Спектри жирних кислот актинобактерій з біологічних обростань Одеської затоки Чорного моря

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова

Спектри жирних кислот актинобактерій з біологічних обростань Одеської затоки Чорного моря

Н.В. Коротаєва, К.С. Потапенко, І.В. Страшнова,

І.П. Метеліцина, В.О. Іваниця

Мета. Визначення жирнокислотного складу актинобактерій, ізольованих з біологічних обростань Одеської затоки Чорного моря, та їх ідентифікація. Методи. Актинобактерії 31-го виділеного штаму вирощували у рідкому середовищі TSB за 28 °C та 150 об/хв упродовж 72 год. Метилові ефіри жирних кислот досліджуваних штамів визначали згідно MIS Operating Manual на газовому хроматографі Agilent 7890, ідентифікацію проводили з використанням системи ідентифікації мікроорганізмів MIDI Sherlock. Результати. За допомогою хроматографічного аналізу жирних кислот встановлено, що з 31 досліджуваного штаму актинобактерій 27 ідентифіковано до роду Streptomyces, а 4 - до роду Nocardiopsis. Встановлено, що у профілях досліджених актинобактерій роду Nocardiopsis переважали жирні кис- лоти:15:0 ANTEISO, 16:0 ISO, 17:0 ANTEISO,18:1 CIS 9, а у бактерій роду Streptomyces - 14:0 ISO, 15:0 ANTEISO, 16:0 ISO, 17:0 ANTEISO. Висновки. Актинобактерії з біологічних обростань Одеської затоки відносяться до родів Streptomyces та Nocardiopsis, а їх жирнокислотні профілі характеризуються перевагою ізомерів розгалужених насичених жирних кислот.

Ключові слова: жирнокислотні профілі, морські актинобактерії, Streptomyces, Nocardiopsis

N.V. Korotaeva, K.S. Potapenko, I.V. Strashnova, I. P. Metelitsyna, V.O. Ivanytsia

Odesa National I.I. Mechnykov University

THE COMPOSITION OF CELLULAR FATTY ACIDS OF ACTINOBACTERIA FROM THE SURFACES OF BIOLOGICAL GROWTH OF THE ODESA GULF OF THE BLACK SEA

Summary

Aim. Determination offatty acid composition of actinobacteria isolated from the surfaces of biological growth of the Odesa gulf of the Black Sea, and their identification. Methods. The 31 isolated strains of actinobacteria were grown in TSB at 28 ° C and 150 rpm for 72 hours. Fatty acid methyl esters of the studied strains were determined according to the MIS Operating Manual on a gas chromatograph Agilent 7890, identification was performed using the identification system of microorganisms MIDI Sherlock. Results. Using chromatographic analysis of fatty acids, it was found that of the 27 studied strains of actinobacteria were identified to the genus Streptomyces, and the 4 strains - to the genus Nocardiopsis. It was found that the fatty acid profiles of the studied actinobacteria of the genus Nocardiopsis were dominated by fatty acids: 15:0 ANTEISO, 16:0 ISO, 17:0 ANTEISO, 18:1 CIS 9, and the fatty acid profiles of bacteria of the genus Streptomyces - 14:0 ISO, 15:0ANTEISO, 16:0ISO, 17:0ANTEISO. Conclusions. Actinobacteria the surfaces of biological growth of the Odesa gulf of the Black Sea belong to the genera Streptomyces and Nocardiopsis, and their fatty acid profiles are characterized by the dominance of isomers of branched saturated fatty acids.

Key words: fatty acid profiles, marine actinobacteria, Streptomyces, Nocardi- opsis

Н.В. Коротаева, Е.С. Потапенко, И.В. Страшнова, И.П. Метелицына, В.А. Иваныця

Одесский национальный университет имени И.И. Мечникова

СПЕКТРЫ ЖИРНЫХ КИСЛОТ АКТИНОБАКТЕРИЙ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАСТАНИЙ ОДЕССКОГО ЗАЛИВА ЧЕРНОГО МОРЯ

Реферат

Цель. Определение жирнокислотного состава актинобактерий, изолированных из биологических обрастаний Одесского залива Черного моря, и их идентификация. Методы. Актинобактерии 31 выделенного штамма выращивали в жидкой среде TSB при 28 °C и 150 об/мин в течение 72 часов. Метиловые эфиры жирных кислот исследуемых штаммов определяли согласно MIS Operating Manual на газовом хроматографе Agilent 7890, идентификацию проводили с использованием системы идентификации микроорганизмов MIDI Sherlock. Результаты. С помощью хроматографического анализа жирных кислот установлено, что из 31 исследуемого штамма актинобактерий 27 идентифицировано как род Streptomyces, а 4 - как род Nocardiopsis. Установлено, что в профилях исследованных актинобактерий рода Nocardiopsis преобладали жирные кислоты: 15:0 ANTEISO, 16:0 ISO, 17:0 ANTEISO, 18:1 CIS 9, а бактерий рода Streptomyces - 14:0 ISO, 15:0 ANTEISO, 16:0 ISO, 17:0 ANTEISO. Выводы. Актинобактерии из биологических обрастаний Одесского залива относятся к родам Streptomyces и Nocardiopsis, а их жирнокислотные профили характеризуются преобладанием изомеров разветвленных насыщенных жирных кислот.

Ключевые слова: жирнокислотные профили, морские актинобактерии, Streptomyces, Nocardiopsis

Вступ

Морське середовище характеризується екстремальними умовами (високий тиск, висока солоність, зміни температури, обмежена доступність поживних речовин). Все це змушує морські організми адаптуватися до таких умов шляхом формування незвичайних для суходолу, отже, цікавих метаболічних шляхів [1, 2].

Морські актинобактерії відомі не тільки як джерела нових антибіотиків, а також метаболітів з протипухлинною активністю. Вони мають здатність до пригнічування утворення біоплівок стійкими до антибіотиків патогенами людини. Утворення біоплівок самими антинобактеріями сприяє розкладанню складних полімерів у навколишньому середовищі. Більшість морських актинобактерій є представниками видів роду Streptomyces і слугують багатим джерелом біологічно активних сполук, які широко досліджуються у всьому світі [1, 3, 4].

Аналіз жирнокислотного складу загальних клітинних ліпідів є важливою хемотаксономічною характеристикою, яка корелює з результатами ідентифікації за молекулярно-генетичними показниками [5, 6], та використовується для ідентифікації мікроорганізмів за допомогою бібліотек спектрів жирних кислот [7].

Актинобактерії за складом жирних кислот розділяють на два типи. До першого типу відносять види, у клітинах яких переважають жирні кислоти з розгалуженим ланцюгом, тоді як види другого типу демонструють значний відсоток насичених або мононенасичених жирних кислот з прямим ланцюгом [8].

Метою роботи було визначення складу жирних кислот актинобактерій, ізольованих з біологічних обростань Одеської затоки Чорного моря, та їх ідентифікація.

Матеріали і методи

Матеріалом дослідження слугували 31 штам актинобактерій, які виділили у 2020 році з біологічних обростань поверхонь бетонних споруд, природного черепашника, пластика, металу та води Одеської затоки Чорного моря.

Визначення метилових ефірів жирних кислот досліджуваних штамів проводили згідно MIS Operating Manual [9]. Для цього актинобактерії вирощували у 20 мл рідкого середовища Tryptic Soy Broth (Biolife, Italia) за 28±1 °C та 150 об/хв упродовж 72 год. Отриману рідку культуру пропускали через фільтри з розміром пор 0,45 мкм, близько 40 мг відділеної біомаси клітин переносили в скляні віали, оснащені кришками з тефлоновим покриттям для екстракції жирних кислот. Виділення та хроматографічне розділення жирних кислот здійснювали згідно стандартного протоколу. Лізис клітин та омилення ліпідів клітин мікроорганізмів здійснювали шляхом додавання одного мілілітра суміші 1,125 М розчину NaOH у метанолі при температурі 95-100 °C впродовж 30 хв. Подальше метилювання жирних кислот здійснювали додаванням кислого розчину (2 мл 6.0 N HCl у метанолі) при 80 °C впродовж 10 хв. Екстраговані метилові ефіри жирних кислот нейтралізували 0,3 М розчином NaOH [7].

Визначення жирнокислотного складу бактерій виконували методом хроматографії з використанням автоматичної системи ідентифікації мікроорганізмів MIDI Sherlock на базі газового хроматографа Agilent 7890 (Agilent Technologies, США), колонка капілярна ULTRA 2 (25 м x 0,2 мм x 0,33 мкм), детектор полумяно-йонізаційний. Пробу (2 мкл) вводили в режимі split з коефіцієнтом 40:1, температура випаровувача 250 °C. Розділення проводили в режимі програмування температури - початкова температура 170 °C з наступним градієнтом 5 °С/хв до 270 °C. Вміст жирних кислот виражали у відсотках до загальної суми площ піків. Для ідентифікації досліджуваних штамів використовували бібліотеку Sherlock Microbial Identification System (MIDI Sherlock version 6.2, MIDI Library ACTIN 3.80) [9].

Статистичний аналіз жирнокислотних профілів проводився за допомогою програмного забезпечення MIDI Library Generation System (Microbial ID, Inc., Newark, Del.). Ця програма використовує двовимірний кластерний аналіз. Спорідненість виражається в евклідовій відстані (EDs), як відстань у двовимірному просторі [10].

жирнокислотний актинобактерія ідентифікація мікроорганізм

Результати дослідження та їх обговорення

За допомогою бібліотеки MIDI Sherlock (ACTIN 3.80) штами актино- бактерій з біологічних обростань поверхонь бетонних споруд, природного черепашника, пластика, металу та води було попередньо ідентифіковано з різними індексами подібності до роду Streptomyces та Nocardiopsis. До роду Streptomyces віднесено 27 штамів, до роду Nocardiopsis - 4 штами (табл. 1).

Хроматографічний аналіз показав, що жирнокислотний склад клітин досліджених штамів актинобактерій роду Nocardiopsis містить ізомери насичених та ненасичених жирних кислот із загальною кількістю атомів вуглецю від 13 до 19 (табл. 2). У профілях досліджених штамів Nocardiopsis переважали жирні кислоти: 12-метилтетрадеканова кислота (від 6,83% до 10,36%), 14-метилпентадеканова кислота (від 1,79% до 36,71%), 14-метилгексадека- нова кислота (від 9,5% до 29,42%), 9Х-октадеценова кислота (від 12,17% до 16,39%).

Порівняно з іншими штамами відмінністю жирнокислотного профілю штаму Nocardiopsis sp. conc 29 переважала кількість загального відсотка (24,93%) пентадеканової кислоти 15:0, тоді як у інших штамів вона склала 0,31%, або не виявлялася зовсім.

Також встановлено, що для актинобактерій роду Nocardiopsis характерним є наявність вищих жирних кислот із загальною кількістю атомів вуглецю 18-19 (16-метилгептадеканова,(9Х)-октадеценова, октадеканова, 16-метилок- тадеканова та нонадеканова кислота).

Grund and Kroppenstedt показали, що бактерії роду Nocardiopsis характеризуються розгалуженими ізомерами насичених жирних кислот. Серед яких основними є 14-метилгептадеканова кислота (C16:0 ізо) і 14-метил- гексадеканова кислота (C17:0 anteiso). Також виявлено наявність у меншій кількості 10-метил розгалуженої туберкулостеаринової кислоти, тобто 10-ме- тилоктадеканової кислоти (C18:010-methyl), та її попередника ненасиченої цис-9,10-октадеценової кислоти (C18:1 cis) [11,12]. Такі особливості бактерій роду Nocardiopsis підтверджуються нашими дослідженнями.

Хроматографічний аналіз виявив, що жирнокислотний склад досліджених актинобактерій роду Streptomyces містить ізомери насичених та ненасичених жирних кислот із загальною кількістю атомів вуглецю від 10 до 17 (табл. 3).

Встановлено, що у спектрах жирних кислот бактерій роду Streptomyces переважали 12-метилтетрадеканова кислота (від 22,82% до 55,09), 14-метилпентадеканова кислота (4,77%-23,43%), 12-метилтридеканова кислота (0,39%-15,69%), 14-метилгексадеканова кислота (4,72%-17,4%), 13-метилтетрадеканова кислота (3,39%-17,46%).

Згідно з даними літератури профілі клітинних жирних кислот стрептоміцетів складаються переважно з 12-17 насичених жирних кислот з розгалуженим ланцюгом з ISO- та ANTEISO- положенням метильної групи. Метилові розгалужені жирні кислоти є маркерами актиноміцетів [11, 13, 14]. Майже усі штами містили невеликий відсоток 17:0 cyclo, що є корисним маркером для ідентифікації роду Streptomyces [8].

Таблиця 1 Ідентифікація актинобактерій за допомогою бібліотеки MIDI Sherlock

Table 1Identification of actinobacteria strains by the Sherlock MIDI library

Таблиця 2 Склад жирних кислот актинобактерій роду Nocardiopsis

Table 2 Cellular fatty acid (%) composition of strains of Nocardiopsis