Таксономические взаимоотношения двух видов рода Leymus Hochst. на основе ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таксономические взаимоотношения двух видов рода Leymus Hochst на основе ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) анализа

кандидат биологических наук,

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН

Мезина Наталья Сергеевна аспирант,

Биологический институт Томского государственного университета

Агафонов Александр Викторович

доктор биологических наук,

Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН

Изучались филогенетические взаимосвязи двух видов рода Leymus: L. secalinus (Georgi) Tzvel и L. Littoralis (Griseb.) Peschkova методом молекулярно-генетического анализа при помощи ISSR-праймеров.

Результаты исследований выявили обособленность L. secalinusи ограниченность распространения вида северным побережьем озера Байкал. Также подтверждено мнение Г. А. Пешковой, что вид является эндемиком побережий оз. Байкал. Ареал вида L. littoralisболее обширен, не ограничивается территорией Восточной Сибири России и охватывает территории Внутренней Монголии Китая, Монголию.

Ключевые слова: вид, L. secalinus, L. littoralis, ISSR, ISSR-праймеры, полиморфизм, дендрограмма, ареал.

TAXONOMIC RELATIONSHIPS OF TWO SPECIES OF THE GENUS LEYMUS HOCHST. ON THE BASIS OF ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEATS) ANALYSIS

Mezina Natalia Sergeevna

Agafonov Alexader Victorovich

Phylogenetic relationships between two species of the genus Leymus: L. secalinus(Geor- gi) Tzvel and L. littoralis(Griseb.) Peschkova were studied by molecular genetic analysis using ISSR primers. The results of the studies revealed the isolation of the L. secalinus species, and that the distribution of the species is limited to the northern coast of Lake Baikal. Also confirmed the view of G. A. Peshkova, that the species of L. secalinusis endemic to the shores of Lake Baikal. The range of L. littoralisis more extensive and not limited to the territory of Eastern Siberia of Russia, and covers the territory of Inner Mongolia of China, Mongolia.

Keywords: species, L. secalinus, L. littoralis, ISSR, ISSR-primers, polymorphism, dendrogram, areal.

Введение

В молекулярно-генетическом исследовании использован метод ISSR (InterSimpleSequenceRepeats) для первичного скрининга генома. Метод ISSR, сравнивающий межмикросателлитные повторы последовательностей нуклеотидов, позволяет выявить генетическое разнообразие на видовом и популяционном уровне и широко используется для этих целей. Результаты анализа используются для выявления родственных отношений внутри и между таксонами, решения филогеографических вопросов.

Виды L. secalinusи L. littoralisотносят в полиморфный род Leymus(Hцchst.), содержащим много гибридогенных видов.

Оба вида являются многолетними, длиннокорневищными и ветроопыляемыми злакам. Систематика двух таксонов весьма запутанна и до сих пор существует неясность в современной таксономии видов, их объеме и распространении.

Объект и методы исследований

Материал для исследований был собран авторами в семи популяциях этих двух видов: 1) Китай, Внутренняя Монголия -- L.sec.Ch; 2) Монголия -- L.sec.Mn; 3) Россия, Бурятия, дол. р. Селенга -- L.lit.BD; 4) Россия, Бурятия, окр. г. Улан-Удэ, Тулунжа -- L.lit.BT; 5) Россия, Бурятия, г. Улан-Удэ -- L.lit.BU; 6) Россия, Бурятия, Давша (берег оз. Байкал) -- L.sec.BB; 7) Россия, Бурятия, перешеек п-ва Святой Нос (берег оз. Байкал) -- L.sec.BP.

Для популяционного ISSR (InterSimpleSequenceRepeats) анализа были выделены ДНК из 48 высушенных в силикагеле образцов двух видов из 7 популяций с использованием кита «Diamond» (Россия, Барнаул) в соответствии с инструкцией производителя. Ваучерные гербарные образцы хранятся в гербарии UUH. Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл при ISSR-анализе содержала: 1 ед. Tag-полимеразы («Синтол»), 2.5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР («Синтол»), 20 пМ праймера, 2.5 мМ Mg²+, 0.25 мМ dNTP, 2 мкл геномной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере BioRad T100 (США) для ISSR-анализа по следующей программе: предварительная денатурация 94°С, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек; t° отжига, 10 сек; 72°С, 10 сек; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек; t° отжига, 5 сек; 72°С, 5 с. Последний цикл элонгации -- 2 мин при 72°С. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировала от 42 до 56°С.

Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле в ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для определения длин фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярной массы 1 kb DNA Ladder(«Fermentas»).

На основе трех электрофореграмм (гелей) составили бинарную матрицу по присутствию и отсутствию компонента (ампликонов) для каждого из изученных образцов. Дендрограммы выполняли с использованием коэффициента «Манхэттен расстояний» (Manhattan distance) полной связи в программе STATISTICA.

Результаты и обсуждение исследований

История изучения L. secalinusи L. littoralis

Впервые L. secalinus(Georgi) Tzvel. описан И. И. Георги в 1775 г. как Triti- cumsecalinumGeorgiна основании долиннеевского описания и изображения вида по сборам Стеллера с песчаных берегов Байкала и с о. Ольхон, которые были опубликованы И. Г. Гмелиным в 1 т. «Flora Sibirica» [Gmelin, 1747, табл. 25]. Годом позже, в 1776 г., Паллас назвал это же растение, по тому же описанию и изображению Гмелина -- Triticum littoralePall. Типом же T. littoralePall. является тот же рисунок И. Г. Гмелина. Е. Г. Бобров [1960] отмечает, что название, данное

И. И. Георги, является приоритетным. Здесь же Е. Г. Бобров указывает, что Ле- дебур в 1853 г. во «Flora Rossica» упоминает оба названных биноминала, и именно того растения, о котором шла речь у Стеллера, Гмелина, Георги и Палласа, которое квалифицировалось в качестве особой разновидности колосняка пушистоколосого -- Elymus dasystachysЯ littoralisGriseb.ex Ledeb. Названный вид был установлен К. Триниусом в 1829 г. во «Flora Altaica» [Ledebour, 1829] с солонцов Чуи. Последующие исследователи -- П. Н. Крылов, С. А. Невский, М. Г. Попов пренебрегли разновидностью Гризебаха и отнесли прибайкальское растение к виду, описанному Триниусом -- Elymus dasystachys Trin. При этом Е. Г. Бобров указывает, что данный вид, по-видимому, состоит из разных рас, одной из которых является раса, населяющая пески Прибайкалья, и высказывает предположение, что изменчивость этого колосняка связана с изменениями характера его местообитания, т.е. является экологической. Кроме того, он разграничил эти виды, восстановив приоритетное название, предложенное в 1775 г. И. И. Георги -- «secalinus»,и предложил свою трактовку вида -- Elymus secalinus(Georgi) Bobr., типом которого являлся все тот же рисунок И. Г. Гмелина в «Сибирской флоре» и классическое местонахождение вида -- о. Ольхон и пески юго-западного побережья Байкала. Типом ElymusdasystachysTrin. являются растения из Чуйской долины Алтая. По Е. Г. Боброву, ареал Elymussecalinus(Georgi) Bobr., если понимать его узко -- пески Прибайкалья; ареал вида в широком понимании охватывает горные области Южной Сибири и Прибайкалья, Восточного Казахстана, Киргизии и Восточного Таджикистана, Джунгарии и Монголии.

Н. Н. Цвелев указывает, что L. secalinusявляется очень полиморфным видом, распадающимся на несколько разновидностей, заслуживающих ранга подвидов. В своих обработках рода [Цвелев, 1968, 1976] он выделяет: L. secalinussubsp. secalinus(Georgi) Tzvel., L. secalinussubsp. mongolicus(Meld.) Tzvel., L. secalinussubsp. pubescens(O. Fedtsch.) Tzvel., L. secalinussubsp. ovatus(Trin.) Tzvel. Здесьжеонуказывает, чтотипыElymus dasystachys(«Altai, in argilloso-salsis ad Tschuja, 1826, leg. Bunge» -- LE) иE. littoralis(«In arenosis ad Baikalem prope Possolskoi, 1829, Turczaninow» -- LE) являются вполне типичными экземплярами L. Secalinuss u bsp. Secalinus и что тип E. Littoralis (имеющий 3 изотипа) может быть избран в качестве неотипа Triticum secalinum. К числу синонимов L. secalinusН. Н. Цвелев относит T. littoralePall. иElymus dasystachysTrin. [Цвелев, 1968, 1976].

Г.А. Пешкова [1987], исследовав образцы L. secalinuss.str. с классического местонахождения (E. littoralis)в окр. с. Посольск на юго-восточном побережье Байкала, выделила из L. secalinus(Georgi) Tzvel. L. littoralis(Griseb.) Peschkova. По мнению Г. А. Пешковой, распространение L. secalinuss.str. ограничено северным побережьем Байкала и о. Ольхон; южнее -- на побережьях Байкала и в островных степях Предбайкалья, Забайкалья, Якутии, Северной Монголии -- произрастает другой вид L. littoralis(Griseb.) Peschkova [Пешкова, 1990].

В новейших работах, в синопсисе рода Leymus, Йен с соавторами[Yen at al., 2009], рассматривают L. littoralis(Griseb.) Peschkova в качестве синонима L. secalinus(Georgi) Tzvel., с широким ареалом, охватывающим юго-восточные провинции Китая, Восточный Казахстан, Японию, Монголию, Восточную Сибирь России. Н. Н. Цвелев и Н. С. Пробатова [2010] при таксономической ревизии этого же рода принимают самостоятельность вида L. littoralis(Griseb.) Peschkova, ареал которого охватывает Восточную Сибирь, а вне России -- Монголию. РанееН. Н. Цвелев [1968, 1976] включалElymus dasystachysvar. littoralisGriseb.; E. littoralis(Griseb.) Turcz. exSteud.) в L. secalinussubsp. secalinus(Georgi) Tzvel. и считал его широко распространенным видом в пустынной и степной частях Азиатского материка.

Результаты аналитических исследований

Для исследования было подобрано семь ISSR праймеров: Pr HB-14; Pr HB-12; Pr 17898B; Pr 17899A; Pr 17899B; 814; 844A c температурами отжига от 42 до 56°С. Проведены ПЦР реакции (амплификация) образцов с ISSR праймерами и получено семь гелей, из которых только три были наиболее информативными. На рисунке 1 представлен гель-электрофорез с праймера 17898В. Проведен анализ полиморфизма 42 ISSR-локусов у двух видов Leymusс трех электрофореграмм.

Рис. 1. Гель-электрофорез: ISSR вариабельность с праймера 17898B

у 48 образцоввидовL. secalinus, L. littoralis. Треки № 1, 33, 51 -- молекулярный маркер (1500-100 п.н.). Треки № 2-11 -- L. secalinus (Китай); № 12-21 -- L. secalinus (Монголия, L.secMn); № 22-32 -- L.littoralis (дол. р. Селенга - L.lit.BD); № 34-38 -- L.littoralis (окр. г. Улан-Удэ, Тулунжа -- L.lit.BT); № 39-42 -- L.littoralis (окр. г. Улан-Удэ, L.lit.BU);

№ 43-47, 50 -- L. secalinus (Давша, берег оз. Байкал, L.sec.BB); № 48-49 -- L. secalinus (перешеек п-ва Святой Нос, берег оз. Байкал, L.sec.BP)

На дендрограмме дерево разделилось на две крупные клады (рис. 2). L. secalinusс берегов оз. Байкал образовал отдельную кладу, что указывает на его обособленность.

L. littoralisиз Бурятии и L. secalinusс Монголии и Китая образовали одну большую кладу, но которая распадается на несколько субклад по географическому распространению. То что L. littoralisиз Бурятии и L. secalinusиз Монголии и Китая образовали единую кладу, указывает на их близкое родство и что это, возможно, один вид. Из этого следует, что название таксона -- L. secalinus(Georgi) Tzvel. относится только к байкальским популяциям, а китайские и монгольские следует отнести к L. littoralis(Griseb.) Peschkova.

Наши исследования подтверждают мнение Г. А. Пешковой (1987), что распространение L. secalinusограничено северным побережьем оз. Байкал и вид является эндемиком его побережий, южнее -- на побережьях Байкала и в островных степях Предбайкалья Бурятии и Якутии произрастает L. littoralis.Результаты изучения подтвердили ранее проведенные исследования, основанные на сравнении отсеквенированных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1-5.8S-ITS2 ядерной ДНК, и показали, что ареал вида L. littoralis более обширен и охватывает Восточную Сибирь России, Внутреннюю Монголию Китая и Монголию.

CompleteLinkageCity-block (Manhattan) distances

Рис. 2. Дендрограмма, построенная на основе матрицы генетических расстояний между популяциями двух видов L. secalinusи L. littoralis

Заключение

В результате молекулярно-генетического анализа методом ISSRполучены данные о филогенетических взаимосвязях двух видов рода Leymus: L. secalinusи L. littoralis, выявлена обособленность L. secalinusи ограниченность распространения вида северным побережьем оз. Байкал. Подтверждены данные Г. А. Пешковой, что вид является эндемиком побережий оз. Байкал. Ареал вида Llittoralis более обширен и охватывает Восточную Сибирь России, Внутреннюю Монголию Китая и Монголию.

Работа выполнена в рамках бюджетных проектов СО РАН № VI.52.1.7 (№ гос. регистрации 0337-2016-0001), РФФИ: № 11-04-00861, № 16-04-01605

Литература

злак l. secalinus l. littoralis issr праймер

1Бобров Е. Г. Забытые виды И. И. Георги из «Байкальской флоры» // Бот. мат. герб. бот. ин-та АН СССР. 1960. Т. XX. С. 1-22.

2ПешковаГ. А. ОLeymus secalinuss. l. (Georgi) Tzvel. (Poaceae) // Новости систематики высших растений: сборник научных трудов. Т. 24. Л.: Наука, 1987. С. 21-26.

3Пешкова Г. А. Род Колосняк -- Leymus // Флора Сибири. Т. 2: Poaceae. Новосибирск: Наука, 1990. С. 41-52.

4Цвелев Н. Н. Злаки // Растения Центральной Азии. Вып. 4. Л.: Наука, 1968. 246 с.

5Цвелев Н. Н. Злаки СССР. Л.: Наука, 1976. 788 с

6Цвелев Н. Н., Пробатова Н. С. Роды ElymusL., ElytrigiaDesv., AgropyronGaerth., Psathyros- tachysNevskiLeymusHochst. (Poaceae: Triticeae) во флоре России / Комаровские чтения. Вып. 57. Дальнаука, 2010. С. 5-102.

7Gmelin I. G. Flora sibirica. T. 1. Petropoli, 1747. 247 p.

8Ledebour C. F. Flora Altaica. Т. 1. Berolini, 1829. 440 p.

9Yen C., J.-L. Yang, B. R. Baum Synopsis of Leymus Hochst. (Triticeae: Poaceae) // Journal of Sys- tematics and Evolution. 2009. Vol. 47(1). P. 67-86.

References

1Bobrov E. G. Zabytye vidy I. I. Georgi iz «Bajkal'skoj flory»[Forgotten species Georgi from the «Baikal Flora»] // Bot. Mat. Gerb. Bot. In-ta AN SSSR. 1960. T. XX. pp.1-22.

2Peshkova G. A. About of the Leymus secalinuss.l. (Georgi) Tzvel. (Poaceae) // Novosti sist. vyssh. rast.: sb. nauch. tr. T. 24. L.: Nauka, 1987. pp. 21-26.

3Peshkova G. A. Genus Kolosnjak - Leymus// Flora Sibiri[Flora Sibirica]. T. 2: Poaceae. Novosibirsk: Nauka, 1990. pp. 41-53.

4Tzvelev N. N. Zlaki // Rastenija Central'noj Azii[Plants of Central Asia] Vyp. 4. L.: Nauka, 1968. 246 p.

5Tzvelev N. N. Zlaki SSSR[Poacea of the USSR]. L.: Nauka, 1976. 788 p.

6Tzvelev N. N., Probatova N. S. Genus of Elymus L., Elytrigia Desv., Agropyron Gaerth., Psathyros- tachys Nevski, Leymus Hochst. (Poaceae: Triticeae) vo flore Rossii[Genus of Elymus L., Elytrigia Desv., Agropyron Gaerth., Psathyrostachys Nevski, Leymus Hochst. (Poaceae: Triticeae) in the Flora of Russia] / Komarovskie chtenija. Vyp. 57. Dal'nauka, 2010. pp. 5-102.

7Gmelin I. G. Flora sibirica. T. 1. Petropoli, 1747. 247 p.

8Ledebour C. F. Flora Altaica. Т. 1. Berolini, 1829. 440 p.

9Yen C., J.-L. Yang, B. R. Baum Synopsis of LeymusHochst. (Triticeae: Poaceae) // Journal of Sys- tematics and Evolution. 2009. Vol. 47(1). pp. 67-86.

Размещено на Allbest.ru