Выделение плазмидной ДНК из клеток бактерий

Размещено на http://www.allbest.ru

Выделение плазмидной ДНК из клеток бактерий



Цель работы: знакомство с методами выделения и рестрикционного анализа ДНК, получение экспериментальных навыков для конструирования и анализа рекомбинантных ДНК.

Для выполнения работы используются:

термостатируемый шейкер-инкубатор Exella E-24 «New Brunswick» (США) для выращивания клеточных культур;

система видеодокументирования гелей «Molecular Imager Gel Doc XR» производства «BioRad» (США) с трансиллюминатором;

микроцентрифуга для пробирок «Eppendorf» 5417R (США) c ротором для микропробирок 1,5-2,0 мл;

оборудование для горизонтального ДНК гель-электрофореза фирмы «BioRad» (США): источник постоянного тока «PowerPac HV Power Supply» и «Sub-Cell GT» камеры с заливочными столиками;

лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы «BioSan»; - охлаждаемый термостат модели КВ53 фирмы «Binder» (Германия).

Термостатируемый шейкер-инкубатор Exella E-24 «New Brunswick» (рис. 1) позволяет выращивать клеточные культуры в широком диапазоне температур и в различных объемах - от микробиологических пробирок на 2-5 мл до крупных колб 2,8 л. Ростовая камера плотно закрывается прозрачной акриловой крышкой, что позволяет непосредственно наблюдать за выращиваемыми образцами.

Рис. 1. Внешний вид термостатируемого шейкера-инкубатора Exella E-24 фирмы «New Brunswick»

Технические характеристики:

Диапазон температур инкубации - от 7 °С выше окружающей температуры до 60 °С.

Диапазон частот качания -50-400 раз/мин, ± 2.

Орбитальное качание - 1,9 см в диаметре.

Универсальный температурный контроль обеспечивается самокорректирующимся микропроцессорным контролем обратной связи и герметично сконструированной ростовой камерой. Высокоскоростной вентилятор обеспечивает быстрое восстановление температуры при перегреве.

Установка температуры и скорости осуществляется через контрольную панель.

Прозрачная крышка ростовой камеры позволяет непосредственно наблюдать за образцами и минимизировать количество открываний шейкера. Крышка легко поднимается, открывая удобный доступ к образцам.

RS-232 обеспечивает регистрацию и хранение данных о состоянии прибора.

Качание шейкера автоматически отключается при открывании крышки для защиты оператора.

Система безопасности термостата выключает нагрев при превышении установленного температурного лимита для защиты растущей культуры.

Система видеодокументации «Molecular Imager Gel Doc XR» производства «BioRad» (рис. 2) с трансиллюминатором позволяет осуществлять ряд работ по получению цифровых изображений результатов экспериментов: от рутинной документации гелей до высокочувствительной хемилюминесцентной детекции и регистрации с высоким разрешением двумерных гелей. Система имеет широкий ряд применений, в том числе: детекция нуклеиновых кислот, иммуноблоттинг, двумерный гель-электрофорез, дот-блоттинг, денситометрия, подсчет количества колоний.

Рис. 2. Внешний вид системы видеодокументирования «Molecular Imager Gel Doc XR» производства «BioRad»

Система «Molecular Imager Gel Doc XR» включает в себя темный кабинет с переключаемым держателем фильтров на 5 штук (один - желтый встроен по умолчанию), CCD видеокамеру, источники УФ и белого света, принтер, управляющий компьютер с программным обеспечением «Quantity One» для захвата и обработки изображений. Конверсионный экран «XcitaBlue» для ДНК-имиджинга в комплекте предотвращает образцы ДНК и пользователя от УФ-облучения.

Технические характеристики

Черно-белая 12-битная (4096 оттенков серого) CCD видеокамера с 1360х1024 мкм матрицей и разрешением 1,4 мегапиксела. Размер пиксела 4,6х4,6 мкм.

Широкой динамический ряд видеодетекции, покрывающий более 3 порядков.

Видеокамера с автоматическим моторизованным увеличением 8,5-51 мм и цифровой обратной связью для воспроизводимости условий документирования.

Отображение на экране в реальном времени для быстрого позиционирования и фокусирования образца.

Для освещения используется проходящий УФ-свет, проходящий и отраженный белый свет.

Встроенный трансиллюминатор с переключаемым 254, 302 и 365 нм УФ-излучением. Зона трансиллюминации 25х26 см.

5-позиционный держатель эмиссионных фильтров с одним встроенным (желтый), возможно встраивание дополнительных 4-эмиссионных фильтров в зависимости от потребностей.

Программное управление источниками освещения.

Программное обеспечение совместимо с Windows и MAC OS. Размеры системы - 60х36х96 см, вес - 32 кг.

Микроцентрифуга «Eppendorf» 5417R (рис. 3) c ротором для микропробирок, укомплектованная аэрозолезащищенным угловым 30-позиционным ротором для микропробирок позволяет центрифугировать любые образцы в микропробирках 0,2-2,0 мл на разнообразных режимах с переменным ускорением до 20800 g. Характеризуется большой мощностью, малым временем разгона и остановки, большим центростремительным ускорением. Имеет режимы медленного и быстрого замораживания, работает в диапазоне температур от -9 °С до 40 °С. Функция охлаждения позволяет быстро охлаждать образцы до 4 °С примерно за 15 мин, и постоянно поддерживать эту температуру в течение времени центрифугирования при максимальной скорости вращения. Возможна доукомплектация другими роторами, например, бакет-ротором или ротором для стрипов.

Рис. 3. Охлаждаемая микроцентрифуга 5417R c ротором для микропробирок фирмы «Eppendorf»

Технические характеристики

Удобная мембранная клавиатура для установки режимов центрифугирования. Параметры можно менять в процессе работы центрифуги.

Максимальная скорость вращения - 16400 об/мин (от 500 об/мин до максимального значения с инкрементом 100 об/мин).

Установление показаний вращения в единицах об/мин или в единицах g.

Максимальное ускорение (rcf) около 25000 g (в соответствии с DIN 58970), для 30-позиционного углового ротора - 14 000 об/мин (20800 g).

Быстрый разгон и торможение даже при полностью заполненном роторе. Время разгона до максимальной скорости около 10 с, время торможения с максимальной скорости около 11 с (с 30-позиционным угловым ротором).

Режим «Soft» для более мягкого разгона и торможения.

Встроенный таймер до 99 мин с возможностью непрерывного центрифугирования.

Функция кратковременного центрифугирования с выбранной скоростью вращения.

Все элементы съемные: роторы, крышки, адаптеры могут автоклавироваться в течение 20 мин при 121 °С.

Габариты - 31х60х25 см, вес - (без ротора) 35 кг.

Потребляемая мощность - 700 W, питание - 230V/50-60 Hz.

Оборудование для горизонтального гель-электорфореза: источник постоянного тока «Power Pac HV Power Supply» и «Sub-Cell GT» камеры с заливочными столиками фирмы «BioRad» (рис. 4) предназначено для проведения горизонтального электрофореза в гелях агарозы различного размера при анализе нуклеиновых кислот.

Рис. 4. Внешний вид оборудования для гель-электрофореза ДНК фирмы «BioRad»: источник питания, заливочный столик и камеры

Включает в себя удобный столик для заливки гелей, УФ-прозрачные подложки для гелей, гребенки различных форматов для формирования лунок. Прграммируемый источник постоянного тока «Power Pac HV Power Supply» способен поддерживать ток до 5000 В, 500 мА и 400 Вт, что позволяет использовать его для всех высоковольтных методов, включая низкотоковые в микроамперном диапазоне. Кроме горизонтального ДНК-электрофореза может быть использован также в ряде других методов, включая SDS-электрофорез белков, изоэлектрическое фокусирование, ДНК-секвенирование и др.

Технические характеристики э/ф камер

Размер подложки для гелей 7х10 см для камеры «Mini-Sub Cell GT» позволяет внедрять два ряда гребенок в гель для увеличения количества анализируемых образцов - от 1 до 30.

Размер подложки для гелей 15х25 для камеры «Sub-Cell GT» позволяет внедрять четыре ряда гребенок в гель для увеличения количества анализируемых образцов - от 1 до 120.

Объем электрофорезного буфера равен ~270 мл для камеры «Mini-Sub Cell GT» и ~1 л для камеры «Sub-Cell GT».

Технические характеристики источника питания для электрофореза «PowerPac HV Power Supply»:

Способен поддерживать постоянный ток в диапазонах 20-5000 В, 0,01-500 мА, 1-400 Вт.

Возможно подключение до 4 камер одновременно.

Программируемый источник питания позволяет осуществлять многоступенчатые методы, процессы с изменяемыми параметрами при постоянном токе, при постоянном напряжении, постоянной мощности или постоянной температуре.

Рис. 5. Внешний вид шейкера-вортекса фирмы «BioSan»

Лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы «BioSan» (Латвия) (рис. 5) предназначен для перемешивания растворов и суспензий клеток в любых пробирках. Имеет два режима работы - непрерывный и импульсный. Импульсный режим включается при касании пробиркой головки вортекса.

Технические характеристики

Диапазон регулирования скорости - 250-3000 об./мин.

Предназначен для пробирок объемом 1,5-50 мл.

Максимальный объём перемешивания - 30 мл.

Питание от внешнего блока DC - 12 В, 500 мA.

Вес не более 1,1 кг.

Размеры - 90x150x80 мм.

Охлаждаемый термостат КВ53 фирмы «Binder» (Германия), объемом 53 л (рис. 6) предназначен для инкубации разнообразных образцов при различных температурах - от -10 °C до 100 °C с высокой точностью.

Рис. 6. Термостат КВ53 фирмы «Binder» (Германия)

Технические характеристики

Регулируемый диапазон температур - от -10 °C до 100 °C с точностью ±0,3 °С.

Микропроцессорный контроль многочисленных временных и температурных функций осуществляется с ЖК-дисплея с визуальной и акустической сигнализацией.

Интерфейс RS 422 для принтера или компьютера.

Мощная запатентованная система охлаждения DCT®. Обеспечивает надежность поддержания температур без образования конденсата.

Не наносящий вреда окружающей среде охладитель R134a.

Абсолютная воспроизводимость условий инкубации и размножения.

Программируемая (от 0 до 100 %) принудительная конвекция (вентилятор).

Вытяжное устройство с заслонкой для сушки.

Вспененная изоляция, не содержащая хлорфторуглеродов.

Внутренняя стеклянная дверь, две полки с возможностью установки четырех.

Многофункциональный таймер от 0 до 99 ч 59 мин.

Размеры камеры ШxВxГ см - 40x40x33, объем - 53 л.

Габариты ШxВxГ см - 64x84x58, масса - 72 кг.

Мощность - 460 Вт.

Методы выделения плазмид основываются на уникальных свойствах (термостабильность, химическая устойчивость) суперспирализованных молекул ДНК. Условия подбирают таким образом, чтобы денатурировать хромосомную ДНК и РНК клеток. Для этого клеточный лизат либо кратковременно нагревают до 100°С, либо обрабатывают щелочным раствором (рН 12,5). При последующей ренатурации в результате охлаждения или нейтрализации раствора суперспирализованная плазмидная ДНК полностью восстанавливает исходную структуру, а различные участки длинных цепей хромосомной ДНК частично ренатурируют случайным образом, образуя крупный осадок в комплексе с белками и детергентом, который осаждают последующим центрифугированием. Суперспирализованная плазмидная ДНК остается в растворе; ее обычно осаждают изопропиловым или этиловым спиртом и в случае необходимости подвергают дальнейшей очистке. плазмидная клетка рекомбинантный

Успех выделения во многом зависит от правильного выращивания культуры клеток, содержащих плазмиды - если плазмид в клетках мало, даже самое тщательное выполнение методики не даст удовлетворительного результата. Для этого нужно представлять, что происходит с бактериальной плазмидсодержащей культурой в различных фазах ее роста. Как правило, содержание плазмид в клетке оказывается максимальным в самом начале стационарной фазы роста. При дальнейшем культивировании в популяции накапливаются бесплазмидные клетки, и выход плазмидной ДНК из таких культур снижается. В логарифмической фазе роста бесплазмидных клеток обычно нет, но число копий плазмиды на единицу биомассы меньше, кроме того, препараты, выделенные из логарифмических культур, содержат очень большое количество РНК и белка, поэтому плазмидную ДНК из таких культур всегда значительно сложнее качественно очистить. Ни в коем случае нельзя выращивать плазмидсодержащие клетки без селекции на поддержание плазмиды - большинство плазмид в той или иной степени нестабильны и могут легко утрачиваться при снятии селекции. Наконец, на выход плазмид существенное влияние оказывает среда культивирования. Так, например, повышение концентрации хлорида натрия в стандартном LB-бульоне с 5 до 10 г/л увеличивает выход плазмидной ДНК примерно на 30%. Еще один важный момент - выбор штамма для наработки плазмидной ДНК. Желательно выделять плазмиду из endA штаммов E. coli, дефектных по гену эндонуклеазы. Приводимая ниже методика не убирает полностью белки, в том числе и эндонуклеазы, из препарата ДНК, в результате чего ДНК, выделенная этим методом из endA+ штаммов, получается низкого качества и может быстро разрушаться при хранении. Ряд других мутаций, таких как recA, также повышают качество плазмидной ДНК. Стабильно хорошего качества ДНК выделяется из штаммов XL1-Blue и DH5a, которые также хорошо использовать и для трансформации.

Mетод щелочного лизиса

Наиболее надежным способом выделения плазмидной ДНК является метод щелочного лизиса. Метод довольно прост, но позволяет быстро получить плазмидную ДНК, пригодную для большинства ферментативных реакций. Для особенно чувствительных к примесям реакций (например, для секвенирования) полученную этим методом ДНК следует дополнительно очистить, например экстракцией фенолом/хлороформом.

Методом щелочного лизиса хорошо выделяются относительно небольшие (до 10-15

т.н.п.) плазмиды, с меньшим выходом можно выделить более крупные (до 20-30 т.н.п) плазмиды.

Ход работы.

5 мл LB-бульона с соответствующим антибиотиком инокулировать при помощи бактериальной петли одиночной небольшой колонией плазмидосодержащей культуры, пересеянной не позже чем 7 дней назад. Выращивать с интенсивной аэрацией до ранней стационарной фазы (обычно 8-14 часов).

Объемом бульона не должен превышать 1/5 всего объёма колбы, иначе культура будет медленнее нарастать из-за недостаточной аэрации.

Культуру осадить центрифугированием, полностью слить надосадочную жидкость, аосадок ресуспендировать в 200 мкл 25мM Tris-HCl/50мM EDTA pH 8.0 (или ТЕ буфере) и перенести в пробирку типа "Эппендорф" объемом 1.5 мл.

Замороженные (-20°С) в ТЕ буфере бактериальные клетки могут храниться довольно долго, поэтому дальнейшее выделение плазмидной ДНК можно выполнять через несколько суток.

Добавить 400 мкл лизирующей смеси (0.2M NaOH/1%SDS ? в пересчёте на 1мл: 860мкл H2O + 100мкл 10% SDS + 40мкл 5M NaOH - смешивать в указанном порядке!!!), раствор перемешать переворачиванием пробирки 3-4 раза. Не трясти!!!

На этом этапе происходит лизис бактерий и щелочная денатурация ДНК. Для полного лизиса требуется хорошо смешать бактериальную суспензию с лизирующим раствором, однако слишком интенсивное смешивание грозит дроблением геномной ДНК, фрагменты которой могут остаться в плазмидном препарате (см. рис. 2). Смесь NaOH/ SDS должна быть свежеприготовленной или храниться в пластмассовой герметичнозакрытой ёмкости (при хранении щелочь со временем нейтрализуется углекислотой из воздуха, а также щелочь растворяет стекло)

Выдержать смесь до полного лизиса клеток (заметен по значительному снижению мутности раствора). Иногда лизис заметен сразу, иногда через 1-2 минуты, но ни в коем случае нельзя держать смесь на этой стадии дольше, чем 5 минут.

Превышение времени денатурации чревато тем, что плазмида денатурирует необратимо - одна цепь ДНК сдвинется относительно другой так далеко, что достигнет локально устойчивого состояния (см. рис. 1). Необратимо денатурированные плазмиды вполне годятся для сиквенса, но не режутся рестриктазами и обладают аномальной подвижностью на электрофорезе (см. рис. 2).

Рис.1. двухцепочечная плазмида обратимая денатурация необратимая денатурация

Добавить 300 мкл охлажденного до 0°С 5M ацетата калия (или 3M ацетата натрия, pH 4.8), раствор перемешать нерезким переворачиванием пробирки 4-6 раза.

Нейтрализация раствора и ренатурация ДНК. Геномная ДНК случайно регибридизуется образуя большие сети, кольцевая плазмидная ДНК благополучно ренатурирует. Белки с SDS агрегируют при высокой концентрации соли (на холоду это получается лучше, поэтому можно на некоторое время поместить пробирки на лёд(0°С)).

Центрифугировать при максимальных оборотах в микроцентрифуге в течение 5-10 мин. Супернатант перенести в чистую пробирку, добавить 0,6 объёма охлажденного до 20°С изопропанола. Далее желательно выдержать 15-30 мин. при -20°С.

!!!Величина 0,6 объёма означает, что к супернатанту равного по объёму Х, добавляют Х*0,6 объёма изопропанола!!!

В этой методике процедуру можно прервать на любой стадии осаждения нуклеиновых кислот (после добавления спирта), оставив препарат при -20 С на неопределённое время.

Следует учитывать тот факт, что при увеличении времени нахождения при -20, начинают осаждаться и меньшие фрагменты ДНК и РНК (менее 1000 н.п.)

Центрифугировать при максимальных оборотах в микроцентрифуге 5 мин. Тщательно слить надосадочную жидкость. Центрифугировать ещё раз 5-10 сек и отобрать остатки изопропанола дозатором. Осадок ресуспендировать и растворить в 100 мкл буфера TE.

ДНК будет плохо растворяться, если оставить много изопропанола или пересушить осадок, поэтому осадок должен остаться чуть влажным, но капель изопропанола на стенке пробирки видно быть не должно.

Если осадок не растворяется - добавьте ещё ТЕ буфера.

Добавить 0,5 объёма 8M ацетата аммония, перемешать и выдержать смесь 30 минут при 0°С.

В осадок выпадает большая часть рибосомной РНК. В высокой соли одноцепочечная РНК образует большие ассоциаты за счет случайной гибридизации и не растворяется. Однако тРНК (видимо, из-за легкости образования внутримолекулярных двухцепочечных участков) сравнительно легко растворяется в высокой соли. Если требуется устранить и её, нужна дополнительная обработка РНКазой. На этой стадии в осадок также попадает некоторая часть оставшегося в препарате белка.

На данной стадии также можно прерваться (+4°С, несколько суток).

Центрифугировать при максимальных оборотах в микроцентрифуге 3-5 мин.

Супернатант перенести в чистую пробирку, добавить к нему 2 объёма охлажденного до 20°С этанола (96%) и перемешать. Далее желательно выдержать 30 мин. при -20°С и осадить ДНК центрифугированием в течение 5 минут.

К осадку добавить 200 мкл охлажденного до -20°С 70% этанола, центрифугировать5 мин.

Осторожно слить из пробирки жидкость (желательно отобрать дозатором), осадок подсушить и ресуспендировать в 50-100 мкл буфера ТЕ.

Полученный препарат содержит довольно много РНК. РНК не мешает большинству манипуляций с ДНК и к тому же стабилизирует малоочищенные препараты ДНК при хранении. Однако присутствие РНК может маскировать мелкие (500 и менее нуклеотидных пар) фрагменты ДНК при электрофорезе. Если это является проблемой, можно добавить к препарату РНКазу из рассчета 0.5 мкл р-ра РНКазы А (10 мг/мл) на 100 мкл р-ра ДНК. При последующей постановке рестрикции с таким препаратом РНКаза будет работать параллельно с рестриктазой, и РНК на форезе видно не будет.

Описанная выше методика может быть легко адаптирована для выделения ДНК из больших или меньших объемов культуры. При увеличении объема культуры объемы растворов в пунктах 2-5 увеличиваются пропорционально, a oсадок ДНК в п.7 растворяется в минимально возможном объеме буфера TE с соответствующим пропорциональным изменением объемов последующих растворов.

В тех случаях, когда необходимо быстро получить большое количество минипрепаратов высококопийных плазмид (pUC18), например, для скрининга предполагаемых рекомбинантов, методику можно несколько упростить и ускорить. В этом случае достаточно выделить ДНК из 1.5 мл культуры, уменьшив объемы растворов в п. 2-7 в 2 раза, а п. 8-11 не выполнять. 1-3 мкл полученного препарата обычно хватает для постановки рестрикции, а степень очистки препарата достаточна для работы многих (но не всех!) рестриктаз.

Размещено на http://www.allbest.ru

Рис.2. Фотография агарозного геля в УФ-лучах.

электрофорез плазмиды, выделенной с помощью щелочного лизиса.

тот же препарат плазмидной ДНК, но обработанный рестриктазой,

которая имеет в пределах данной плазмиды только один сайт рестрикции. Суперскрученная и релаксированная формы плазмиды перешли в линейнуя форму. Необратимо-денатурированная форма плазмиды не порезалась рестриктазой.

молекулярный ДНК-маркер

свечение в области лунки создают высокомолекулярные вещества (белок/ДНК) застрявшие на "старте", следовательно - препарат недостаточно чист (сравните лунки №1-2 с №3) фрагменты геномной ДНК.

релаксированная форма плазмидной ДНК. Имеет меньшую подвижность по сравнению с резаной плазмидой (сравните доржки №1 и №2).

суперскрученная форма плазмидной ДНК. Имеет большую подвижность по сравнению с резаной плазмидой (сравните дорожки №1 и №2).

необратимо-денатурированная форма плазмидной ДНК. Имеет большую подвижность по сравнению с суперскрученной формой плазмидной ДНК.

более тёмный участок геля из-из красителя (бромфеноловый синий), который входит в состав загрузочного буфера для ДНК электрофореза.

10 - РНК

Размещено на Allbest.ru

...