Пептидоглікан золотистого стафілокока змінює скоротливість міометрія невагітних щурів завдяки підвищенню внутрішньоклітинного вмісту кальцію

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця, НАН України

Пептидоглікан золотистого стафілокока змінює скоротливість міометрія невагітних щурів завдяки підвищенню внутрішньоклітинного вмісту кальцію

Л.С. Насібян, Г.В. Соткіс, О.М. Цугорко,

І.Б. Філіппов, Я.М. Шуба

Робота присвячена дослідженню та механізму впливу пептидоглікану золотистого стафілокока на амплітудно-кінетичні параметри скорочень міометрія. Експерименти проводили методами тензометрії та кальциметрії. Показано, що пептидоглікан модулює всі основні параметри скорочень матки невагітних щурів, у тому числі збільшуючи їхню амплітуду та тривалість на 10 та 30% відповідно, переважно за рахунок подовження фази розслаблення (на 56,7 ± 1,6%): смужка міометрія відносно швидко скорочувалась і довго розслаблялась. Аплікація пептидоглікану на свіжоізольовані міоцити матки протягом 5 хв призводила до періодичного підвищення в них внутрішньоклітинного вмісту іонів кальцію. Дія пептидоглікану посилювала скорочення міометрія, викликані гіперкалієвим розчином у концентрації 60 ммоль/л. Прикладання 1 мкмоль/л ніфедипіну, блокатора потенціалкерованих кальцієвих каналів L-типу, пригнічувало спонтанні скорочення, посилені дією пептидоглікану. Зазначені зміни скоротливості міометрія на тлі дії пептидоглікану відбуваються не тільки завдяки посиленню трансмембранного надходження кальцію, але й його мобілізації із саркоплазматичного ретикулума.

Ключові слова: міометрій; скоротливість міометрія; пептидоглікан; золотистий стафілокок; внутрішньоклітинний вміст кальцію.

Л.С. Насибян, Г.В. Соткис, О.М., Цугорко, И.Б. Филиппов, Я.Н. Шуба

Работа посвящена исследованию механизму влияния пептидогликана золотистого стафилококка на амплитуднокинетические параметры сокращений миометрия. Исследование проводили методами тензометрии и кальциметрии. Результаты экспериментов показали, что действие пептидогликана модулирует все основные параметры сокращений матки небеременных крыс, в том числе увеличивая их амплитуду и длительность на 10 и 30% соответственно, в основном за счет удлинения фазы расслабления (на 56,7 ± 1,6%): полоска миометрия относительно быстро сокращалась и долго расслаблялась. Аппликация пептидогликана на свежеизолированные миоциты матки в течение 5 мин приводила к периодическому повышению в них внутриклеточного содержания ионов кальция, усиливалось сокращение миометрия, вызванное действием гиперкалиевого раствора в концентрации 60 ммоль/л. Приложения 1 мкмоль/л нифедипина, блокатора потенциалуправляемых кальциевых каналов L-типа, подавляли спонтанные сокращения, усиленные влиянием пептидогликана. Указанные изменения сократимости миометрия на фоне действия пептидогликана происходят не только благодаря усилению трансмембранного поступления кальция, но и его мобилизации из саркоплазматического ретикулума.

Ключевые слова: миометрий; сократимость миометрия; пептидогликан; золотистый стафилококк; внутриклеточное содержание кальция.

L.S. Nasibian, H.V. Sotkis, O.M. Tzugorko, I.B. Philippov, Ya.M. Shuba

The work is devoted to the study of the effect of Staphylococcus aureus peptidoglycan on the main parameters of myometrial contractions and the mechanism of this influence. The research was carried out by tensometry and calcimetry methods. The results of the experiments demonstrated that peptidoglycan modulates all the main parameters of contractions of the non-pregnant rat uterus, including increasing their amplitude and duration by 10 and 30%, respectively, mainly by prolonging the relaxation phase (56.7 ± 1.6%): myometrial band relative to quickly shrunk and relaxed for a long time. Application of peptidoglycan on freshly isolated uterine myocytes for 5 min led to a periodic increase in their intracellular content of calcium ions. Peptidoglycan enhanced myometrial contractions caused by hyperpotassium solution at a concentration of 60 mmol. Administration of 1 pmol of nifedipine, a blocker of potential-directed L-type calcium channels, suppressed spontaneous contractions enhanced by peptidoglycan. These changes in myometrium contractility of on the background of peptidoglycan action occur not only due to increased transmembrane calcium intake, but also its mobilization from the sarcoplasmic reticulum.

Key words: myometrium; myometrial contractility; peptido- glycan; Staphylococcus aureus; intracellular calcium level.

ВСТУП

Пептидоглікан - це структурний компонент клітинної стінки грампозитивних (зокрема золотистого стафілокока) та грамнегативних бактерій [1-3], що оточує плазмолему зовні, відіграючи роль екзоскелета. Він виділяється в навколишнє середовище під час росту, ділення або руйнування бактерії, розповсюджується кровотоком по організму та осідає на тропних клітинах, де з часом ініціює патологічні процеси [3-5]. Взаємодія пептидоглікану з рецепторами вродженої імунної системи, на клітинах ендометрія та децидуальної тканини під час вагітності викликає розвиток запальної реакції, подальшу активацію скоротливості міометрія та переривання вагітності [6-9].

У дослідженнях Ghiasi (2014) показано, що золотистий стафілокок є одним з мікро організмів, що найчастіше висіваються із піхви та цервікального каналу жінок з діагностованим безпліддям [10]. Нещодавні дослідження [11] епітелію шийки матки жінок з непліддям, в генітальному тракті яких висівався золотистий стафілокок, не виявили ознак запалення, а отримані дані не були достатньо інформативним для того, щоб скласти чітке уявлення про механізм та причину неплідності.

Ймовірно, у інфікованих жінок дія пептидоглікану золотистого стафілокока може змінювати скоротливість міометрія таким чином, що запліднення або імплантація плідного яйця стають неможливими. Крім того, відбувається стимуляція скоротливості міометрія при вагітності як відповідь на дію прозапальних цитокінів, що секретуються імунокомпетентними клітинами ендометрія та децидуальної тканини [6-9]. Однак відомо також, що на міоцитах матки експресуються специфічні пептидогліканрозпізнаваючі рецептори вродженої імунної системи [12]. Тож ми припустили, що пептидоглікан може впливати на скоротливість міометрія безпосередньо, без участі ендометрія та експерименти проводили на смужках міометрія з попередньо видаленим внутрішнім шаром матки.

Метою нашої роботи було дослідження змін амплітудно-кітетичних параметрів спонтанних скорочень міометрія невагітних щурів з видаленим ендометрієм під дією пептидоглікану золотистого стафілококата механізму такої дії.

МЕТОДИКА

Експерименти проводили на смужках гладеньких м'язів та ізольованих гладенько м'язових клітин (ГМК) матки 10 статевозрілих самиць щурів лінії Вістар масою до 200250 гпри дотримуванні положень Директиви ЄС 2010/63/EU «Стосовно захисту тварин, що використовуються у наукових цілях» і вказівок біоетичного комітету Інституту фізіології.

Скоротливу активність міометрія досліджували методом тензометрії в ізометричному режимі. Смужки поміщали в проточну камеру з одним кінцем зафіксованим нерухомо, а другим - прикріпленим до ємнісного датчика сили з базовим навантаженням 3 мН. Запис скоротливої активності здійснювали через аналогово-цифровий перетворювач на комп'ютер.

Усіх дослідних тварин анестезували ефіром та декапітували. Роги матки швидко видаляли і поміщали в нагрітий до 37°С, оксигеновий (95% O₂ і 5% CO₂) розчин Кребса (ммоль/л): NaCl - 120,4; KCl - 5,9; CaCl₂ - 1,8; MgCl₂ - 1,2; NaH₂PO₄ -1,2; NaHCO₃ -15,5; глюкоза - 11,5 (рН 7,4). Роги матки розрізали вздовж, очищали від сполучної тканини та ендометрія. Нарізані повздовжні смужки довжиною 0,7-1,0 см і шириною 0,2-0,3 см поміщали в проточну камеру з одним кінцем зафіксованим нерухомо, а другим - прикріпленим до ємнісного датчика сили з базовим навантаженням 3 мН. Запис скоротливої активності здійснювали через аналогово-цифровий перетворювач на комп'ютер.

Визначення амплітудно-кінетичних параметрів скорочення смужок біометрія. Про характер скорочувальної діяльності гладеньких м'язів матки й впливу на неї пептидоглікану судили за такими показниками: середня частота та амплітуда скорочень протягом10 хв; середня тривалість скорочень та пауз між ними;тривалість маткового циклу (період часу від початку одного скорочення до початку наступного); індекс активності скорочень (відношення тривалості скорочень до тривалості пауз між скороченнями), коефіцієнт асиметрії (відношення тривалості систоли до тривалості діастоли скорочення), скоротлива активність матки в Олександрійських одиницях (AU) - добуток середньої амплітуди скорочень у міліньютонах, середньої тривалості скорочень у хвилинах та частоти скорочень за 10 хв [13]; максимальна швидкість скорочення (+dF/dt_max) - позитивний пік першої похідної скорочення, що характеризує максимальне збільшенням внутрішньоклітинного вмісту кальцію в ГМК та фосфорилювання легких ланцюгів міозину; максимальна швидкість розслаблення (-dF/dt_max) - негативний пік першої похідної скорочення характеризує максимальне розслаблення м'язової смужки, що є наслідком припинення потенціалу дії в ГМК міометрія та зниженням внутрішньоклітинного вмісту кальцію; час активного скорочення (Т, с; проміжок часу між максимальними величинами +dF/dt _max та -dF/dt_max); приріст швидкості напруги скорочення (відношення максимальної швидкості скорочення на тлі досліджуваної речовини до цієї ж величини в контролі); приріст швидкості напруги розслаблення (відношення максимальної швидкості розслаблення на тлі досліджуваної речовини до цієї ж величини в контролі) [14]; тривалість систоли скорочень (відстань від початку наростання напруги до точки максимальної амплітуди) та діастоли (відстань від початку швидкого розслаблення до досягнення кривої рівня базового тонусу); тривалість тонічного компоненту скорочення.

Ізолювання ГМК міометрія вагітних і невагітних щурів здійснювали ферментативним методом двоциклової обробки тканини. В першому циклі обробку проводили за участю 1 мг/мл папаїну, 0,5 мг/мл ко- лагенази ІІ типу та інших допоміжних речовин, а в другому циклі - колагенази Іа- типу у концентрації 1 мг/мл та трипсину у концентрації 2 мг/мл.

Са²+-залежну флюоресценцію реєстрували за допомогою високоафінного (kd = 335 нм) кальційчутливого флюоресцентного барвника Fluo-4AM (максимуми абсорбції'/ емісії = 494 нм/506 нм). ГМК завантажували цим барвником за допомогою інкубації клітин протягом 40 хву розчині Кребса за наявності мембранопрониклого Fluo-4AM (2 мкмоль/л), попередньо розчиненого в DMSO (обидва від фірми «MolecularProbes», США) протягом 35 хв у темноті при кімнатній температурі. Далі ГМК відмивали у розчині Кребса протягом 40 хв при кімнатній температурі.

Для візуалізації змін Ca²+ на субклітинному рівні використовували конфокальний комплекс LSM 5 PASCAL на основі інвертованого мікроскопа Axiovert 200M (“Zeiss”, Німеччина).

Всі досліджувані речовини були від фірми “Sigma-Aldrich” (США). Пептидоглікан розводили в 0,9%-му розчині NaCl в концентрації 2 мг/мл і додавали до розчину Кребса в субмаксимальній концентрації 3-10^-3 мг/ мл [15]. Використовували такі реактиви: ніфедипін - блокатор потенціалзалежних кальцієвих каналів L-типу розводили в базовій концентрації в DMSO 20 ммоль/л і додавали до розчину Кребса в концентрації 1 мкмоль/л; гіперкалієвий розчин Кребса ([К+]і = 60 ммоль/л); ацетилхолін - агоніст- мускаринових та нікотинових холінорецеп- торіву концентрації 10 мкмоль/л.

Аналіз та статистичну обробку результатів експериментів та їхнє графічне представлення здійснювали за допомогою програмного забезпечення Origin 8.5. Для кожної серії експериментів визначали середні значення і приводили у вигляді m (M ± m) з позначенням числа смужок «n», на яких вони отримані. Статистичне порівняння контрольних значень параметрів і значень під впливом досліджуваних речовин проводили за допомогою парного критеріюt Стьюдента, а між групами за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу ANOVA з поправкою Бенферроні.

пептидоглікан золотистий стафілокок міометрій

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Визначення амплітудно-кінетичних характеристик спонтанних скорочень міометрія в контролі та на тлі дії пептидоглікану Першим завданням дослідження було виявити, чи змінює дія пептидоглікану скоротливість міометрія безпосередньо, без участі ендометрія. Тож ми дослідили амплітудно- кінетичні характеристики спонтанних скорочень м'язової смужки, очищеної від ендометрія, та їхні зміни на тлі аплікації пептидоглікану. У контрольних умовах смужки «невагітного» міометрія генерували регулярні спонтанні скорочення. На тлі регулярної спонтанної активності був аплікова- ний пептидоглікан, в результаті чого стимулювалася скоротливість міометрія. Як видно з рис. 1, під дією пептидоглікану більшою мірою зростала тривалість скорочень, у той час як їхня амплітуда суттєво не змінювалася. Цікаво, що у 80% досліджуваних смужок міометрія дія пептидоглікану призводила до зниження базального тонусу в середньому на 3,0 ± 0,58% (n = 8, Р < 0,05)від середньої амплітуди спонтанних скорочень міометрія в контролі.

Для порівняння інтенсивності скоротливості міометрія на тлі дії пептидоглікану та в контролі дослідили структуру скорочувального акту та оцінили параметри, вказані в таблиці. Розрахунок параметрів скоротливості, позначених у таблиці, показали, що подовження маткового циклу зумовлене як збільшенням тривалості самих скорочень, так і, меншою мірою, тривалості пауз між ними. Наслідком цього і є зменшення частоти скорочень за 10 хв на тлі дії пептидоглікану (рис. 1, б).

Рис. 1. Діаграми статистично узагальнених результатів змін тривалості (а), частоти (б) та амплітуди (в) скорочень під дією пептидоглікану відносно контролю, прийнятого за 100%; 1 - контроль, 2 - пептидоглікан; n = 10, *Р < 0,05, **Р < 0,001

Під дією пептидоглікану змінюється також структура самого скорочення: систола та діастола збільшувалися на 10,9 ± 1,25 та 56,7 ± 1,6% відповідно відносно контролю. Тонічний компонент маткового скорочення підвищився на 23,8 ± 0,65%. Отже, збільшення тривалості діастоли скорочення міо- метрія значно більш виражене, ніж приріст тривалості систоли. Індекс активності на тлі дії пептидоглікану зріс на 38,8 ± 0,25%. Скоротлива активність міометрія на тлі дії пептидоглікану підвищилася на 25,4 ± 1,265%, значення Т, проміжок часу між dF/ dt та -dF/dt - на 20%. А це значить, що збільшився період активного скорочення (див. таблицю; рис. 2) [12]. Коефіцієнт асиметрії зменшився на 30,76% відносно контролю, що свідчить про збільшення потужності скорочень [16].

Зміни показників скоротливої активності міометрія невагітних щурів на 30-й хвилині дії пептидоглікану золотистого стафілокока (М ± m).