Ризогенез експлантів Silene hypanica Klokov та їх адаптація до умов ex vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ризогенез експлантів Silene hypanica Klokov та їх адаптація

до умов ex vitro

Л.Л. Джус, Л.А. Колдар

Національний дендрологічний парк «Софіївка» НАН України, Умань, Черкаська область

Серед природоохоронних заходів, пов'язаних зі збереженням рослинного різноманіття, важливе місце належить створенню і збереженню в умовах культури рідкісних видів і видів, що зникають. Так, під загрозою зникнення перебуває вид Silene hypanika Klokov, реліктовий, ендемічний вид, занесений до Червоної книги України, Європейського червоного списку, Резолюції 6 Бернської конвенції. Перспективи збереження пов'язані з вивченням його життєздатності та потребують розроблення ефективних методів розмноження, зокрема в культурі in vitro. У статті наведено результати досліджень одного з етапів розмноження in vitro - ризогенезу есплантів S. hypanika та його залежність від концентрацій у живильних середовищах Р-індолілмасляної кислоти (Р-ІМК) (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мг/л) з подальшою адаптацією вкорінених рослин in vitro до умов ex vitro. З'ясовано, що активний процес ризогенезу відбувався за додавання до живильного середовища Р-ІМК у концентрації 0,5 мг/л і сприяв одержанню 86,4% укорінених in vitro рослин-регенерантів. Пересаджування їх у торф' яні диски з подальшим дорощуванням у контейнерах сприяло успішній адаптації укорінених рослин.

Ключові слова: Silene hypanica Klokov, мікроклональне розмноження, fi-індолілмасляна кислота, концентрації, рослини-регенеранти, укорінення, адаптація, субстрат.

RHIZOGENESIS OF SILENE HYPANICA KLOKOV EXPLANTS AND THEIR ADAPTATION TO EX VITRO CONDITIONS

L. Dzhus, L. Koldar

National Dendrological Park «Sofiyivka» of NAS of Ukraine, Ukraine

Among the conservation measures related to the preservation of plant diversity, an important place belongs to the creation and preservation of rare and endangered species in the crop conditions. Thus, the species Silene hypanica Klokov is under threat of extinction. This relict and endemic species is listed in the Red book of Ukraine, the European Red list, and 6th Resolution of the Berne Convention.

Prospects for the conservation of this species are related to the study of its viability and require the development of effective methods of reproduction, in particular in vitro crop. The article presents the results of studies of one of the breeding stages in vitro - rhizogenesis of S. hypanica esplants and its dependence on the concentrations of P-indolyl butyric acid in nutrient media (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg / l), followed by adaptation of regenerating plants to ex vitro conditions. The study showed that the active process of rhizogenesis occurred due to the addition of P-IMC to the nutrient medium at a concentration of 0.5 mg/l and contributed to the production of 86.4 % of rooted regenerating plants. Transplanting rooted plants into peat disks and then growing them in containers contributed to the successful adaptation of rooted plants.

Key words: Silene hypanica, microclonal breeding, P-indolyl butyric acid, concentrations, regenerating plants, rooting, adaptation, substrate.

Одним із напрямків збереження рослинного різноманіття є введення в культуру рідкісних видів світової флори і видів, які зникають, що дає змогу не лише поглиблювати знання про їх екологічні та біологічні особливості, а й створювати вагомий банк рослинного матеріалу, який у перспективі може бути використаний для реінтродукції рослин у місця їх природного росту. Серед природоохоронних заходів, пов'язаних з діяльністю ботанічних установ України, важливе місце належить створенню й збереженню в умовах культури колекцій рідкісних видів і видів, що зникають. Велике значення при цьому має розробка ефективних методів розмноження раритетних видів природної флори на основі вивчення їхньої життєздатності та перспектив збереження [9]. ризогенез експлант розмноження

До видів, що перебувають під загрозою зникнення, належить Silene hypanica Klokov (родина Caryophyllaceae Juss.) - реліктовий, ендемічний вид, занесений до Червоної книги України (2009), Європейського червоного списку (1991), Резолюції 6 Бернської конвенції (1996) [2, 12].

S. hypanica - трав'яниста одно-дво-трирічна рослина заввишки 25-100 см. Стебло прямостояче, просте, у верхній частині розгалужене. Прикореневі листки довгасті (завдовжки 4-6 см), стеблові - яйцеподібно-ланцетні (завдовжки 2-8 см). Квітки червоні, зібрані у густе, головчасте суцвіття. Чашолистки (завдовжки 16-18 мм) циліндричні, у верхній частині розширені, з трикутними зубчиками. Плід - коробочка завдовжки 7-9 мм. Цвіте у червні- липні. Плодоносить у липні-серпні. Мезофіт [11]. У природних умовах S. hypanica розмножується насінням і характеризується низькою конкурентною здатністю проростків та сходів, що обмежує його поширення. Оскільки цей вид є рідкісним і перебуває під загрозою зникнення, то для отримання якомога більшої кількості садивного матеріалу ми використовували різні методи розмноження, зокрема метод культури in vitro. Ця технологія розмноження дозволяє найбільш точно реалізувати потенціал рослин і на сьогоднішній день є головною складовою сучасних біотехнологій клонування і виробництва садивного матеріалу у селекції і рослинництві [6]. Розмноження in vitro S. hypanica - вдала альтернатива традиційним методам розмноження [3]. Не сьогодні нам не відома інформація щодо розмноження S. hypanica in vitro в умовах України.

Варто зазначити, що технології in vitro, розроблені для одного виду, не завжди можна використати для іншого, оскільки вони відрізняються за проявом морфогенної активності. У зв'язку з цим учені проводять дослідження регенераційної здатності тканин та органів рослин для кожного генотипу окремо.

Мета досліджень - з'ясувати залежність ризогенезу есплантів S. hypanica від концентрацій Р-індолілмасляної кислоти та їх співвідношень у живильних середовищах з подальшою адаптацією рослин-регенерантів до умов ex vitro.

Матеріал і методи досліджень

У роботі використовували методи культури рослинних тканин та індукції морфогенних процесів in vitro, викликаних регуляторами росту. Культивування експлантів проводили у культуральній кімнаті з кондиційованим повітрям, на скляних стелажах, за температури 24±1°C, відносної вологості повітря 70-75%, фотоперіоду 16 годин і штучного освітлення інтенсивністю 2-3 тис. люкс. Посуд, матеріали, інструменти та живильні середовища стерилізували згідно методик Калініна, Катаєвої; Мельничука та ін. [5, 6].

Для досягнення ризогенезу використовували експланти S. hypanica, одержані за умов асептичної культури in vitro. Здатність екслантів до укорінення та одержання рослин- регенерантів вивчали за використання живильного середовища Мурасіге і Скуга з додаванням Р-ІМК (Р-індолілмасляна кислота), у різних концентраціях (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мг/л) [11]. За контроль був прийнятий варіант живильного середовища I, без додавання Р-ІМК.

Під час проведення експериментальних робіт використовували методики з культури ізольованих клітин, тканин і органів рослин та проводили математичну обробку отриманих результатів [1, 4, 5, 7, 8]. Дослідження проведено у лабораторії мікроклонального розмноження рослин Національного дендрологічного парку «Софіївка» НАН України.

Результати досліджень та їх обговорення

Увесь процес мікроклонального розмноження рослин поділяють на кілька етапів: ввдення в культуру in vitro та одержання первинних експлантів; розмноження та створення умов, які б сприяли успішній реалізації морфогенного потенціалу експлантів для одержання високого коефіцієнту розможення; підбір регулюючих ріст речовин для досягнення експлантами ризогенезу та одержання рослин-регенерантів; адаптація рослин-регенерантів до умов ex vitro.

Одним із ключових етапів мікроклонального розмноження рослин є ризогенез експлантів, для досягнення якого нами проведено модифікацію живильних середовищ. Отримані в асептичних умовах експланти, які мали сформовані розетки завдовжки 1,5-2,0 см, висаджували на живильне середовище Мурасіге-Скуга (МС) з половинним вмістом макро- і мікросолей, доповнене різними концентраціями Р-ІМК (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мг/л). (таблиця).

Таблиця

Характеристика ризогенезу у рослин-регенерантів S. hypanica

Початок ризогенезу спостерігали через 16 діб після висадження на живильні середовища для укорінення. Аналізуючи вплив різних концентрацій ІМК на ефективність ризогенезу, з'ясовано, що з досліджуваних найбільш ефективними виявилися варіанти з додаванням Р-ІМК від 0,5 мг/л до 1,5 мг/л. Відсоток укорінених рослин становив 41,5-86,4%. Найбільш ефективним виявився варіант III, у якому до середовища МС додавали 0,5 мг/л Р-ІМК. За такого складу живильного середовища впродовж 20-25 діб було отримано в середньому 86,4% укорінених рослин, які мали 5,5 шт. коренів у розрахунку на одну рослину; довжина коренів складала 44,1±2,1 мм, а висота рослин становила 36,2 ±1,3 мм (рис. 1). Зменшення концентрації Р-ІМК до 0,1 мг/л та збільшення до 2,0 мг/л значно знижували відсоток укорінення, який відповідно становив 11,1 та 16,7%. У варіанті I, без додавання Р-ІМК, який був контролем укорінення, експлантів не спостерігали. Тривалість пасажу в середньому складала 25-30 діб і залежала від умов культивування, темпу розмноження, характеру розвитку експланта.

Рис. 1. Ризогенез експлантів S. hypanica

Не менш складним етапом у процесі мікророзмноження рослин є адаптація рослин-регенерантів до умов ex vitro. На цьому етапі за несприятливих умов культивування загибель висаджених рослин може інколи досягати 80-100%. Це пов'язано з аномальним розвитком кореневої системи під впливом ауксину, відсутністю кореневих волосків, порушеннями водного обміну у рослин-регенерантів, що зумовлено підвищеною транспірацією та зниженою здатністю до фотосинтезу пересаджених із пробірок укорінених рослин [6, 7]. На цьому етапі, при перенесенні рослин-регенерантів у нестерильні умови, значну увагу необхідно приділяти встановленню оптимальної фази розвитку рослин-регенерантів, під час якої вони мають найбільшу адаптивну здатність до нестерильних умов. Не кожна рослина, яка проросла у пробірці і утворила корінь, здатна до адаптації. За даними наших спостережень, до адаптації здатні рослини з добре сформованою розеткою з 3-5 листками та з коренями завдовжки понад 12-20 мм. Такі рослини висаджували у торф'яні диски Juffy-7, попередньо оброблені перманганатом калію (КМПО4) для адаптації до умов ex vitro (рис. 2). Менш розвинуті розетки S. hypanica відбирали окремо і висаджували на середовище МС з додаванням регуляторів росту для подальшого мікророзмноження з метою збільшення коефіцієнту розмноження та, відповідно, і кількості садивного матеріалу.

Для підтримання рівня вологості повітря торф'яні диски переносили в скляні акліматизаційні камери власного виробництва, у яких впродовж 3^ діб вологість підтримувалась на рівні 80-90%.

Після цього камери поступово відкривали, поетапно знижуючи вологість повітря, і за 8-10 діб її знижували до 70%. У рослин спостерігали формування нових листків та перші ознаки розростання розетки, що свідчило про успішність адаптації. Рослини пересаджували у контейнери з різними за складом ґрунтосумішами. Найбільш ефективним виявився субстрат з таким складом: ґрунт лісовий, пісок річковий, торф верховий моховий і перліт у співвідношенні відповідно 2:1:1:1, на якому добре відбувались приживання, ріст та розвиток рослин. Адаптація рослин у контейнерах відбувалася на стелажах адаптаційної кімнати за 16- годинного фотоперіоду, вологості повітря 70-80 % та за температури - 22-23 °С. За таких умов дорощування одержували близько 90% адаптованих рослин, придатних до пересаджування у нестерильні умови in vivo.

Рис. 2. Адаптація рослин-регенерантів S. hypanica у торф'яних дисках

Висновки

Активному проходженню процесів ризогенезу сприяло додавання до живильного середовища МС р-індолілмасляної кислоти у концентрації 0,5 мг/л, що дало можливість одержати близько 86,4 % укорінених рослин-регенерантів.

Для адаптування рослин-регенерантів S. hypanica до умов ex vitro найбільш доцільно пересаджувати рослини з пробірок у торф'яні диски Juffy-7 з подальшим дорощуванням у контейнерах за використання ґрунтосуміші такого складу: ґрунт лісовий, пісок річковий, торф верховий моховий та перліт у співвідношенні відповідно 2:1:1:1.

Вихід адаптованих рослин, придатних до висадження в умови in vivo, становив близько 90%.

Література

1. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 272 с.

2. Глобальная стратегия сохранения растений. BGCI: Rishmond, U. К., 2002. 16 с.

3. Джус Л. Л. Особливості насіннєвого розмноження Silene hypanica Klokov in situ та ex situ. Автохтонні та інтродукованірослини. Вип. 11. 2015. С. 203-207.

4. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М. : Агропромиздат, 1985. 351 с.

5. Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. К. : Наукова думка, 1980. 488 с.

6. Катаева Н. В. Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. М. : Наука, 1983. 96 с.

7. Кунах В. А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи. К. : Логос, 2005. 730 с.

8. Мельничук М. Д., Новак Т. В., Кунах В. А. Біотехнологія рослин : підручник. К. : Поліграфконсалтинг, 2003. 520 с.

9. Собко В. Г., Гапоненко М. Б., Гнатюк А. М., Деркач О. В., Мініна Ю. В., Решетюк О. В. Репатріація фітораритетів як активний засіб відновлення популяцій і покращення біологічного стану довкілля. Роль ботанічних садів в зеленому будівництві міст, курортних та рекреаційних зон: матеріали міжнар. наук. конф., 20-24 травня 2002 р. Одеса : ЛАТСТАР, 2002. Ч. II. С. 138-141.

10. Червона Книга України. Рослинний світ / за ред. Я. П. Дідуха. К. : Глобалконсалтинг, 2009. 912 с.

11. Murashige T. Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. Vol. 15., № 13. Р. 473-497.

12. A Sustainable Future for Europe; the European Strategy for Plant Conservation 2008-2014 / Developed by the Planta Europe and Counsil of Europe. Salisbury, UK Strasbourg, France, 2008. 63 p.

References

1. Butenko R. G. Kul'tura izolirovannyh tkanej i fiziologija morfogeneza rastenij. M.: Nauka, 1964. 272 s. [in Russian]

2. Global'naja strategija sohranenija rastenij. BGCI: Rishmond, U. K., 2002. 16 c. [in Russian]

3. Dzhus L. L. Osoblyvosti nasinnievoho rozmnozhennia Silene hypanica Klokov in situ ta ex situ. Avtokhtonni ta introdukovani roslyny. Vyp. 11. 2015. S. 203-207. [in Ukrainian]

4. Dospehov B. A. Metodika polevogo opyta (s osnovami statisticheskoj obrabotki rezul'tatov issledovanij). M.: Agropromizdat, 1985. 351 s. [in Russian]

5. Kalinin F. L., Sarnackaja V. V., Polishhuk V. E. Metody kul'tury tkanej v fiziologii i biohimii rastenij. K.: Naukova dumka, 1980. 488 s. [in Russian]

6. Kataeva N. V. Butenko R. G. Klonal'noe mikrorazmnozhenie rastenij. M.: Nauka, 1983. 96 s. [in Russian]

7. Kunakh V. A. Biotekhnolohiia likarskykh roslyn. Henetychni ta fizioloho-biokhimichni osnovy. K.: Lohos, 2005. 730 s. [in Ukrainian]

8. Melnychuk M. D., Novak T. V., Kunakh V. A. Biotekhnolohiia roslyn : pidruchnyk. K.: Polihrafkonsaltynh, 2003. 520 s. [in Ukrainian]

9. Sobko V. H., Haponenko M. B., Hnatiuk A. M., Derkach O. V., Minina Yu. V., Reshetiuk O. V. Repatriatsiia fitorarytetiv yak aktyvnyi zasib vidnovlennia populiatsii i pokrashchennia biolohichnoho stanu dovkillia. Rol botanichnykh sadiv v zelenomu budivnytstvi mist, kurortnykh ta rekreatsiinykh zon: materialy mizhnar. nauk. konf., 20-24 travnia 2002 r. Odesa: LATSTAR, 2002. Ch. II. S. 138-141. [in Ukrainian]

10. Chervona Knyha Ukrainy. Roslynnyi svit / za red. Ya. P. Didukha. K.: Hlobalkonsaltynh, 2009. 912 s. [in Ukrainian]

11. Murashige T. Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. Vol. 15., № 13. Р. 473-497.

12. A Sustainable Future for Europe; the European Strategy for Plant Conservation 2008-2014 / Developed by the Planta Europe and Counsil of Europe. Salisbury, UK Strasbourg, France, 2008. 63 p.

Размещено на Allbest.ru