Приготування поживних середовищ для культивування рослинних клітин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лабораторна робота № 1. Приготування поживних середовищ для культивування рослинних клітин

Мета. Ознайомитись із складом поживних середовищ, освоїти техніку їх приготування та стерилізації.

Завдання

1. Вплив мінеральних компонентів живильних середовищ на розвиток рослинних клітин.

2. Приготувати поживне середовище для індукції та росту калусної культури тютюну Nicotina plumbaginifolia

Біотехнологія - це наука, яка вивчає методи одержання корисних для людини речовин і продуктів в керованих умовах використовуючи мікроорганізми, клітини тваринних і рослинних організмів або біологічні структури клітин.

Біотехноломгія (ВйпфечнплпгЯб, від грец. bios - життя, techne - мистецтво, майстерність і logos - слово, навчання) - використання живих організмів і біологічних процесів у виробництві.

Біотехнологія - це застосування наукових та інженерних принципів для переробки речовин органічної та неорганічної природи біологічними агентами з метою отримання різних цінних продуктів та послуг.

Сучасний етап розвитку біотехнології пов'язаний з розробкою нових методів молекулярного клонування, клітинних технологій, їх впровадження в різноманітні напрямки біотехнології та проведення фундаментальних досліджень біологічних систем. Це пояснюється тим, що біологічні системи ефективно функціонують за умов невисокого тиску і температури, піддаються контролю і регулюванню їх активності. Вони компактні і не забруднюють довкілля завдяки тому, що можуть бути безвідходними. Крім того, певні організми здатні утилізувати різноманітні побічні продукти, що утворюються в процесі іншого виробництва.

Головним завданням біотехнології в агросфері є використання біологічних процесів, систем та організмів в різних галузях і, перш за все, в сільському господарстві, які сприяють його інтенсифікації і перетворенню у високоефективну, конкурентноздатну, екологічно безпечну галузь. Першочергового значення при цьому набувають питання покращання біотехнологічними методами існуючих і створення нових високопродуктивних сортів культурних рослин та одержання корисних штамів мікроорганізмів.

У рослин зустрічаються всі елементи періодичної системи Д.І. Менделєєва. Мінеральні елементи прийнято умовно підрозділяти на дві групи, залежно від потреби в них рослинного організму, а також відповідно до їх змісту: макро- і мікроелементи. До першої групи відносяться сім основних хімічних елементів, які рослини одержують із живильних середовищ. Вони необхідні для будь-якого рослинного організму і входять до складу всіх прописів і комплексних добрив: азот, кальцій, калій, фосфор, магній, сірка, кремній. Вуглець, водень і кисень рослини одержують із водної фази живильного середовища та повітря.

До групи мікроелементів відносяться незамінні хімічні елементи, які необхідні рослинам у кількості 0,01 % і менше (розраховуючи на суху масу). Роль більшості мікроелементів визначена їх участю в активних центрах ферментів, тому дефіцит того чи іншого хімічного елемента може негативно позначатись вже на самих ранніх етапах онтогенезу рослин

Макроелементи

Азот -- один з найважливіших елементів, необхідних для нормального росту і розвитку рослин. Азот входить до складу амінокислот (білків), нуклеїнових кислот, пігментів (хлорофіли), алкалоїдів, гормонів та інших органічних сполук. У живильних середовищах основними джерелами азоту є амонійні (NН 4 + ) і нітратні (N0 3 - ) форми, хоча відомо, що деякі культури можуть використовувати азот, який міститься в амінокислотах. Процеси розпаду азотовмісних сполук у рослинних клітинах завершуються утворенням аміаку, який реутилізується (повторно використовується рослиною).

При дефіциті азоту спостерігається хлороз листків, пригнічення росту й уповільнення загальних темпів розвитку рослини.

Фосфор. У рослинних тканинах фосфор входить до складу нуклеїнових кислот, білків, фосфоліпідів, фосфорних ефірів цукрів, нуклеотидів, фітину й інших сполук. Основна сполука, у вигляді якої запасається фосфор - фітинова (міо-інозитгексафосфорна) кислота. Крім органічної форми фосфор міститься у рослинних клітинах у вигляді ортофосфорної кислоти (Н3РО4) та її солей. з. Фосфор зазвичай додають до живильних середовищ у вигляді однозаміщених фосфату калію (КН 2 Р0 4 ) або фосфату натрію (NaН 2 Р0 4 ).

Калій -- головний потенціалоутворюючий іон в процесах електрогенезу рослинної клітини. Концентрація калію у вакуолі клітини (клітинний сік) значно вища, ніж в живильному середовищі. Тому в частинах рослин, безпосередньо контактуючих з живильним середовищем, функціонує потужна система іонних насосів, яка підтримує градієнт його концентрації на належному рівні. У тканинах рослин калій знаходиться в основному в іонній формі, має дуже високі рухливість і здатність до реутилізації. До складу живильних середовищ калій вносять у вигляді нітрату (КN03), фосфату (КН2Р04) або хлориду калію (КС1). При нестачі калію гальмуються процеси поділу й розтягнення клітин, що призводить до утворення розеткових форм рослин (Розетка -- це таке розташування листків у деяких рослин, коли стебло буває настільки укороченим, а листя розташовуються на ньому так близько один до одного, що міжвузля майже зовсім не розвиваються або тільки ледь помітні.)

Кальцій відіграє важливу роль у метаболізмі клітин, шляхом зв'язування побічних токсичних продуктів білкового обміну у вигляді солей щавлевої кислоти - оксалату кальцію (Са2С2О4). У формі пектинату кальцію входить до складу клітинних стінок (мембран), що підвищує їх проникність і сприяє транспорту вуглеводів і амінокислот по рослині. До складу живильних середовищ кальцій вводиться у вигляді хлориду кальцію (СаС12), нітрату кальцію (Са(N03)2) або складного фосфату кальцію (Са10(РО4)6(ОН)2).

При дефіциті кальцію різко зростає текучість мембран, що призводить до порушення процесів мембранного транспорту і біоелектрогенезу, відбуваються пригнічення процесів поділу і розтягнення клітин та коренеутворення.

Сірка вводиться до складу живильних середовищ у вигляді сульфатів різних елементів і поглинається кореневою системою рослин тільки в окисленій формі (у вигляді іона S04 2- ). В основному сірка транспортується в надземні, зелені частини рослин і підтримує нормальний розвиток кореневої системи. У рослинних тканинах сірка знаходиться як в окисленій, так і у відновленій формах. Сульфатгідрильні групи входять до складу амінокислот (цистин, цистеїн, метіонін), вітамінів (ліпоєва кислота, біотин, тіамін), ліпідів, коферменту А.

При відсутності сірки гальмуються процеси росту й розвитку рослин, фотосинтезу, синтезу білків та ін. Як і кальцій, сірка не реутилізується і може в значній кількості накопичуватись в старіючих частинах рослин.

Магній додають до живильних середовищ у вигляді сульфату (MgSО4 * 7Н2О). Магній входить до складу молекул хлорофілу, який надає зеленого забарвлення рослинам. У насінні більша частина магнію знаходиться у вигляді Участь магнію в процесі обміну речовин пов'язана з його здатністю регулювати роботу низки ферментів: він є кофактором майже всіх ферментів, які каталізують перенесення фосфатних груп, а також необхідний для функціональної діяльності ферментів гліколізу, циклу Кребса, спиртового й молочнокислого бродіння. При підвищеній концентрації магнію в рослинних клітинах активуються ферменти, які беруть участь в метаболізмі фосфату, що призводить до зростання вмісту в тканинах органічних і неорганічних сполук фосфору.

При його нестачі спостерігається хлороз (явище, яке зумовлене недостатнім виробленням хлорофілу в рослинах) листків.

Кремній в рослинних організмах використовується в основному як будівельний матеріал для клітинних стінок, забезпечуючи їх міцність і еластичність. Хоча кремній практично ніколи не вводиться до складу живильних середовищ, його відсутність може призводити до порушень в структурі органоїдів клітини.

Мікроелементи

Залізо бере участь у біосинтезі хлорофілу і функціонуванні основних елементів електрон-транспортних ланцюгів дихання і фотосинтезу при переході із тривалентної форми у двовалентну. Основна маса заліза запасається в хлоропластах у вигляді особливої форми фосфопротеїду - фітоферитину, який проявляє здатність до переміщення по рослині. При його нестачі на молодих листкових пластинках з'являються ознаки хлорозу, особливо між жилками листка. До складу живильних середовищ залізо зазвичай вносять у формі сульфату (FeSO4*7Н2O). Для оптимізації доступності заліза для рослин, його вводять разом з Na2ЕДТА (С10Н16N2О8Na2 * Н2O).

Мiдь. В живильні середовища мідь додають в основному у вигляді сульфату (CuSO4 * 5Н2О). Для більшості культур мідь необхідна в концентраціях 0,025-0,020 мг/л. Як і залізо, вона зв'язується з ферментами і бере участь в окиснювально-відновних перетвореннях обміну речовин. Майже половина міді, яка знаходиться в тканинах рослин концентрується в хлоропластах у вигляді пластоцианіну. Крім того, мідь входить до складу деяких рослинних ферментів (аскорбатоксидази, поліфенолоксидази, супероксиддисмутази, цитохром-оксидаза), бере участь у біосинтезі пігментів.

При нестачі міді знижується ефективність процесів дихання та фотосинтезу, порушується лігніфікація клітинних оболонок, уповільнюється ріст рослин і спостерігаються відхилення в їх морфологічному розвитку. Вони набувають темно-зеленого забарвлення із подальшим розвитком некрозів, хлорозу кінчиків листків, відмирання апексів пагонів і втрати тургору

Цинк додають до живильних середовищ у вигляді сульфату (ZnSO4 * 7Н2O). Як кофермент, бере участь в біосинтезі хлорофілів і деяких ауксинів, зокрема, триптофану - попередника ІОК.

Нестача цинку візуально проявляється в зміні кольору листкових пластинок (вони набувають жовтуватого відтінку) і порушенні нормального розвитку кореневої системи. Надлишок цинку токсичний для рослин.

Марганець входить до складу міжгранних і гранильних тилакоїдів (Спрощені вакуолі або мішечки, які знаходяться всередині хлоропластів листя та інших зелених частин рослин) мембран хлоропластів. В складі одного з поліпептидів бере участь у фотолізі води. Крім того, марганець є складовою частиною каталітичного центру ферменту супероксиддисмутази і сприяє детоксикації активних форм кисню. Відомо більше 30 ферментів, для активування яких необхідні іони Мn2+ . При нестачі марганцю істотно знижується виділення кисню в процесі фотосинтезу, пригнічується біосинтез вуглеводів у тканинах рослин, на листках між жилками з'являються ознаки хлорозу. У живильні середовища марганець додають у вигляді кристалогідрату сульфату (MnSO4 * Н2O).

Молібден надходить у рослини у вигляді аніона МоO4 2- і локалізується в молодих ростучих органах, особливо в надземній частині. В листках він знаходиться в основному в хлоропластах. Молібден бере безпосередню участь у процесах перетворення азоту в аміачні форми, які добре засвоюються рослинами, тому його іноді називають мікроелементом азотного обміну. При нестачі молібдену в тканинах рослин у великій кількості накопичуються нітрати. В живильні середовища для культури тканин додають молібдат натрію (Na2MoО4 * 2Н2O). Передозування цього мікроелемента в культурі in vitro може бути вкрай токсичним. При закисленні живильних середовищ доступність молібдену знижується, що може призводити до зміни морфології пагонів і пригнічувати їх ріст майже до повного припинення.

Бор - один з найважливіших мікроелементів. У рослинних тканинах перебуває у вільній формі сполук В(ОН)3, В(ОН)4 та у вигляді комплексів з органічними сполуками. Зокрема в клітинах зв'язується з полісахаридами клітинних стінок. На відміну від інших мікроелементів бор не є компонентом або активатором ферментів, проте бере участь у метаболізмі фенолів, вуглеводів, гормонів, нуклеїнових кислот, азотному та ауксиновому обмінах, у формуванні структури клітинних стінок, поділі клітин, регулює процеси росту й розвитку рослин, транспорту води, підсилює ріст пилкових трубок. Бор необхідний для дводольних рослин протягом всього процесу онтогенезу, тоді як для однодольних - головним чином в репродуктивну фазу. До культуральних середовищ додають у вигляді борної кислоти (Н3В03).

Дефіцит бору проявляється у відмиранні апікальних меристем, деформації та хлорозі листкових пластинок, порушенні анатомічної будови осьових органів рослин. Надлишок бору токсичний і може викликати загибель рослин.

Кобальт в рослинному організмі може перебувати в іонній формі і у вигляді порфіринової сполуки цианокобаламіну (вітамін В12). Рослини не проявляють здатності до синтезу вітаміну В12, тому кобальт вводять в живильні середовища екзогенно у вигляді кристалогідрату (СоСl2*6Н20). Симптоми нестачі кобальту подібні до симптомів азотного голодування.

Хлор засвоюється рослинами у невеликій кількості. До складу живильних середовищ хлор вводиться у вигляді хлориду кальцію (СаС12 * 2Н2О). Крім того хлор може потрапляти у вигляді домішок до інших мінеральних солей. Хлор необхідний для процесів фотосинтезу (фотолізу води) і підтримання нормального росту рослин, шляхом регулювання осмотичного тиску. Деякі культури рослин дуже чутливі до наявності іонів хлору в живильному середовищі. При дефіциті хлору листки в'януть, листкові пластинки жовтіють. Стійка нестача, як і надлишок цього елемента, є летальними для рослин. Йод додають до культуральних середовищ у вигляді йодиду калію (KI). Входить до складу деяких амінокислот.

Вуглеводневе живлення. Найбільш ефективним джерелом вуглецю для культур клітин і тканин рослин найчастіше слугує цукроза. Взаємоперетворення глюкози, фруктози й цукрози забезпечує залучення кожного із цих головних для росту ізольованих культур компонентів.

Виділено три основні аспекти використання вуглеводів у культурі рослинних тканин:

- якісний склад цукрів;

- кількість цукрів, що додають у живильні середовища;

- транспорт вуглеводів в рослині.

Регулятори росту.(гормони).

Вітаміни - це досить гетерогенна група органічних сполук, життєво необхідних для нормального росту і розвитку рослинних тканин, наявність яких у живильних середовищах є доцільною в невеликих кількостях. Відсутність одного або декількох вітамінів може істотно позначитись на розвитку рослинного організму. Вітаміни до живильних середовищ почали додавати практично після відкриття методу клонального мікророзмноження. Проте встановлення дози того або іншого вітаміну і його необхідності для певних видів культур виявилось досить проблематичним, оскільки для приготування середовищ використовували недостатньо очищені компоненти (вуглеводи, агар-агар), які містили слідові кількості тих або інших сполук, у тім числі й вітамінів.

Тіамін (вітамін В1; C12H17C1N4ОS) рекомендований для більшості культуральних середовищ, оскільки він функціонує у формі пірофосфату як кофермент циклу трикарбонових кислот (цикл Кребса). До складу середовищ вводять у вигляді хлоргідрату тіаміну в концентраціях 0,1-0,4 мг/л. Встановлено, що тіамін в рослинному організмі синтезується головним чином в листках і відноситься до світлозалежного процесу. Молекула тіаміну складається із двох компонентів: перший із них є залишком піримідину, другий - половиною молекули тіазолу.

Рибофлавін (вітамін В2, вітамін G; C17H20N4O6) - активізує вуглеводний обмін і є важливим компонентом для клітинного дихання. Подібно до інших водорозчинних вітамінів рибофлавін може синтезуватись в рослинах, особливо на початкових етапах розвитку насіння. При додаванні в живильні середовища проявляє стійкість до автоклавування, але легко руйнується на світлі.

Нікотинова кислота (вітамін В3, вітамін Р, вітамін РР; C6H5NО2) - універсальна сполука, яка широко зустрічається як у тваринних, так і в рослинних організмах. Нікотинова кислота є попередником синтезу багатьох необхідних сполук у метаболізмі рослин. Однією із важливих функцій нікотинової кислоти є участь в синтезі НАДФ і НАФ. Для багатьох рослин шляхи її метаболізму сполучені із триптофаном, який у рослинних організмах є попередником ІОК. Нікотинова кислота в системі обміну речовин входить до складу коферментів, схильних проявляти активність в анаболічних реакціях. Вітамін В3 додають до багатьох культуральних середовищ в концентраціях від 0,1 до 10 мг/л. При внесенні в живильне середовище екзогенної нікотинової кислоти спостерігається поліфункціональний ефект: в одних випадках - позитивний ефект, в інших - негативний.

Аденін (вітамін В4, 6-амінопурин; C5H5N5) - важливий для клітин рослин як складова частина нуклеїнових кислот (ДНК і РНК). У культурі тканин виявляє слабкий цитокініновий ефект. Зокрема, у концентрації 2-6 мг/л стимулює утворення вторинних протокормів у більшості тропікогенних орхідних. До складу живильних середовищ вводиться у вигляді сульфату аденіну (AdSO4; (C5H5N)2 * H2SO4 * 2Н2O) і використовується в основному як стимулятор адвентивного пагоноутворення.

D-пантотенова кислота (вітамін В5, C9H16NО5) - водорозчинний вітамін, який є частиною молекули коензиму А. Введення вітаміну В5 до складу культуральних середовищ не рекомендується на ранніх стадіях розвитку рослин-регенерантів, що зумовлено відсутністю ендогенних пантотенової кислоти і СоА. D-пантотенова кислота - це активний кофермент жирового обміну рослин. В середовища для культури рослинних тканин додається у вигляді солі кальцію ((С9Н16NO5)2Са) - термолабільної сполуки, яка вимагає проведення холодної стерилізації.

Піридоксин (вітамін В6, С8Н11NO3) також слугує коферментом деяких реакцій обміну речовин. До складу живильних середовищ зазвичай додається у формі хлоргідрату (С8Н11NO3 * НСl). Вітаміну В6 належить провідне місце в метаболізмі амінокислот.

Органічні компоненти середовищ.

Агар - суміш високомолекулярних полісахаридів з екстрактів декількох різновидів червоних водоростей. Складається із двох полісахаридів - агарози і агаропектину. Використовується для загущування рідких живильних середовищ, надаючи їм желеподібного стану.

Активоване вугілля часто додають до культуральних середовищ для укорінення на останньому етапі клонального мікророзмноження рослин

Гумат натрію активізує ферментативні процеси в рослині і підвищує проникність клітинних мембран.

Гідролізат казеїну - це суміш амінокислот, яка в культурі in vitro виконує функцію додаткового джерела органічного азоту.

Кукурудзяний екстракт (“corn steep water”) одержують як побічний продукт при виробництві кукурудзяного крохмалю і використовують в основному для культивування незрілих зародків кукурудзи.

Кукурудзяний крохмаль застосовується в культурі in vitro як частковий замінник агару сумісно із штучним замінником агару gelrite у пропорції 50,0 і 0,5 г відповідно на 1 л середовища. Картопляний екстракт з успіхом використовують для культивування деяких видів орхідних (Cymbidium, Laeliб) та Agrobacterium tumefaciens. Іноді його додають до живильних середовищ для ініції андрогенезу пиляків вищих рослин. Дріжджовий екстракт - природне джерело вітамінів. Препарат продається у вигляді порошку

Таким чином, аналізуючи дію рослинних екстрактів на ріст ізольованих тканин, можна зробити декілька загальних висновків:

- найбільшою стимулюючою дією характеризуються недозрілі ендосперми насіння низки рослин, що обумовлюється особливістю ролі ендосперму в процесі росту й розвитку зародку. Активність ендоспермів залежить від цілої системи речовин, які діють синергічно і визначають інтенсивність росту;

- екстракти із молодих ростучих органів і частин рослин проявляють, зазвичай, стимулюючий ефект, а екстракти із дозрілого насіння і органів, які перебувають в стані спокою, пригнічують ріст культури тканин;

- зміна складу активних метаболітів цілої рослини під впливом умов зовнішнього середовища (якості світла, інтенсивності освітлення, тривалості дня) визначає характер дії екстракту на ріст культури тканин;

- при вивченні механізму росту рослинної тканини і впливу на її метаболізм різних компонентів живильного середовища, небажано використовувати рослинні екстракти будь-якого походження, в зв'язку з великою невизначеністю їх складу.

Самостійна робота Написати коротку інформацію про такі живильні середовища Мурасіге Скуга - МС, Гамборг та співробітники - В5, Уайт - WH, Шенк та Хільдебранд - SH.

Середовище Мурасіге і Скуга - найбільш універсальне і багатоцільове середовище, яке сприйнятливе для рослинних клітин багатьох видів рослин. Дає позитивні результати при калюсоутворенні та підтриманні неорганізованого калюсного росту клітин і викликає індукцію морфогенезу у більшості дводольних видів рослин.

Гамборга та співробітники (середовище В-5) - використовується при культивуванні клітин і тканин бобових рослин і злаків.

Уайта WH - слугує для укорінення пагонів і нормального росту стеблової частини після регенерації.

Лабораторна робота № 2. Культивування тваринних клітин

клітина калусний дезагрегація культура

Мета заняття. Ознайомитися з технікою дезагрегації тканин м'язового мішка курячого ембріону 10-12 денної інкубації та поживними середовищами, які використовуються для одержання первинно-трипсинізованих культур клітин.

Завдання

1. Техніка дезагрегації.

2. Методика одержання первинно-трипсинізованої культури клітин із шкірно-м'язової тканини курячих ембріонів, що розвиваються.

Первинною культурою називають культуру клітин на стадії безпосередньо після виділення клітин і до першого посіву. Розглянемо 4 стадії:

1) отримання зразка;

2) виділення тканини;

3) препарування і / або дезагрегації і

4) культура після посіву в культуральну посудину.

Після виділення, первинна культура клітин може бути отримана як шляхом міграції клітин з фрагмента тканини і прикріплення їх до потрібного субстрату, так і при дезагрегації тканини (механічним шляхом або за допомогою ферментів) для отримання суспензії клітин, деякі з яких, в кінцевому підсумку, прикріпивши до субстрату. Для більшості нормальних трансформованих клітин, за винятком гематопоетичних, необхідно прикріплення до плоскої поверхні для виживання і максимально ефективної проліферації.

До ферментів, які найбільш часто використовують для дезагрегації тканини, відносяться неочищені препарати трипсину, коллагеназа, еластаза, проназа, діспаза, ДНКаза і гіалуронідаза, які використовують або окремо, або в різних комбінаціях, наприклад еластазу з ДНКаза для виділення альвеолярних клітин II типу, коллагеназу разом з діспазою і коллагеназу разом з гіалуронідазами . Інші ферменти, не тваринного походження, такі як Trypzean (Sigma) - рекомбінантний кукурудзяний трипсин, TrypLE (Invitrogen) - рекомбінантний трипсин, що продукується бактеріями і Ас-cutase і Accumax (Innovative Cell Technologies), також підходять для первинної дезагрегации.

Препарати грубої очистки часто більш ефективні, ніж очищені ферментні препарати, так як перші містять домішки інших протеаз, хоча останні зазвичай менш токсичні і їх дія більш специфічна.

Трипсин і проназа дають повнішу дезагрегацию, але можуть пошкоджувати клітини. З іншого боку, коллагеназа і діспаза дезагрегіруют клітини неповністю, але менш токсичні. Гиалуронидаза використовується в поєднанні з колагеназою для руйнування внутрішньоклітинного матриксу, а ДНКаза використовується для знищення ДНК.

Хоча для обробки кожної тканини може знадобитися своя послідовність дій, для більшості є деякі загальні вимоги:

1) Жир і некротичні тканини найкраще видаляти під час препарування.

2) Тканини слід дрібно нарізати гострим інструментом для того, щоб ушкодження були мінімальними.

3) Використані для дезагрегації ферменти повинні бути згодом видалені за допомогою м'якого центрифугування.

4) Концентрація клітин в первинній культурі повинна бути набагато вище, ніж зазвичай використовується при субкультивуванні, так як відсоток клітин, які виживуть в первинній культурі, може бути досить низьким.

5) Краще використовувати багаті середовища, такі як середовище Хема F12, а не прості, такі як МЕМ Голка. Для виділення специфічних типів клітин, ймовірно, будуть потрібні селективні середовища.

6) Дезагрегація ембріональних тканин проходить легше, ніж тканин дорослого організму, виживає більше клітин, і вони швидше починають пролиферировать.

Перед початком роботи з тканинами тварин або людини ви повинні бути впевнені, що ваша робота відповідає вимогам медичної етики або сучасним законодавчим нормам щодо експериментів з тваринами.

Клітини, ізольовані від тварини після народження, відносяться до зрілих. Чим більше їх вік, тим трудніше їх культивувати. Саме тому особливо перспективним є одержання культур з тканин ембріонів. Як правило, культури, отримані з ембріональних тканин, характеризуються кращим виживанням та більш активним ростом у порівнянні з культурами з відповідних дорослих тканин. Це відображає більш низький рівень спеціалізації та наявність стовбурових клітин в ембріонах. Серед ембріональних тканин найчастіше використовують ембріональні тканини курча, миші та людини. Особливо вигідними є курячі ембріони 10 -12 добового віку. Вони використовуються для культивування вірусів та виготовленню вірусних вакцин ще з 1931 р.

Курячі ембріони простіше препарувати, так як вони знаходяться на початковій стадії розвитку. Так само як і мишачі ембріони, курячі ембріони використовуються для отримання первинної культури мезенхімальних клітин для дослідження клітинної проліферації, для отримання клітин для фідерного шару і як субстрат для нарощування вірусу.

Через великого розміру у курячих ембріонів легше ізолювати індивідуальні органи для отримання специфічних типів клітин, таких як гепатоцити, кардіоміоцити і легеневий епітелій.

Методи і матеріали: шкірно-м'язова тканина курячого ембірону, фізіологічний розчин, трипсин чи версен (0,25%-ний розчин), відповідно підібране поживне середовище (199), ефір, йод, 70 %-ний етиловий спирт, колби, підставки під яйця, пінцети, ножиці, марля, голки, піпетки, матраци, пробірки, гумові пробки, гумові балони зі шлангом для піпеток, магнітна мішалка з магнітами, термостат, центрифуга на 10000 хв.-1, світловий мікроскоп, камера Горяєва, склянки з дез.розчином (5%-ний розчин хлораміну).

Хід роботи

1. Провести овоскопування 10-12 денних курячих ембріонів. Відібрати яйця з рухливими ембріонами та добре вираженими судинами. На шкарлупі простим олівцем відмітити границі повітряної камери та розташування зародка.

2. Поверхню шкарлупи протерти йодованим спиртом на обпалити. Стерильним ножицями зрізати шкарлупу на 2-3 мм вище границі повітряної камери, розірвати підшкарлупну та хоріоналантоїсну оболонку та за шийку виждати ембріон у стерильну чашку Петрі.

3. У ембріона видалити голову, кінцівки та внутрішні органи. Отриманий шкірно-м'язовий мішок промити фізіологічним розчином, перенести у нову стерильну чашку Петрі та подрібнити на шматочки 3-4 мм.

4. Подрібнену тканину 2-3 рази промити розчином Хенкса від слизу та кров'яних елементів до отримання прозорих зливних вод і перенести у колбу для трипсинізації.

5. У колбу додати розчин трипсину або версену (0,25%), підігрітого до 35-37°С (співвідношення тканини та ферменту 1:3), і сталять в термостат при 37°С на 30 хв. Після закінчення терміну інкубації фермент повністю злити. У колбу додають розчин ферменту з додаванням синтетичного поживного середовища (1:2), вносять стерильний магніт та ставлять на магнітну мішалку на 15 хв. (кількість поживного середовища та ферменту повинна бути такою, щоб тканина, яка осіла, була вкрита на 1,5-2 см).

6. Надосадову рідину (суспензію клітин у трипсині) профільтрувати крізь марлю і центрифугувати при 800 хв.-1 протягом 5 хв. До тканини, що залишилася у колбі, додати свіжу порцію поживного середовища без трипсину. Колбу з тканиною знову поставити на магнітну мішалку і т.п. Коли тканина в колбі втратить рожевий колір, шматочки розбухнуть та наберуть білястого відтінку (настане виснаження тканини), трипсинізацію припинити. До осаду додати певний об'єм поживного середовища (середовище 199) і відпіпетувати.

7. Зробити підрахунок клітин. До 1 мл завису клітин додати рівний об'єм трипанового синього, внести в камеру Горяєва і підрахувати кількість живих фібробластоподібних - заокруглених та прозорих (мертві клітини набувають синього забарвлення, а еритроцити, які не зараховуються при підрахунку, але мають характерну овальну форму). Підрахунок проводять за формулою наведеною в лабораторній роботі No 3 п.5.

8. Суспензію клітин розвести середовищем 199 (з додаванням сироватки ВРХ до 7-10%) до посівної концентрації 5-10 х105 кл/мл і вностять в культуральні флакони.

Успіх культивування клітин в значній мірі залежить від посівної дози. При малій кількості клітин не спостерігається утворення моно шару навіть при тривалому культивуванні. При дуже великій кількості клітин відбувається інтенсивна їх проліферація, і клітини, що формують моношар, значно раніше старіють та швидше спостерігається їх неспецифічна дегенерація.

Питання для самостійного опрацювання

1. Що таке дезагрегація, культури яких клітин використовують для цього процесу ? Поясніть чому.

2. Дайте визначення середовищу Хема F12. Назвіть його складові?

3. З чого складається середовище МЕМ Голка, для чого його використовують?

4. Первинна клітинна культура -- це перша культура, отримана безпосередньо з тваринної тканини за допомогою механічного та хімічного розпаду або ферментативних методів.

- Клітини первинної клітинної культури - це повільно зростаючі клітини, які несуть усі характеристики вихідної тканини або клітин.

- Оскільки ці культури отримані безпосередньо з джерела, вони мають таку ж кількість хромосом, як і вихідні клітини.

- Первинні клітинні культури проводяться з метою збереження і підтримки росту клітин на штучному живильному середовищі в певних умовах.

- Первинні клітинні культури можна пересівати для отримання інших культур, які або продовжують рости нескінченно довго, або гинуть після кількох пересаджень.

- Подальша субкультура первинної клітинної культури призводить до введення мутацій у клітини, що може призвести до клітинних ліній.

- Морфологія клітин у первинних клітинних культурах може бути різною та різноманітною, причому найбільш часто спостережуваними морфологічними структурами є епітеліальний тип, епітеліоїдний тип, тип фібробластів та тип сполучної тканини.

- Первинні клітинні культури важко отримати, і вони зазвичай мають коротший термін служби. Крім того, вони схильні до зараження бактеріями та вірусами.

- Збільшення кількості клітин у первинній культурі клітин може призвести до виснаження субстрату та поживних речовин, що впливає на клітинну активність.

- Зазвичай первинні клітинні культури необхідно пересівати, щоб підтримувати безперервний ріст клітин після того, як вони досягнуть стадії злиття

5. Для чого використовують у культивуванні тваринних клітин розчин ЄДТА (див. відео) https://youtu.be/jA9DKdx04Xg

Размещено на Allbest.ru