Влияние экзогенного мелатонина на показатели поведения и оксидативного стресса в головном мозге стареющих мышей с экспериментальными моделями патологии нервной системы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное учреждение «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины»

Влияние экзогенного мелатонина на показатели поведения и оксидативного стресса в головном мозге стареющих мышей с экспериментальными моделями патологии нервной системы

Лабунец И.Ф., Утко Н.А.,

Пантелеймонова Т.Н., Бутенко Г.М.

г. Киев

Резюме

мышь оксидативный стресс мозг

Актуальность. Существует связь нарушений функционирования нервной системы с развитием оксидативного стресса при болезни Паркинсона и рассеянном склерозе. Показано влияние возраста на развитие этих патологий и антиоксидантные свойства гормона мелатонина. Цель: исследовать эффект введения мелатонина на поведение, факторы оксидативного стресса и антиоксидантной защиты головного мозга стареющих мышей с экспериментальными моделями паркинсонизма и демиелинизации. Материалы и методы. Мыши линии 129^л> в возрасте 15--16мес. получали нейротоксины 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) в дозе 30 мг/кг 1 раз или купризон ежедневно с пищей в течение трех недель. Мелатонин вводили в дозе 1 мг/кг ежедневно в 18:00 с 7-8-го дня действия токсинов. Оценивали содержание малонового диальдегида (МДА), активность антиоксидантных ферментов в головном мозге, а также показатели поведения в тестах «открытое поле», на ригидность и в ротарод-тесте. Результаты. Двигательная, эмоциональная и исследовательская активность мышей с моделями паркинсонизма и демиелинизации ниже, чем у интактных мышей. Мышечный тонус снижается под действием купризона; после инъекции МФТП тонус растет, а длина шага уменьшается. Под влиянием мелатонина у мышей с паркинсонизмом повышается число квадратов, длина шага и снижается время удержания на валу; у мышей с купризоновой диетой повышается число квадратов, стоек и болюсов. В головном мозге экзогенный мелатонин снижает повышенное под действием нейротоксинов содержание МДА и увеличивает сниженную активность супероксиддисмутазы и каталазы при паркинсонизме, каталазы и глутатионпероксидазы при демиелинизации. Выводы. Положительное влияние мелатонина на поведение стареющих мышей с МФТП-моделью паркинсонизма и купризоновой моделью демиелинизации опосредовано усилением антиоксидантной защиты головного мозга.

Ключевые слова: нейротоксины МФТП и купризон; паркинсонизм; демиелинизация; мелатонин; старение, малоновый диальдегид и антиоксидантные ферменты головного мозга; поведенческие реакции

Abstract

F. Labunets, N.A. Utko, T.N. Panteleymonova, G.M. Butenko

State Institute of Genetic and Regenerative Medicine of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine

The effect of exogenous melatonin on behavior and oxidative stress indicators in the brain of aging mice with experimental models of nervous system pathology

Background. There is a connection between impaired functioning of the nervous system and oxidative stress in Parkinson's disease and multiple sclerosis. The influence of age on the development of these pathologies was shown, as well as the antioxidant properties of the hormone melatonin. The purpose was to investigate the effect of melatonin administration on the behavior, factors of oxidative stress and antioxidant protection in the brain of aging mice with experimental models of parkinsonism and demyelination. Materials and methods. 129/Sv mice aged 15--16 months received neurotoxins 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) at a dose of 30 mg/kg once, or cuprizone daily with food for 3 weeks. Melatonin was administered at a dose of 1 mg/kg daily at 6 p.m. starting from day 7--8 of toxin exposure. The content of malondialdehyde, the activity of antioxidant enzymes in the brain and behavior parameters were assessed in the open field tests for rigidity and in the rotarod test. Results. The locomotor, emotional and exploratory activities in mice with parkinsonism and demyelination models are lower than those in intact animals. Muscle tone decreases under the influence of cuprizone and increases after MPTP injection; the step length decreases in parkinsonism. Melatonin treatment resulted in increasing the number of squares, step length, and decreasing the retention time on a rotating cylinder in mice with parkinsonism and increasing the number of squares, rearing and number of boluses in cuprizone-treated mice. Exogenous melatonin reduces the level of brain malondialdehyde increased by neurotoxins and increases the reduced activity of superoxide dismutase and catalase in mice with parkinsonism, catalase and glutathione peroxidase in mice with demyelination. Conclusions. The positive effects of melatonin on the behavior of aging mice with the MPTP parkinsonism model and the cuprizone model of demyelination are mediated by increased antioxidant protection in the brain. Keywords: neurotoxins MPTP and cuprizone; parkinsonism; demyelination; melatonin; aging, malondialdehyde and antioxidant enzymes in the brain; behavioral reactions

Анотація

Лабунець І.Ф., Утко Н.О., Пантелеймонова Т.М., Бутенко Г.М. Державна установа «Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України», м. Київ, Україна

Вплив екзогенного мелатоніну на показники поведінки і оксидативного стресу в головному мозку старіючих мишей з експериментальними моделями патології нервової системи

Резюме. Актуальність. Відомий зв'язок порушень функціонування нервової системи з розвитком оксидативного стресу при хворобі Паркінсона та розсіянному склерозі. Показано вплив віку на розвиток цих патологій, а також антиоксидантні властивості гормону мелатоніну. Мета: дослідити ефект введення мелатоніну на поведінку, фактори оксидативного стресу та антиоксидантного захисту головного мозку старіючих мишей з експериментальними моделями паркінсонізму і демієлінізації. Матеріали та методи. Миші лінії 129/Sv віком 15--16 міс. отримували нейротоксини 1-метил-4-феніл1,2,3,6-тетрагідропіридин (МФТП) у дозі 30 мг/кг 1 раз або купризон щоденно з їжею впродовж трьох тижнів. Мелатонін вводили в дозі 1 мг/кг щоденно о 18:00, з 7--8-ї доби дії токсинів. Оцінювали вміст малонового діальдегіду (МДА), активність антиоксидантних ферментів у головному мозку, а також показники поведінки в тестах «відкрите поле», на ригідність і в ротарод-тесті. Результати. Рухова, емоційна й дослідницька активність мишей з моделями паркінсонізму і демієлінізації менше, ніж у інтактних тварин. М'язовий тонус зменшується під дією купризону; після ін'єкції МФТП тонус зростає, а довжина кроку зменшується. Під впливом мелатоніну у мишей із парокінсонізмом зростає число квадратів, довжина кроку і зменшується час утримання на валу; у мишей із купризоновою дієтою зростає число квадратів, стійок і болюсів. У головному мозку екзогенний мелатонін зменшує підвищений під впливом нейротоксинів вміст МДА і підвищує знижену активність супероксиддисмутази й каталази при паркінсонізмі, каталази і глутатіонпероксидази при демієлінізації. Висновки. Позитивний вплив мелатоніну на поведінку старіючих мишей із МФТП-моделлю паркінсонізму і купризоновою моделлю демієлінізації опосередкований посиленням антиоксидантного захисту головного мозку.

Ключові слова: нейротоксини МФТП і купризон; паркінсонізм; демієлінізація; мелатонін; старіння, малоновий діальдегід і антиоксидантні ферменти головного мозку; поведінкові реакції

Введение

Известно, что болезнь Паркинсона (БП) и рассеянный склероз являются распространенными прогрессирующими патологиями центральной нервной системы (ЦНС), развитие которых приводит к инвалидизации пациентов [1, 2]. Факты встречаемости рассеянного склероза не только у молодых, но и у лиц старше 45 лет, а также преимущественного выявления БП у пожилых людей указывают на связь этих заболеваний с возрастом. Нарушения функционального состояния ЦНС при БП и рассеянном склерозе характеризуются двигательными, эмоциональными, вегетативными и когнитивными проявлениями [1, 2]. Важную роль в развитии таких нарушений нервной системы играет оксидативный стресс. Так, по данным авторов, свободные радикалы и активные формы кислорода повреждают дофаминергические нейроны черной субстанции головного мозга и миелин нервных окончаний [3, 4]. Нами показана сопряженность развития оксидативного стресса в головном мозге и выраженных изменений двигательной, эмоциональной и исследовательской активности животных с экспериментальными моделями паркинсонизма и демиелинизации [5--7].

Использование медикаментозных средств попрежнему является основным методом лечения пациентов разного возраста с БП и рассеянным склерозом. Вместе с тем длительное применение лекарственных препаратов часто сопровождается значительными побочными метаболическими эффектами [4, 8]. Поэтому представляется важным поиск средств с антиоксидантными свойствами, которые способны одновременно улучшить нарушенное функциональное состояние ЦНС при этих патологиях. Одним из таких средств может быть гормон эпифиза мелатонин, который регулирует биоритмы организма, проявляет антиоксидантные, антиапоптотические, антивоспалительные, иммуномодулирующие и нейротрофические свойства [9, 10]. Важно, что с возрастом при БП/паркинсонизме и рассеянном склерозе содержание мелатонина в циркуляции снижается [10--12]. Нами показано выраженное антиоксидантное, нейропротекторное и ремиелинизирующее действие экзогенного мелатонина у взрослых животных с экспериментальными моделями паркинсонизма и демиелинизации [7, 13]. В то же время у стареющих животных с такими патологиями ЦНС эффекты мелатонина остаются недостаточно исследованными.

Цель -- исследовать влияние мелатонина на поведение, факторы оксидативного стресса и антиоксидантной защиты головного мозга стареющих мышей с экспериментальными моделями паркинсонизма и демиелинизации.

Материалы и методы

Животные. Исследования проводили на мышах -- самках линии 129/Sv (генотип Н-2^Ь) в возрасте 15--16 мес. (стареющие) из питомника ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины». По нашим данным, мыши линии 129/Sv разного возраста чувствительны к повреждающим эффектам нейротоксинов разной природы [5, 6]. Животных содержали в стандартных условиях вивария при фиксированном режиме освещения 12: 12. Для получения биологического материала (головной мозг) мышей декапитировали в утреннее время суток под эфирным наркозом. Все экспериментальные исследования проводили согласно закону Украины «О защите животных от жестокого поведения» и «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, которые используются с экспериментальной и другой научной целью» (Страсбург, 1986).

Модели. Экспериментальную модель паркинсонизма воспроизводили у стареющих мышей путем подкожного (в область шеи) одноразового введения селективного для дофаминергических нейронов черной субстанции головного мозга нейротоксина 1-метил-4фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) (Sigma, США) в дозе 30 мг/кг [5]. Нами показано, что у стареющих мышей через 18 дней после введения МФТП развиваются морфофункциональные изменения ЦНС [5]. Экспериментальную модель демиелинизации индуцировали у стареющих мышей с помощью ежедневного в течение трех недель приема с пищей (0,2 % от суточного корма) нейротоксина купризона (бис(циклогексанон)оксалдигидразон) (Sigma, США) [4, 6]. По нашим данным, подобный прием купризона позволяет получить у стареющих мышей линии 129/Sv не только демиелинизирующий, но и нейротоксический эффект [6, 7].

Мелатонин (Sigma, США) вводили стареющим животным внутрибрюшинно, ежедневно в 18:00, из расчета 1 мг/кг: мышам с экспериментальной моделью паркинсонизма -- с 7-го до 18-го дня после одноразовой инъекции МФТП; мышам с экспериментальной моделью демиелинизации -- с 8-го до 21-го дня купризоновой диеты. Выбор указанных сроков начала введения мелатонина при изучаемых патологиях связан с выявлением уже в этих периодах действия используемых нейротоксинов признаков структурных и функциональных изменений в нервной системе, а также нарушений метаболизма нейромедиаторов [6, 14].

Экспериментальные группы. Стареющих мышей с моделью паркинсонизма разделили на следующие группы (в каждой по 10 животных): интактные животные; мыши контрольной группы, которым вводили МФТП и растворитель мелатонина (0,9% раствор хлорида натрия); мыши, которым вводили МФТП и мелатонин. Стареющих мышей с моделью демиелинизации разделили на такие группы (по 10 особей в группе): интактные, которые находились на обычном рационе вивария; контрольные мыши, получавшие купризон и инъекции растворителя мелатонина; мыши, получавшие купризон и инъекции мелатонина.

На 18-й день после инъекции МФТП и на 21-й день купризоновой диеты, а также одновременно у интактных мышей проводили поведенческие тесты. На следующий день (соответственно 19-й и 22-й день эксперимента) всех мышей декапитировали и извлекали головной мозг для проведения биохимических исследований.

Показатели оксидативного стресса и антиоксидантной защиты. Содержание малонового диальдегида (МДА) в головном мозге определяли по интенсивности цвета триметинового комплекса, образующегося между тиобарбитуровой кислотой и МДА [15]. Активность антиоксидантных ферментов измеряли в супернатанте гомогенатов головного мозга мышей спектрофотометрическим методом (спектрофотометр ^Quant, Bio-Tek, США), как нами было описано ранее [5]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по способности фермента угнетать реакцию аутоокисления адреналина (Fluka, Германия) в адренохром при рН 10,2 и выражали в условных единицах из расчета на 1 мг белка за 1 мин. Активность каталазы оценивали по кинетике разрушения Н₂О₂ (Riedel-deHaлn, Германия) и выражали в микромолях утилизованной Н₂О₂ на 1 мг белка за 1 мин. Активность глутатионпероксидазы (ГП) и глутатионредуктазы (ГР) измеряли по уменьшению никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) в соединенной глутатионредуктазной реакции с добавлением в реактивную смесь соответствующих реагентов (Sigma, США) и выражали в наномолях окисленного NADPH на 1 мг белка за 1 мин. Содержание белка в головном мозге измеряли по методу Лоури.

Поведение у мышей с моделью паркинсонизма исследовали в тестах «открытое поле», на ригидность и в ротарод-тесте, а с купризоновой моделью демиелинизации -- в тесте «открытое поле» и ротарод-тесте [16, 17]. Тест «открытое поле» дает возможность оценить у животных горизонтальную двигательную (количество пересеченных квадратов), вертикальную двигательную (количество вертикальных стоек), эмоциональную (число фекальных болюсов) и исследовательскую (количество заглядываний в норки -- норковый рефлекс) активность. Длительность тестирования мышей 3 мин. Ротарод-тест позволяет оценить координацию, чувство равновесия и мышечный тонус мышей. Скорость оборотов барабана в установке изменяли последовательно с 10 оборотов в 1 мин (об/мин) (3 V, 300 mA) до 20 об/мин (5 V, 300 mA). Данные представляли в виде суммарного времени (секунды) удержания на валу при 10 и 20 об/мин. Ригидность у животных изучали по изменению длины тела (миллиметры) и походки. Для оценки походки стопы мышей обрабатывали нетоксическими растворами краски разного цвета и по отпечаткам измеряли длину шага, длину и ширину стопы (миллиметры).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Для статистического анализа использовали программу Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США).

Результаты

Поведение, факторы оксидативного стресса и антиоксидантной защиты головного мозга стареющих мышей с МФТП-моделью паркинсонизма и их изменения после введения мелатонина. Установлено, что у мышей под влиянием МФТП число квадратов, вертикальных стоек, болюсов, заглядываний в норки, длина шага уменьшались, тогда как время удержания на валу значительно увеличивалось по сравнению с интактными животными (табл. 1). После инъекций мелатонина число квадратов было существенно больше, чем у мышей контрольной группы, однако меньше, чем у интактных животных (табл. 1). Под влиянием экзогенного мелатонина время удержания на валу и длина шага достигали значений показателей интактной группы животных.

Содержание МДА в головном мозге стареющих мышей повышалось после введения МФТП, тогда как активность СОД и каталазы снижалась (табл. 2). Инъекции мелатонина привели к существенному снижению содержания МДА, а также повышению активности СОД и каталазы. При этом значения МДА и каталазы соответствуют таковым в интактной группе животных.

Следовательно, под влиянием экзогенного мелатонина у стареющих мышей с МФТП-моделью паркинсонизма наблюдались положительные изменения показателей поведения и баланса факторов оксидативного стресса и антиоксидантной защиты головного мозга.

Поведение, факторы оксидативного стресса и антиоксидантной защиты головного мозга стареющих мышей с купризоновой моделью демиелинизации и их изменения после введения мелатонина. Установлено, что у стареющих мышей с купризоновой диетой число квадратов, стоек, болюсов, заглядываний в норки, а также время удержания на валу меньше, чем у мышей интактной группы (табл. 3). После инъекций мелатонина число квадратов, стоек и болюсов повышалось по сравнению с группой контроля и при этом не отличалось от значений у интактных животных (кроме числа стоек).

Таблица 1