Биосинтез поли(З-гидроксибутирата-со-З-гидроксивалерата) бактериями Cupriavidus necator B-10646, культивируемыми на смеси из олеиновой кислоты и предшественников 3-гидроксивалерата

Размещено на http://www.allbest.ru/

Институт биофизики СО РАН ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН»

Биосинтез поли(З-гидроксибутирата-со-З-гидроксивалерата) бактериями Cupriavidus necator B-10646, культивируемыми на смеси из олеиновой кислоты и предшественников 3-гидроксивалерата

Н.О. Жила

Г.С. Калачева

В.В. Фохт

С.С. Бубнова

Т.Г. Волова

Аннотация

Полигидроксиалканоаты (ПГА) привлекают большое внимание в качестве биоразлагаемой альтернативы синтетическим пластикам. Сополимер поли(3- гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) [П(3ГБ-со-3ГВ)] является одним из наиболее охарактеризованных сополимеров ПГА из-за его высокого коммерческого потенциала. Однако применение ПГА, и в частности П(3ГБ-со-3ГВ), ограничено их высокой ценой. Одним из подходов к снижению стоимости производства ПГА является использование недорогих источников углерода (жирных кислот, растительных масел и др.). Целью этой работы было исследование синтеза сополимера П(3ГБ-со-3ГВ) бактериями Cupriavidus necator B-10646, культивируемыми на олеиновой кислоте с разными биохимическими предшественниками 3ГВ. Бактерии выращивали в течение 72 ч в термостатируемом шейкере-инкубаторе при 30°C и 200 об/мин. В качестве предшественников 3ГВ использовали соли пропионовой или валериановой кислоты. Содержание и состав полимера определяли газовой хроматографией метиловых эфиров жирных кислот. Липиды и полимер экстрагировали из биомассы по методу Фолча. Добавление пропионата и валерата калия не ингибировало рост бактерий и синтез полимера. Урожай биомассы и содержание полимера составляло соответственно 9,3-9,5 г/л и 80-83 % от веса сухой биомассы. Использование валерата или пропионата калия привело к синтезу бактериями сополимера П(3ГБ-со-3ГВ) с включением 3ГВ соответственно 21,2 и 14,3 мол. %. Среднечисловая молекулярная масса (М_ч) полимера, синтезируемого бактериями при росте исключительно на олеиновой кислоте, составляла 220 кДа, полидисперсность полимера - 3,5. Полимер, синтезируемый в присутствии пропионата или валерата калия, характеризовался более низкой М_ч (156-178 кДа) и более высокой полидиперсностью (4,4-4,9). Основными жирными кислотами (ЖК) внутриклеточных липидов бактерий, культивируемых только на олеиновой кислоте, были олеиновая (33,26 % от суммы ЖК) и пальмитиновая кислоты (27,48 % от суммы ЖК). Добавление пропионата или валерата калия не привело к значительным изменениям в составе ЖК внутриклеточных липидов исследуемого штамма. Таким образом, показана способность C. necator B-10646 синтезировать П(3ГБ-со-3ГВ) при росте на смеси из олеиновой кислоты и предшественников 3ГВ. Полученные данные могут быть использованы для разработки и осуществления экономически обоснованного процесса производства П(3ГБ-со-3ГВ).

Ключевые слова: Cupriavidus necator, 3-гидроксивалерат, олеиновая кислота, молекулярная масса, жирные кислоты.

Abstract

Biosynthesis of Poly(3-Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator B-10646 from Mixtures of Oleic Acid and 3-Hydroxyvalerate Precursors.

Natalia O. Zhila, Galina S. Kalacheva, Viktoriya V. Fokht, Svetlana S. Bubnova and Tatiana G. Volova, Institute of Biophysics SB RAS FRC «Krasnoyarsk Science Center SB RAS».

Polyhydroxyalkanoates have attracted much attention as biodegradable alternative to petroleum-based synthetic plastics. Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) [P(3HB-co-3HV)] copolymer is one of the best characterized PHA copolymers because of its high commercial potential. However, commercial use of PHAs has been limited by their high price. One approach to reducing the cost of PHA production is to use inexpensive carbon sources (fatty acids, plant oils, etc.). The aim of this work was to study synthesis of P(3HB-co-3HV) by the Cupriavidus necator B-10646 bacterium grown on oleic acid and different biochemical precursors of 3HV. Bacterial cells were grown for 72 h at 30°C and 200 rpm on an incubator shaker. Salts of propionic or valeric acids were used as precursors of 3HV. The content and the composition of the polymer were determined by gas chromatography of fatty acid methyl esters. Lipids and polymer were extracted from biomass using the method of Folch. The addition of potassium propionate and valerate did not inhibit bacterial growth and polymer synthesis, the cell concentration and polymer content reaching 9.3-9.5 g/L and 80-83%, respectively. The addition of potassium valerate or propionate led to the synthesis of (P(3HB-co-3HV)) copolymer containing 21.2 and 14.3 mol% of 3HV, respectively. The number average molecular weight (Mn) of the polymer synthesized by the bacterium on oleic acid alone was 220 kDa; the polydispersity of the polymer was 3.5. The polymer synthesized in the presence of potassium valerate and propionate was characterized by a lower Mn (156-178 kDa) and a higher polydispersity of the polymer (4.4-4.9). The main fatty acids (FA) of intracellular lipids were oleic (33.26% of the total FA) and palmitic acid (27.48% of the total FA). The addition of potassium propionate or valerate did not cause any significant changes in the composition of the FA of intracellular lipids of the strain studied. This study demonstrates the ability of C. necator B-10646 to synthesize P(3HB-co-3HV) from mixtures of oleic acid and 3HV precursors. The data obtained can be used to develop and implement an economically feasible process of the P(3HB-co-3HV) production.

Keywords: Cupriavidus necator, 3-hydroxyvalerate, oleic acid, molecular weight, fatty acids.

Введение

Целью этой работы было исследование возможности Cupriavidus necator B-10646 синтезировать сополимер П(3ГБ-со-3ГВ) при выращивании бактерий на олеиновой кислоте с разными биохимическими предшественниками мономера 3ГВ.

Материалы и методы.

Бактерии C. necator B-10646 выращивали в периодическом двухстадийном режиме, разработанном ранее для синтеза ПГА. Для выращивания бактерий за основу была принята минеральная среда Шлегеля следующего состава:

Na₂HPO₄-H₂O-9,1;

KH₂PO₄-1,5;

MgSO₄-H₂O-0,2;

Fe₃C₆H₅O₇-H₂O-0,025;

NH₄CI-1,0 (г/л)

и раствор микроэлементов

H₃BO₃-0,288; CoCI₂-6H₂O-0,030;

CuSO4-5H2O-0,008;

MnCl₂-4H₂O-0,008;

ZnSO₄-7H₂O-0,176;

NaMoO₄-0,050; NiCl₂-0,008 (г/л)

Бактерии выращивали в стеклянных колбах объемом 1 л, заполненных культурой на 40 % от объема, на термостатируемом шейкере-инкубаторе Innova® серии 44 (New Brunswick Scientific, США) при 30 °C. В качестве углеродного субстрата использовали олеиновую кислоту (АО «ЭКОС-1», Россия; степень чистоты 98-99 %) в концентрации 10 г/л (контрольная культура). По мере исчерпания субстрата в течение культивирования делали добавки олеиновой кислоты в концентрации, аналогичной исходной. Для синтеза сополимеров с 3ГВ в культуру, растущую на олеиновой кислоте, на 48 ч культивирования добавляли валерат или пропионат калия в концентрации 1 г/л. Длительность культивирования составляла 72 ч. Все эксперименты проведены в трех повторностях.

Урожай биомассы клеток в ходе развития культуры бактерий регистрировали по весу сухого вещества и оптическим показателям культуры. Содержание олеиновой кислоты в среде находили после экстракции ее гексаном на хромато-масс-спектрометре Agilent Technologies 7890A/5975O (США). Содержание и состав полимера определяли хроматографией метиловых эфиров жирных кислот с применением хромато-масс-спектрометра AgilentTechnologies 7890A/5975С (США). Молекулярную массу и молекулярно-массовое распределение полимера исследовали с использованием гельпроникающей хроматографии (хроматограф Agilent Technologies 1260 Infinity (США)) относительно полистироловых стандартов (Fluka, Швейцария, Германия). Находили средневесовую (М_в) и среднечисловую (М_ч) молекулярную массу, а также полидисперсность (ПД = М_в/М_ч). полигидроксиалканоат бактерия олеиновая кислота

Липиды и полимер экстрагировали из биомассы смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Фолча, предварительно отмывая биомассу от олеиновой кислоты кратковременной обработкой гексаном. В конечном экстракте полимер отделяли от липидов осаждением при добавлении двойного объема гексана. Далее проводили метанолиз для получения метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) путем добавления смеси метанола и серной кислоты (50:1 по объему) в течение 2 ч. при 90 °C. Анализ МЭЖК осуществляли на хромато-масс-спектрометре GC-MS 7890/5975C (Agilent Technologies, США). Условия анализа: газ-носитель - гелий, скорость 1 мл/мин; колонка HP-FFAP - 30 м, 0,25 мм, температура ввода пробы 220 °C; начальная температура хроматографирования 120 °C; подъем температуры до 230 °C со скоростью 5 мл/мин, изотермальный режим 5 мин и последующий подъем температуры до 310 °C со скоростью 10 /мин, изотермальный режим 2 мин; температура детектора 230 °C; температура источника ионов 150 °C; электронный удар при 70 eV; определение фрагментов с атомными массами от 30 до 550 amu при 0,5 с/скан. Идентификацию ЖК проводили по масс-спектрам и сравнением их времен удерживания с таковыми имеющихся стандартов (Serva, Германия; Sigma, США).

Результаты и обсуждение

Добавление солей органических кислот в исследуемой концентрации, валерата или пропионата калия (1 г/л), не ингибировало рост бактерий C. necator B-10646 и синтез полимера по сравнению с контрольным вариантом без добавления биохимических предшественников. Через 72 ч культивирования урожай биомассы бактерий составлял 9,3-9,5 г/л, содержание полимера - 80-83 % от веса сухой биомассы (табл. 1), что сопоставимо с данными, полученными при культивировании исследуемого штамма на сахарах (Zhila et al., 2015). Marangoni et al. (2000) установили, что использование олеиновой кислоты в качестве дополнительного субстрата (основной субстрат - глюкоза) приводило к увеличению продукции ПГА. Предполагается, что присутствие олеиновой кислоты усиливает работу ферментной системы синтеза ПГА из-за наличия двойной связи при С9 (Ramachandran et al., 2011). В результате 0-окисления олеиновой кислоты увеличивается внутриклеточный пул ацетил-СоА и часть этого пула используется в качестве субстрата для биосинтеза ПГА. Кроме того, из-за окисления формируется дополнительный пул НАДФН (Lee, 1996). Увеличение продукции ПГА показано у Aeromonas hydrophilia, Cupriavidus necator и рекомбинантного штамма Escherichia coli XY1-BluepSYI105, выращиваемых на олеиновой кислоте (Loo et al., 2005).

В составе полимера, синтезируемого C. necator B-10646 при росте на олеиновой кислоте, помимо 3-гидроксибутирата, являющегося доминирующим мономером (97,5 мол. %), идентифицированы в небольших количествах и другие мономеры, а именно 3-гидроксивалерат (2,0 мол. %) и 3-гидроксигексаноат (0,5 мол. %) (табл. 1). Следует отметить, что при росте на сахарах включение этих мономеров в полимер происходит только при наличии соответствующих прекурсоров (Volova et al., 2014; 2016). Появление 3-гидроксивалерата и 3-гидроксигексаноата также наблюдали в составе полимера, синтезируемого Alcaligenes sp. NCIMNo 5085, выращенного на олеиновой кислоте (Srivastava, Tripathi, 2013). Кроме того, интересно отметить, что при росте на олеиновой кислоте - субстрате, содержащем четное количество атомов углерода, в составе полимера идентифицирован мономер с нечетным количеством атомов углерода (3ГВ). Появление мономеров с нечетным количеством атомов углерода (3-гидроксигептаноата) показано также для Pseudomonas putida Bet001, выращенного на олеиновой кислоте (Gumel et al., 2012).

Таблица 1. Показатели культуры бактерий Cupriavidus eutrophus B-10646, культивируемых на олеиновой кислоте в присутствии предшественников синтеза 3ГВ

Table 1. Culture parameters of the Cupriavidus necator B-10646 bacterium grown on oleic acid and 3HV precursors

Примечание: а-в - буквами показаны различия между средними.

Добавление валерата калия в культуру бактерий C. necator B-10646 привело к увеличению содержания 3ГВ в полимере до 21,2 мол. %. Добавление пропионата калия также привело к включению мономеров 3-гидроксивалерата в полимер, однако содержание 3ГВ было несколько ниже (14,3 мол. %) (табл. 1). Аналогичную ситуацию наблюдали Bhubalan et al. (2008), в работе которых показано более эффективное превращение валерата натрия в 3ГВ по сравнению с пропионатом натрия. Кроме того, в работе Doi et al. (1990) показано, что при использовании валериановой кислоты в качестве единственного источника углерода содержание мономеров 3ГВ было в 2 раза выше, чем при культивировании на пропионовой кислоте.

М_ч и М_в полимера, синтезируемого бактериями при росте на олеиновой кислоте, составляли соответственно 220 и 775 кДа, полидисперсность полимера - 3,5 (табл. 1). При добавлении индукторов синтеза 3ГВ произошло достоверное снижение Мч до 156-178 кДа, что сопровождалось увеличением полидисперсности полимера до 4,4-4,9. Снижение М_ч сополимеров с 3ГВ также наблюдали Chanprateep, Kulpreecha (2006).

Содержание и процентный состав жирных кислот (ЖК), входящих в состав цитоплазматической мембраны бактерий, выращенных на олеиновой кислоте без добавления индукторов, а также с добавлением валерата и пропионата калия, приведены в табл. 2. Состав ЖК внутриклеточных липидов был исследован у бактерий в конце культивирования, в условиях максимальной аккумуляции полимера.

Таблица 2. Содержание жирных кислот внутриклеточных липидов бактерий Cupriavidus necator B-10646 при росте на олеиновой кислоте в присутствии солей валериановой и пропионовой кислот ( % от суммы ЖК, средние ± стандартные ошибки)

Table 2. The fatty acid content of intracellular lipids of bacterium Cupriavidus necator B-10646 grown on oleic acid in the presence of salts of valeric and propionic acids (% of the total FA, average values ± standard errors)

Примечание: * - циклопропановая кислота; ^бнасыщ. - насыщенные жирные кислоты, включающие циклопропановую кислоту и OH-кислоты; ненасыщ. - ненасыщенные жирные кислоты.

В составе ЖК внутриклеточных липидов бактерий, выращенных на олеиновой кислоте, идентифицированы насыщенные и моноеновые ЖК с длиной цепи от 12 до 20 атомов углерода. Основными ЖК были олеиновая (33,26 % от суммы ЖК) и пальмитиновая кислоты (27,48 % от суммы ЖК). ЖК, содержание которых превышало 1 % от суммы, представлены как насыщенными (миристиновая, 14:0; стеариновая, 18:0), так и моноеновыми (пальмитолеиновая, 16:10)7 и цис-вакценовая, 18:1о7) кислотами. Содержание циклопропановых кислот С-17:0 и С-19:0 составляло 7,54 % от суммы ЖК, что в несколько раз ниже, чем при культивировании исследуемого штамма на сахарах (Zhila et al., 2015). Кроме того, как было показано нами ранее, уровень циклопропановых кислот в липидах бактерий, выращиваемых на олеиновой кислоте, практически не менялся в ходе культивирования бактерий, тогда как при культивировании на сахарах отмечены значительные изменения уровня циклопропановых кислот (Zhila et al., 2015). Добавление пропионата или валерата калия в культуральную среду не привело к значительным изменениям в составе ЖК внутриклеточных липидов. Как и при выращивании C. necator B-10646 только на олеиновой кислоте, основными ЖК внутриклеточных липидов бактерий были олеиновая (31,24-33,96 мол. %) и пальмитиновая (28,0428,92 мол. %) кислоты.

Заключение

Исследован рост C. necator B-10646 и синтез полимера при выращивании бактерий на среде, содержащей олеиновую кислоту и субстраты - предшественники синтеза 3ГВ (пропионат и валерат калия). Бактерии синтезировали сополимер П(3ГБ-со-3ГВ) с включением 3ГВ в долях 21,2 и 14,3 мол. % при использовании соответственно валерата и пропионата калия. Полимер, синтезируемый в присутствии предшественников синтеза 3ГВ, характеризовался более низкой М_ч и высокой полидисперсностью по сравнению с полимером, полученным в отсутствие прекурсоров. Наличие предшественников синтеза 3ГВ не повлияло на состав ЖК экстрагируемых липидов бактерий. В результате выполненных исследований олеиновая кислота может рассматриваться в качестве перспективного основного субстрата для роста бактерий C. necator B-10646 и синтеза сополимеров с 3ГВ.

Список литературы / References

1. Ahn W.S., Park S.J., Lee S.Y. (2001) Production of poly(3-hydroxybutyrate)from whey by cell recycle fed-batch culture of recombinant Escherichia coli. Biotechnology Letters, 23(3): 235-240

2. Akiyama M., Tsuge T., Doi Y. (2003) Environmental life cycle comparison ofpolyhydroxyalkanoates produced from renewable carbon resources by bacterial fermentation. Polymer Degradation and Stability, 80(1): 183-194

3. Berezina N., Yada B. (2016) Improvement of the poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) production by dual feeding with levulinic acid and sodium propionate in Cupriavidus necator. New Biotechnology, 33(1): 231-236

4. Bhubalan K., Lee W.H., Loo C.Y., Yamamoto T., Tsuge T., Doi Y., Sudesh K. (2008) Controlled biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3- hydroxyhexanoate) from mixtures of palm kernel oil and 3HV-precursors. Polymer Degradation and Stability, 93(1): 17-23

5. Chanprateep S., Kulpreecha S. (2006) Production and characterization of biodegradable terpolymer poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) by Alcaligenes sp. A-04. Journal of Bioscience and Bioengineering, 101(1): 51-56

6. Chee J.-Y., Tan Y., Samian M.-R., Sudesh K. (2010) Isolation and characterization of a Burkholderia sp. USM (JCM15050) capable of producing polyhydroxyalkanoate (PHA) from triglycerides, fatty acids and glycerols. Journal of Polymers and the Environment, 18(4): 584-592

7. Chen C.W., Don T.M., Yen H.F. (2006) Enzymatic extruded starch as a carbon source for the production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Haloferax mediterranei. Process Biochemistry, 41(11): 2289-2296

8. Choi J.I., Lee S.Y. (1999) High-level production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 65(10): 4363-4368

9. Doi Y., Segawa A., Nakamura S., Kunioka M. (1990) Production of biodegradable copolyesters by Alcaligenes eutrophus. Novel biodegradable microbial polymers. Dawes E.A. (ed.) The Netherlands, Kluwer Academic Publishers, p. 37-48

10. Fukui T., Doi Y. (1998) Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plant oils by Alcaligenes eutrophus and its recombinant strain. Applied Microbiology and Biotechnology, 49(3): 333-336

11. Gumel A.M., Annuar M.S.M., Heidelberg T. (2012) Biosynthesis and characterization of polyhydroxyalkanoates copolymers produced by Pseudomonas putida Bet001 isolated from palm oil mill effluent. PLOS ONE, 7(9): e45214

12. Holmes P.A. (1985) Applications of PHB - a microbially produced biodegradable thermoplastic. Physics in Technology, 16(1): 32-36

13. Kahar P., Tsuge T., Taguchi K., Doi Y. (2004) High yield production of polyhydroxyalkanoates from soybean oil by Ralstonia eutropha and its recombinant strain. Polymer Degradation and Stability, 83(1): 79-86

14. Lee S.Y. (1996) Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnology and Bioengineering, 49(1): 1-14

15. Lee W.-H., Loo C.-Y., Nomura C.T., Sudesh K. (2008) Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate copolymers from mixtures of plant oils and 3-hydroxyvalerate precursors. Bioresource Technology, 99(15): 6844-6851

16. Loo C.Y., Sudesh K. (2007) Polyhydroxyalkanoates: bio-based microbial plastics and their properties. Malaysian Polymer Journal, 2(2): 31-57

17. Loo C.Y., Lee W.H., Tsuge T., Doi Y., Sudesh K. (2005) Biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) from palm oil products in a Wautersia eutropha mutant. Biotechnology Letters, 27(18): 1405-1410

18. Lopez-Cuellar M.R., Alba-Flores J., Rodriguez J.N.G., Perez-Guevara F. (2011) Production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) with canola oil as carbon source. International Journal of Biological Macromolecules, 48(1): 74-80

19. Luzier W.D. (1992) Materials derived from biomass/biodegradable materials. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89(3): 839-842

20. Marangoni C., Furigo A., de Aragao G.M.F. (2000) Oleic acid improves poly(3-hydroxybutyrate- co-3-hydroxyvalerate) production by Ralstonia eutropha in inverted sugar and propionic acid. Biotechnology Letters, 22(20): 1635-1638

21. Oliveira F.C., Dias M.L., Castilho L.R., Freire D.M.G. (2007) Characterization of poly(3- hydroxybutyrate) produced by Cupriavidus necator in solid-state fermentation. Bioresource Technology, 98(3): 633-638

22. Ramachandran H., Iqbal N.M., Sipaut C.S., Abdullah A.A. (2011) Biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) terpolymer with various monomer compositions by Cupriavidus sp. USMAA2-4. Applied Biochemistry and Biotechnology, 164(6): 867-877

23. Riedel S.L., Jahns S., Koenig S., Bock M.C.E., Brigham C.J., Bader J., Stahl U. (2015) Polyhydroxyalkanoates production with Ralstonia eutropha from low quality waste animal fats. Journal of Biotechnology, 214: 119-127

24. Shantini K., Bhubalan K., Yahya A.R.M., Amirul A.A. (2013) Productivity increment of biodegradable and biorenewable copolymer containing 3-hydroxyvalerate monomer initiated by alcohols as precursor substrates. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 88(7): 13641370

25. Solaiman D.K.Y., Ashby R.D., Foglia T.A., Marmer W.N. (2006) Conversion of agricultural feedstock and coproducts into poly(hydroxyalkanoates). Applied Microbiology and Biotechnology, 71(6): 783-789

26. Srivastava S.K., Tripathi A.D. (2013) Effect of saturated and unsaturated fatty acid supplementation on bio-plastic production under submerged fermentation. 3 Biotech, 3(5): 389-397

27. Steinbuchel A. (2001) Perspective for biotechnological production and utilization of biopolymers: metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate biosynthesis pathways as a successful example. Macromolecular Bioscience, 1(1): 1-24

28. Sudesh K., Bhubalan K., Chuah J.-A., Kek Y.-K., Kamilah H., Sridewi N., Lee Y.-F. (2011) Synthesis of polyhydroxyalkanoate from palm oil and some new applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 89(5): 1373-1386

29. Volova T., Kiselev E., Vinogradova O., Nikolaeva E., Chistyakov A., Sukovatiy A., Shishatskaya E. (2014) A glucose-utilizing strain, Cupriavidus euthrophus B-10646: growth kinetics, characterization and synthesis of multicomponent PHAs. PLOS ONE, 9(2): e87551

30. Volova T.G., Syrvacheva D.A., Zhila N.O., Sukovatiy A.G. (2016) Synthesis of P(3HB-co-3HHx) copolymers containing high molar fraction of 3 -hydroxyhexanoate monomer by Cupriavidus eutrophus B10646. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 91(2): 416-425

31. Yu H.Y., Qin Z.Y. (2014) Surface grafting of cellulose nanocrystals with poly(3-hydroxybutyrate- co-3-hydroxyvalerate). Carbohydrate Polymers, 101: 471-478

32. Zhila N., Kalacheva G., Volova T. (2015) Fatty acid composition and polyhydroxyalkanoates production by Cupriavidus eutrophus B-10646 cells grown on different carbon sources. Process Biochemistry, 50(1): 69-78

Размещено на Allbest.ru