Вплив епігалокатехін-3-галату та кверцетину на утворення активних форм кисню та азоту в печінці щурів за умов їх цілодобового освітлення та утримання на вуглеводно-ліпідній дієті

Размещено на http://www.allbest.ru/

Чорноморський національний університет імені Петра Могили

Полтавський державний медичний університет

Вплив епігалокатехін-3-галату та кверцетину на утворення активних форм кисню та азоту в печінці щурів за умов їх цілодобового освітлення та утримання на вуглеводно-ліпідній дієті

Ю.Д. Френкель, В.О. Зюзін,

В.С. Черно, В.О. Костенко

Миколаїв

Анотація

кверцетин епігалокатехін печінка щур

Досліджували вплив біофлавоноїдів - епігалокатехін-3-галату (EGCG) та кверцетину - на продукцію активних форм кисню та азоту в печінці щурів за умов їх цілодобового освітлення інтенсивністю 1500 лкупродовж 30 діб на тлі 60-денного утримання тварин на вуглеводно-ліпідній дієті (20%-й розчин фруктози та відповідний раціон). Виявлено, що за цих умов у тканинах печінки вірогідно зростала швидкість вироблення супероксидного аніон-радикала НАДФН-залежними електроннотранспортними ланцюгами (мікросомальними монооксигеназами та конститутивними NO-синтазами у неспряженому стані) - у 1,93 раза, дихальним ланцюгом мітохондрій - у 1,89 раза, а також лейкоцитарною НАДФН-оксидазою - вдвічі, зростала загальна активність NO-синтази - у 2,35 раза, активність її індуцибельної ізоформи - у 2,57 раза, концентрація пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів - у 1,68 раза. Введення за умов експерименту біофлавоноїдів - EGCG та кверцетину - суттєво обмежувало у тканинах печінки швидкість продукції супероксидного аніон-радикала мікросомальними монооксигеназами та NO-синтазою - на 39,1 та 40,1%, дихальним ланцюгом мітохондрій - на 37,2 та 34,4%, НАДФН-оксидазою лейкоцитів - на 35,0 та 32,1%, пригнічувало загальну активність NO-синтази - на 46,7 та 36,2%, активність її індуцибельної ізоформи - на 49,6 і 39,0 %, збільшувало активність конститутивного ізоферменту NO-синтази - у 2,9 раза та його спряженість - у 4,5 та 4,7раза, зменшувало концентрацію пероксинітритів лужних та лужноземельних металів - на 30,5 і 34,3% порівняно з відповідними значеннями групи, що зазнавала цілодобове освітлення на тлі вуглеводно-ліпідної дієти. Зроблено висновок щодо ефективності застосування EGCG та кверцетину за умов експерименту як засобів обмеження утворення активних форм кисню та азоту у тканинах печінки.

Ключові слова: цілодобове освітлення; вуглеводно-ліпідна дієта; метаболічний синдром; активні форми кисню та азоту; біофлавоноїди; епігалокатехін-3-галат; кверцетин.

Annotation

Yu.D. Frenkel, V.O. Zyuzin, V.S. Cherno, V.O. Kostenko

EFFECT OF EPIGALLOCATECHIN-3GALLATE AND QUERCETIN ON THE PRODUCTION OF REACTIVE OXYGEN AND NITROGEN SPECIES IN LIVER OF RATS EXPOSED TO ROUND-THE-CLOCK LIGHT AND KEPT ON CARBOHYDRATELIPID DIET

Petro Mohyla Black Sea National University, Mykolayiv; Poltava State Medical University, Ukraine;

The purpose of this study is to investigate the effects of bioflavonoids, epigallocatechin-3-ganate (EGCG) and quercetin, on the production of reactive oxygen and nitrogen species in the liver of rats under round-the-clock light exposure with an intensity of 1500 lux for 30 days while being kept on carbohydrate-lipid diet (20% fructose solution and appropriate food) for 60 days. In the liver tissues, the rate of the superoxide anion production by NADPH-dependent electron transport chains (microsomal monooxygenases and constitutive uncoupled NO synthases) increased by 1.93 times, by the mitochondrial respiratory chain by 1.89 times, and it was doubled by leukocyte NADPH-oxidase. The total activity of NO synthase was increased by 2.35 times, the activity of its inducible isoform increased by 2.57 times, and the concentration of alkali and alkaline earth metals peroxynitrites elevated by 1.68 times. Administration of bioflavonoids-epigallocatechin-3-gallate and quercetinsignificantly restrained the rate of superoxide anion production in the liver tissues by microsomal monooxygenases and NO synthase by 39.1 and 40.1%, by the mitochondrial respiratory chain by 37.2 and 34.4%, by leukocyte NADPH-oxidase by 35.0 and 32.1%, respectively. EpigaUocatechin-3-gaUate and quercetin inhibited the total activity of NO-synthase by 46.7 and 36.2%, the activity of its inducible isoform by 49.6 and 39,0%, increased the activity of the constitutive isoenzyme NO-synthase by 2.9 times and its coupling index by 4.5 and 4.7 times. Additionally, administration of these bioflavonoids lowered the concentration of peroxynitrites of alkali and alkaline earth metals by 30.5 and 34.3% compared to the respective values obtained in the group of rats, which did not receive the bioflavonoids, but were exposed to light and carbohydrate-lipid-rich diet. We suggest that epigallocatechin3-gallate and quercetin in the above experimental conditions are effective means to restrain the formation of reactive oxygen and nitrogen species in the liver tissue.

Key words: round-the-clock light; carbohydrate-lipid diet; metabolic syndrome; reactive oxygen and nitrogen species; bioflavonoids; epigallocatechin-3-gallate; quercetin.

Вступ

Нині накопичилися нові відомості щодо ролі розладів ритму «світло-темрява» у патогенезі порушень обміну речовин із супутнім хронічним дифузним запаленням слабкої інтенсивності, що є головними проявами метаболічного синдрому [1, 2]. Останній є важливим попередником розвитку цукрового діабету 2-го типу, серцево-судинних та інших хронічних захворювань [3]. Механізми роз© Ю.Д. Френкель, В.О. Зюзін, В.С. Черно, В.О. Костенко ладів вуглеводного та ліпідного метаболізму, системної запальної відповіді, артеріальної гіпертензії, ендотеліальної дисфункції та оксидативно-нітрозативного стресу значною мірою пов'язані з розвитком гіпомелатонінемії внаслідок дисрегуляції супрахіазматичного ядра гіпоталамуса та зменшення пінеальної продукції мелатоніну при порушенні світлового режиму [4, 5].

Раніше нами було показано, що концентрація мелатоніну у сироватці крові може суттєво зменшуватися у разі поєднаної дії цілодобового освітлення (ЦО) щурів та призначення їм упродовж 60 діб 20%-го розчину фруктози та збагаченого вуглеводами та жирами раціону [6]. Введення за цих умов мелатоніну частково зменшувало прояви гіперглікемії, гіперпре^-ліпопротеїнемії, гіпертриацилгліцеролемії та ознаки оксидативно-нітрозативного стресу в інсуліночутливих органах (скелетних м'язах, печінці), проте індекс інсулінорезистентності HOMA-IR (від англ. Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance) за цих умов істотно не змінювався [7]. Вочевидь відновлення вмісту мелатоніну не є достатнім для корекції за цих умов метаболічних порушень, оскільки патологічні процеси при дії названих етіологічних чинників мають здатність до саморозвитку. Наслідком ЦО є зміна експресії індуцибельних генів центрального та периферичних циркадіанних осциляторів, що впливає на активність певних транскрипційних факторів, зокрема транскрипційного фактора NF-kB [1, 8]. Наприклад, білок CLOCK здатний безпосередньо взаємодіяти з р65, що належить до родини NF-kB. BMAL1 при дії на CLOCK викликає ритмічну репресію генів запальної відповіді; відсутність BMAL1 супроводжується їх дерепресією внаслідок взаємодії CLOCK з NF-кВ-регульованими промоторами [9]. З активацією NF-kB пов'язаний також вплив висококалорійного вуглеводно-ліпідного раціону. Так, введення щурам, які зазнавали ЦО та отримували вуглеводно-ліпідну дієту (ВЛД), інгібітора NF-kB піролідиндитіокарбамату амонію суттєво обмежувало гіперінсулінемію та інсулінорезистентність, зменшувало прояви дисліпопротеїнемії, гіпо-а-ліпопротеїнемії та гіпертриацилгліцеролемії, гальмувало розвиток системної запальної відповіді [10]. За цих умов піролідиндитіокарбамат амонію значно зменшував у тканинах печінки вироблення активних форм кисню та азоту (АФК/АФА), а саме продукцію супероксидного аніон-радикала ('О -), активність індуцибельної ізоформи NO-синтази (iNOS), концентрацію пероксинітритів [11]. Однак такий специфічний інгібітор NF-kB виявляє певну генотоксичність [12]. Цього ефекту позбавлені рослинні поліфеноли - епігалокатехін-3-галат (EGCG), активний компонент зеленого чаю (Camellia sinensis) та кверцетин [13]. Обидві речовини є потужними інгібіторами активності 26S протеасоми як in vitro, так і in vivo [14, 15]. Внаслідок цього порушується транслокація димерів NF-kB у ядро через розлад убіквітинзалежного протеасомного протеолізу інгібіторного білка IkB [16]. Окрім того, EGCG та кверцетин здатні активувати антагоністичний щодо NF-kB сигнальний шлях, пов'язаний з індукцією системи Nrf2 - антиоксидант респонсивний елемент (ARE) [17, 18].

Застосування EGCG та водорозчинної форми кверцетину (корвітину) при відтворенні системної запальної відповіді зменшувало у тканинах концентрацію вторинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів і полегшувало порушення вуглеводного обміну (гіперінсулінемію, інсулінорезистентність) [19-21]. Це дає підстави сподіватися на позитивну дію EGCG та кверцетину на окисний метаболізм у внутрішніх органах, особливо інсуліночутливих, при відтворенні моделі метаболічного синдрому (за умов ЦО та ВЛД). Але закономірності впливу цих біофлавоноїдів на продукцію АФК/АФА в тканинах печінки за таких експериментальних умов залишається нез'ясованими.

Метою нашої роботи було вивчення впливу біофлавоноїдів - EGCG та кверцетину - на продукцію АФК/АФА в печінці щурів за умов їх цілодобового освітлення та утримання на вуглеводно-ліпідній дієті.

Методика

Дослідження були проведені на 32 білих щурах-самцях лінії Вістар масою 215-255 г, розподілених на 4 групи: 1-ша - інтактні тварини (контроль І), тваринам інших груп протягом часу ЦО на тлі ВЛД щоденно вводили внутрішньошлунково через зонд 1 мл 20%-й водний розчин фруктози («плацебо», контроль ІІ), EGCG та кверцетин (“SigmaAldrich, Inc.”, США) у дозі 40 та 200 мг/кг відповідно. Біофлавоноїди вводили разом з вуглеводами (20%-м водним розчином фруктози), що збільшує їхню розчинність і біодоступність [15].

ВЛД застосовували для годування щурів упродовж 2 міс: тваринам призначали 20%-й водний розчин фруктози для пиття та раціон харчування, який містив такі компоненти: рафіноване пшеничне борошно - 45%, сухе знежирене коров'яче молоко - 20%, крохмаль - 10%, столовий маргарин (зі складом жирів 72-82%) - 20%, переокиснена соняшникова олія - 4%, хлорид натрію - 1%. Додатково до цього, починаючи з 30-ї доби експерименту щурів піддавали ЦО інтенсивністю 1500 лк протягом наступних 30 днів [22]. Тварин декапітували під ефірним наркозом, дотримуючись положення «Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях» (Страсбург, 1986).

Швидкість генерації 'О - у гомогенаті печінки оцінювали при проведенні тесту з нітросинім тетразолієм з використанням спектрофотометра Ulab 101 (Китай) з індукторами у вигляді нікотинамідаденіндинуклеотиду відновленого (НАДН, “Sigma-Aldrich Inc.”, США) для оцінки продукції 'О ₂ дихальним ланцюгом мітохондрій, нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату відновленого (НАДФН, “Sigma-Aldrich, Inc.”, США) - мікросомальними монооксигеназами та NO-синтазою (NOS), ліпополісахариду Salmonella typhi (препарат «Пірогенал», фірма «Медгамал», РФ) - НАДФН-оксидазою лейкоцитів [23].

Загальну активність NO-синтаз (NOS) оцінювали за збільшенням концентрації нітрит-іонів після інкубації гомогенізованих зразків тканин печінки впродовж 30 хв в інкубаційному розчині (2,5 мл 0,1 М Тріс-буфера, 0,3 мл 320 ммоль/л водного розчину L-арнініну та 0,1 мл 1 ммоль/л розчину НАДФН) [24]. Одразу після змішування 10%-го гомогенату з інкубаційним розчином оцінювали початкову концентрацію нітритів у реакції з сульфаніловою кислотою та а-нафтиламіном, у результаті якої утворюються похідні червоного кольору (азобарвники), інтенсивність забарвлення який пропорційна вмісту нітрит-іонів. Для цього до 0,2 мл розчину, відібраного для первинної оцінки нітритів, додавали 1,8 мл дистильованої води, а далі 0,2 мл 1%-ї сульфанілової кислоти і через 10 хв - 0,2 мл 0,1%-го а-нафтиламіну. Вміст нітрит-іонів вимірювали за допомогою спектрофотометра Ulab 101 (Китай) при довжині хвилі 540 нм. Після 30 хв інкубації реакцію зупиняли додаванням 0,02 мл 0,02%-го азиду натрію та оцінювали кінцеву концентрацію нітритів. Для визначення активності конститутивних NO-синтаз (cNOS) до розчину, відібраного для первинної оцінки нітритів, додавали селективний інгібітор iNOS у вигляді 0,1 мл 1%-го розчину гідрохлориду аміногуанідину (98%, “Sigma-Aldrich, Inc.”, США) [25]. Активність iNOS оцінювали відніманням величини активності cNOS від значення загальної активності NOS. Для визначення здатності cNOS у неспряженому стані продукувати 'О ₂ розраховували індекс спряження цього ізоферменту як відношення його активності до швидкості вироблення 'О - НАДФН-залежними електронно-транспортними ланцюгами. Утворення пероксинітриту оцінювали за вмістом у гомогенаті печінки пероксинітритів лужних та лужноземельних металів, використовуючи їхню реакцію з йодидом калію при рН 7,0 в 0,2 М фосфатному буфері з таким самим рН [24].

Отримані результати статистично обробляли з використанням пакета програм Microsoft Office Excel з розширенням Real Statistics. Для перевірки розподілу на нормальність було застосовано розрахунок критерію Шапіро-Уілка. Оскільки варіаційні ряди відповідали нормальному розподілу, то для їх порівняння використовували критерій t Стьюдента для незалежних вибірок.

Результати та їх обговорення

При ЦО щурів за умов їх утримання на ВЛД вірогідно збільшувалася продукція 'О ₂ у тканинах печінки НАДФН-залежними електронно-транспортними ланцюгами (мікросомальними монооксигеназами та NOS) - у 1,93 раза, дихальним ланцюгом мітохондрій - у 1,89 раза, а також лейкоцитарною НАДФНоксидазою - вдвічі порівняно з контролем І (табл. 1).

У патогенезі оксидативного стресу значне місце займає активація транскрипційного фактора NF-kB [11]. Це, з одного боку, пов'язано з особливостями ВЛД, компоненти якої - неетерифіковані жирні кислоти - здатні викликати індукцію цього сигнального шляху через послідовну активацію Toll-подібних рецепторів 2-го і 4-го типів та ІкВ-кіназного комплексу [26]. Цьому сприяє ліпогенна природа фруктози, яка може підвищувати експресію генів синтази жирних кислот, ацил-коензим А карбоксилази, стероїл-коензим А десатурази-1, а також зменшувати активність коактиватора-1а^ рецептора, що активується проліфераторами пероксисом-у (PGC-1a/Я) [27]. З іншого боку, активація NF-kB стає можливою внаслідок індукованої ЦО зміни експресії генів циркадіанного осцилятора [1, 8]. Це викликає експресію низки генів, що кодують синтез прооксидантних протеїнів (мікросомальних монооксигеназ Cyp7b, Cyp2E1, Cyp2C11, ксантиноксидоредуктази, НАДФН-оксидази 2, iNOS, циклооксигенази 2, 5-ліпоксигенази тощо) [28]. NF-кВ-залежна продукція прозапальних цитоків також сприяє розвитку оксидативного стресу [28].

Застосування біофлавоноїдів, здатних пригнічувати NF-kB, виявила їхню здатність істотно обмежувати генерацію 'О 2 у тканинах печінки. Так, введення EGCG і кверцетину за умов експерименту вірогідно зменшувало у тканинах печінки продукцію ¦ О 2 мікросомальними монооксигеназами та NOS - на 39,1 та 40,1%, дихальним ланцюгом мітохондрій - на 37,2 та 34,4%, НАДФН-оксидазою лейкоцитів - на 35,0 та 32,1% порівняно з відповідними результатами контролю ІІ.

Таблиця 1

Вплив біофлавоноїдів на продукцію супероксидного аніон-радикала різними джерелами в тканинах печінки за умов цілодобового освітлення та призначення щурам вуглеводно-ліпідної дієти (M ± m)