном в условиях Черноморского побережья Краснодарского края // Фенольные соединения: функциональная роль в растениях: сборник научных статей. - М.: ИФР РАН. - 2018. - С. 272-277. ISBN 978-5-6040654-5-7.

Цитирование:

Малюкова Л.С., Самарина Л.С., Конинская Н.Г., Притула З.В., Гвасалия М.В., Цюпко Т.Г., Воронова О.Б. Образование и накопление компонентов катехиновой группы в микропобегах чая при осмотическом стрессе в условиях in vitro // АгроЭкоИнфо. - 2019, №4. - http://agroecoinfo.narod.ru/journal/STATYI/2019/4/st_408.doc.

Размещено на Allbest.ru