Основы биотехнологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Технология приготовления питательных сред для биосинтеза

Питательная среда - вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов. Существует множество стандартных биологических питательных сред.

Требования, предъявляемые к средам быть питательными, то есть содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста - витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать, иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - pH, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

Процесс приготовления питательных сред включает выбор элементов питания, необходимых продуцентам БАВ для их воспроизводства и биотрансформации.

Подбор компонентов таких сред осуществляется эмпирически и требует много времени и навыков при оценке того или иного компонента субстрата.

В элементарный состав питательной среды входят: углерод, водород, кислород, азот, фосфор, сера, калий, кальций, магний, железо, микроэлементы. Некоторым продуцентам БАВ в процессе биосинтеза требуются витамины и регуляторы роста.

По своему назначению питательные среды делятся на диагностические и производственные.

Диагностические питательные среды предназначены для обнаружения, выделения и идентификации патогенных микроорганизмов по морфологическим и физиологическим признакам. Они подразделяются на элективные среды, среды для консервирования, среды обогащения и дифференциально-диагностические.

Элективные среды служат для посева тест-штамма для получения чистой культуры.

Среды обогащения - накопление одной группы микроорганизмов при одновременной задержке роста сопутствующих микроорганизмов.

Дифференциально-диагностические среды предназначены для идентификации отдельных видов микроорганизмов в целях их получения.

Производственные среды по составу можно разделить на две группы:

натуральные среды (неопределенного состава) и синтетические.

Натуральные среды состоят из природных соединений, продуктов

животного или растительного происхождения. В них имеются все

необходимые компоненты для роста и развития микроорганизмов. Однако

из-за сложного неопределенного химического состава трудно оценить

влияние отдельных компонентов на механизм биосинтеза БАВ. В

промышленности натуральные среды используют для поддержания

организмов, накопления биомассы, диагностических целей.

Синтетические среды удобны для изучения обмена веществ.

Благодаря сложной ферментативной организации микроорганизмов из

простых составляющих осуществляется биосинтез сложных БАВ.

Отделения приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, средствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов, суспензий или эмульсий. При этом питательные соли хранятся обычно в твердом виде, а приготовление их смеси с заданным соотношением компонентов производится в аппарате с мешалкой, куда подаются твердые компоненты в необходимом количестве и далее происходит их растворение. Иногда соединяются и перемешиваются заранее приготовленные растворы. Жидкие и твердые источники углерода обычно вводят в уже готовую питательную среду непосредственно перед ферментацией, так как это устраняет опасность заражения посторонней микрофлорой, вероятность которого возрастает при хранении готовой питательной смеси.

1. Термическая стерилизация - прогревание среды при высоких температурах, когда большинство микроорганизмов погибают. Для большинства микроорганизмов достаточным оказывается кипячение среды (~100 о. С). Обычно среду прогревают при более высокой температуре, для чего нагревание проводят при повышенном давлении (3- 5 атм).

Пастеризация как вариант термической стерилизации. Используют для уничтожения спорообразующих микроорганизмов.

2. Стерилизация фильтрацией - щадящие методы стерилизации. Часто в качестве фильтров используют:

- неглазурованные фарфоровые фильтры (свечи Шамберлана);

- фильтр Беркефельда (из прессованного кизельгура);

- асбестовые пластины; стеклянные фильтры;

- Мембранные фильтры

3. Лучевая стерилизация - облучение УФ-светом, рентгеновскими и - лучами.

4. Химическая стерилизация - обработка - пропиолактоном, окисью этилена, смесью ОБ (смесь оксида этилена и бромистого метила и др.)

Система биотехнологического процесса

Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.

Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит.

На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.

Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными. Далее приводится характеристики каждой из стадий промышленного микробиологического синтеза.

2. Требования к биотехнологическому производству по GMP

Внутрипроизводственный контроль необходимо, как правило, распространить на следующее:

1) поддержание рабочего банка клеток (при наличии);

2) правильный посев и рост культуры;

3) контроль критических рабочих параметров во время культивирования клеток или ферментации;

4) контроль процесса роста клеток, их жизнеспособности (для большинства процессов культивирования клеток) и продуктивности (при необходимости);

5) процедуры сбора и очистки, при которых происходит удаление клеток, клеточных остатков и компонентов сред с одновременной защитой промежуточной продукции или АФС от контаминации (особенно контаминации микробиологической природы) и ухудшения качества;

6) контроль бионагрузки и уровней эндотоксинов на соответствующих стадиях технологического процесса (при необходимости);

7) вопросы вирусной безопасности в соответствии с законодательством.

3. В общем виде любой биотехнологический процесс включает три основные стадии:

1) На предферментационной стадии осуществляют хранение и подготовку культуры продуцента (инокулята), получение и подготовку питательных субстратов и сред, ферментационной аппаратуры, технологической и рециркулируемой воды и воздуха. Поддержание и подготовка чистой культуры является очень важным моментом предферментационной стадии, так как продуцент, его физиолого-биохимические характеристики и свойства определяют эффективность всего биотехнологического процесса.

Приготовление питательных сред осуществляется в специальных реакторах, оборудованных мешалками. В зависимости от растворимости и совместимости компонентов сред могут быть применены отдельные реакторы. Технология приготовления сред значительно усложняется, если в их состав входят нерастворимые компоненты.

Транспорт веществ осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами. Сыпучие компоненты подают в ферментеры с помощью вакуумных насосов.

Подготовительные стадии служат для приготовления и подготовки необходимых видов сырья биотехнологической стадии.

2) стадия ферментации:

Является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, эндо- и экзопродуктов).

Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (ферментере) и может быть организована в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта различными способами. Ферментация может проходить в строго асептических условиях и без соблюдения правил стерильности (так называемая незащищенная ферментация); на жидких и на твердых средах; анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация, в свою очередь, может протекать поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды).

Культивирование биологических объектов может осуществляться в периодическом и проточном режимах, полунепрерывно с подпиткой субстратом.

При периодическом способе культивирования ферментер заполняется исходной питательной средой и инокулятом микроорганизмов. В течение определенного периода времени в аппарате происходит взаимодействие микроорганизмов и субстрат, сопровождающееся образованием в культуре продукта.

3) Постферментационная стадия

Обеспечивает получение готовой товарной продукции и также, что не менее важно, обезвреживание отходов и побочных продуктов. В зависимости от локализации конечного продукта (клетка или культуральная жидкость) и его природы на постферментационной стадии применяют различную аппаратуру и методы выделения и очистки. Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках.

Первым этапом постферментационной стадии является фракционирование культуральной жидкости и отделение взвешенной фазы - биомассы.

4. Биореакторы (ферментеры). Связывающие ферменты

Культивирование микроорганизмов - наиболее продолжительная и тонкая стадия биотехнологического производства, в наибольшей степени определяющая его количественные и качественные показатели.

Культивирование микроорганизмов - основано на взаимодействии трех фаз: твердой, жидкой и газообразной.

Виды культивирования микроорганизмов:

? жидкофазное (поверхностное, глубинное);

? твердофазное (поверхностное).

Микроорганизмы растут в питательной среде, из которой получают всё необходимое для размножения. Дополнительным «продуктом питания» может быть кислород, подаваемый при помощи сжатого воздуха.

Температура не должна изменяться более чем на 10C в одну или другую сторону. Среда должна быть кислой ровно настолько, насколько это нравится микроорганизмам, и никаких отклонений. Чем больше зародилось микроорганизмов, тем больше им нужно кислорода. Кроме того, биореактор должен быть надёжно закрыт для внешнего мира.

Поэтому нужно позаботиться о том, чтобы всё было герметично закрыто.

Биореактор - это устройство, в котором создаются необходимые для размножения микроорганизмов условия. При размножении их количество может достигать миллиона клеток на миллилитр среды.

Задача биореактора состоит в обеспечении оптимальных условий для роста культивируемых биообъектов и биосинтеза целевого продукта при соблюдении условий стерильности и экономичности процесса.

Отдельной задачей является перемешивание вязких жидкостей.

Устройство биореакторов - это герметичные цилиндрические емкости, объемом 0,05-200 м³.

В биореакторе устанавливают мешалки турбинного, пропеллерного или иного типа.

Для поддержания температуры в системе биореактора является двойной кожух или теплообменник по типу змеевика.

Кроме этого, устройство биореактора имеет трубопроводы для подвода питательной среды, воды, пара, воздуха, пеногасителей и других веществ.

Для контроля и регулирования процессов биосинтеза устройства биоректоров оборудованы измерительными и регулирующими устройствами: измерение температуры, рН, обороты мешалки, уровня пены, концентрации биомассы и др.

Общая схема микробиологического производства состоит из следующих основных этапов:

1. Подготовка питательной среды.

2. Получение чистых штаммов для внесения в ферментер.

3. Ферментация - основной этап биотехнологического процесса.

4. Выделение и очистка конечного продукта.

5. Получение товарных форм продукта.

Модель ферментов «замок-ключ» утверждает, что ферменты связывают определенные молекулы и осуществляют реакции с этими молекулами. Фермент распознает форму своего субстрата и способен удерживать его в том положении, которое называется активным центром. Активный центр - это часть фермента, которая связывает субстрат и осуществляет реакцию.

Специфичность фермента означает, что фермент связывает только определенные молекулы, имеющие правильную форму. Это оставит другие молекулы в покое.

После того, как молекула связана, фермент производит некоторые изменения в молекуле. Он может добавлять новые части к молекуле или отнимать ее. После того, как он выполнит свою работу на подложке, продукция будет выпущена. Затем фермент регенерируется в свою первоначальную форму и готов к связыванию другого субстрата

5. Качественные показатели лекарственного препарата - ряд характеристик, минимальные показатели предъявляются при производстве, отпуске а также употреблении лекарственного средства.

6. Биотехнологическое производство первичных метаболитов. Коэнзим Q10

Первичные метаболиты - это низкомолекулярные соединения (молекулярная масса менее 1500 дальтон), необходимые для роста микробов; одни из них являются строительными блоками макромолекул, другие участвуют в синтезе коферментов.

Вторичные метаболиты - это низкомолекулярные соединения, образующиеся на более поздних стадиях развития культуры, не требующиеся для роста микроорганизмов.

Биосинтез первичных метаболитов осуществляют различные биологические агенты - микроорганизмы, растительные и животные клетки. При этом используются не только природные организмы, но и специально полученные мутанты. Выведение таких микроорганизмов-мутантов необходимо для того, чтобы обеспечить высокие концентрации продукта на стадии ферментации, потому что природные виды продуцируют метаболиты только в необходимых для их жизнедеятельности количествах. Некоторые метаболиты микроорганизмов самостоятельно используются в качестве лекарственных средств, биологических и пищевых добавок.

Промышленный биотехнологический процесс, в котором для производства коммерческих продуктов используют клеточные системы или микроорганизмы, обычно включает три ключевые стадии:

? - подготовительную (обработка сырья, используемого в качестве источника питательных веществ, и приготовление, если это необходимо, питательных сред);

? - биотехнологическую (рост микроорганизмов-мишеней в большом - обычно объемом более 100 л - биореакторе (ферментация) с последующим образованием нужного метаболита, например антибиотика, аминокислоты или белка (биотрансформация));

? - получения готовой продукции (очистка целевого продукта от компонентов культуральной среды или от клеточной массы).

Кофермемнты, или коэнзиммы - органические природные соединения небелковой природы, необходимые для осуществления каталитического действия ферментов. Коферменты вместе с функциональными группами аминокислотных остатков фермента формируют активный центр фермента, на котором происходит связывание с субстратом и образование активированного фермент-субстратного комплекса.

Кофермент Q (убихинон) - это группа коферментов - бензохинонов, содержащих хиноидную группу (отсюда обозначение Q) и содержащих несколько изопрениловых групп (например, 10 в случае кофермента Q₁₀).

В настоящее время существуют три способа синтеза убихинона: синтетический, полусинтетический и ферментативный. Первые два так и не нашли своего применения в промышленности из-за сложности получения (6-9 стадий) и относительно небольших выходов, поэтому они будут рассмотрены кратко.

Первое промышленное производство убихинона было налажено в Японии в середине 1970-ых годов. Технологическое решение основывалось на ферментативном способе получения конечного продукта. Тогда в качестве биологических продуцентов были выбраны представители следующих семейств: Rhodotorula, Cryptococcus, Sporobolomyces, Candida, Torulopsis, Rhodosporidium, Trichosporon, Aureobasidium, Tremella, Bullera.

С тех пор биотехнологический подход так и остался единственным успешно реализованным в промышленном масштабе.

7. Технология получения лизина

Лизин - это незаменимая аминокислота, входящая в состав практически любых белков, необходима для роста, восстановления тканей, производства антител, гормонов, ферментов, альбуминов.

В настоящее время установлено, что лизин в организме является не только структурным элементом белка, но и выполняет ряд важных биохимических функций - является предшественником карнитина и оксилизина, способствует транспорту кальция и стронция в клетки и др.

Лизин (2,6 - диаминогексановая кислота) - алифатическая аминокислота с выраженными свойствами основания; незаменимая аминокислота. Лизин известен в виде двух оптически активных D- и L-форм. Бесцветные кристаллы. Природный L-лизин (t_пл 224-225°С, с разложением) хорошо растворим в воде, кислотах и основаниях, плохо - в спирте. Выделен в 1889 из гидролизата казеина, синтезирован в 1902; входит в состав почти всех белков животного и растительного происхождения (в большом количестве лизин содержится в гистонах и протаминах, в малом - в белках злаков. Отсутствие лизина в пище замедляет рост у детей, у взрослых приводит к отрицательному балансу азота и нарушению нормальной жизнедеятельности организма

8. Аскорбимновая кислотам - органическое соединение с формулой C₆H₈O₆, является одним из основных веществ в человеческом рационе, которое необходимо для нормального функционирования соединительной и костной ткани. Выполняет биологические функции восстановителя и кофермента некоторых метаболических процессов, является антиоксидантом.

Биологически активен (способен участвовать в биохимических процессах) только один из изомеров - L-аскорбиновая кислота, называемая также витамином C, который в природе содержится во многих фруктах и овощах.

Авитаминоз аскорбиновой кислоты приводит к цинге. Есть некоторые свидетельства того, что регулярное употребление добавок с аскорбиновой кислотой может сократить продолжительность простуды, но не предотвратить инфекцию.

Витаминное средство (витамин C). Аскорбиновая кислота - белый кристаллический порошок кислого вкуса. Легко растворим в воде (1: 3,5), медленно растворим в этаноле (1:30), абсолютном спирте (1:50), глицерине (1:100), пропиленгликоле (1:20). Растворимость в воде: 80,0% при 100°C; 40,0% при 45°C. Практически нерастворим в эфире, бензоле, хлороформе, петролейном эфире, маслах, жирах. Под воздействием воздуха и света постепенно темнеет. В сухом виде стабилен на воздухе, водные растворы на воздухе быстро окисляются. Молекулярная масса 176,13.

9. Витамин рр

• Никотиновая кислота известна давно: еще в 1866 г. она была получена немецким химиком Губертом, путем окисления выделенного из табака никотина. Но вплоть до 40-х годов XX века никто не подозревал, что никотиновая кислота обладает витаминным действием. Ее признали витамином после того, как оказалось, что она прекрасно вылечивает пеллагру - тяжелое заболевание, от которого страдали тысячи людей, питавшихся преимущественно кукурузой.

• С этим связано и название «витамин PP» - от начальных букв двух латинских слов «preventive pellagra», или «предупреждающий пеллагру».

• Причиной пеллагры, было преимущественное употребление в пищу кукурузы, в которой никотиновая кислота находится в химически связанной, не усваиваемой человеком форме. Кроме того, белок кукурузы беден триптофаном, таким образом, и этот источник витамина PP у людей, питающихся кукурузой, оказывается неэффективным.

10. Препараты на основе макро- и микромицетов

Макромицеты объединяют группу грибов, образующих крупные плодовые тела, примером их могут служить шляпочные грибы

Грибы, у которых плодовые тела хорошо видны невооруженным глазом, получили название макромицеты.

Значительная группа грибов, которые можно увидеть только с помощью увеличительных приборов - это микромицеты.

АНТИБИОТИКИ - вещества микробного, животного или растительного происхождения, избирательно подавляющие жизнеспособность микроорганизмов.

Первый антибиотик - пенициллин - был выделен из плесневого гриба пенициллиум нотатум.

У пенициллина оказалось столько достоинств, что он до сих пор широко применяется в медицинской практике. Главные из них - высочайшая антибактериальная активность и безопасность для человека. Поначалу его действие вообще производило впечатление волшебной палочки: очищались гнойные раны, зарастали кожей ожоги и отступала гангрена. Введение пенициллина сразу после ранения позволяло предупреждать нагноение ран и заражение крови.

Культаральное исследование направлено на выделение чистой культуры гриба и ее идентификацию.

Посевы можно проводить на плотные и жидкие питательные среды (Сабуро, кукурузный, рисовый, картофельный агары).

Культивирование грибов осуществляется при температуре 22 - 28 градусов в течение 2-4 недель. Если грибы оказались в смешанных культурах их чистые культуры получают после рассевов до изолированных колоний на кровяном агаре или после обработки соляной кислотой (для уничтожения бактерий).

Выделение культуры грибов идентифицируют по внешнему виду и форме колоний, их консистенции, цвету, расположению конидиеносцев, спор, а также по биохимическим признакам

В настоящее время в Японии и других странах юго-восточной Азии на фармацевтическом рынке имеется около десятка препаратов на основе гликанов и гликанпептидов (как нативных, так и модифицированных), полученных из высших базидиомицетов. Например, «Шизофилан» (из Schizophyllum commune), «Крестин» (из Trametes versicolor), «Лентинан» (из Lentinus edodes), «Ганодерма» (из Ganoderma lucidum), «Король-Кордицепс» и «Кордицепс» и др. Эффективность этих препаратов довольно высока, и в настоящее время они завоевывают фармацевтические рынки Европы и США.

11. Метаболиты

u Метаболиты - продукты обмена веществ.

u Первичный метаболизм - дыхание, фотосинтез, синтез ДНК, РНК, белков, липидов.

u Вторичный метаболизм - синтез вторичных метаболитов.

u Первичные метаболиты - низкомолекулярные соединения, необходимые для жизнедеятельности клетки. К ним относятся пуриновые и пиримидиновые основания (нуклеотиды), аминокислоты, сахара, органические кислоты, витамины. Эти вещества участвуют в основном обмене веществ, являются коферментами (НАД, НАДФ, ФАД, ФМН), строительными блоками для более сложных соединений (высокомолекулярных). Первичные метаболиты присутствуют в любой клетке растения.

Аминокислоты - структурные единицы белков. Природные аминокислоты вовлечены в биосинтез ферментов, ряда гормонов, витаминов, антибиотиков, алкалоидов, токсинов и других азотсодержащих соединений (пурины, пиримидины, гем и пр.).

u В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

u гидролизом природного белоксодержащего сырья;

u химическим синтезом;

u микробиологическим синтезом;

u биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

12. Витамин В2

Рибофлавин - водорастворимый витамин, необходимый для нормального функционирования клеток, тканевого дыхания, метаболизма белков, жиров и углеводов. Его дефицит проявляется поражением кожи и слизистых.

• До 30-х годов прошлого века из натурального сырья выделялся рибофлавин. В максимальной концентрации он содержится в моркови и печени. Из 1 тонны моркови можно выделить только 1 г рибофлавина, а из 1 тонны печени - 6 грамм. В 1935 году был обнаружен активный производитель рибофлавина - дрожжеподобный гриб, способный синтезировать 25 кг витамина В2 при выращивании в 1 тонне питательной смеси. Суперсинтез рибофлавина достигается за счет изменения состава культуральной среды, нуклеотидов Флавина, дикорастущих штаммов мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2. Выбор мутантов приводит к резистентности к аналогу витамина В2 - розеофлавину. В состав среды для роста продуцентов витамина В2 входят достаточно сложные органические вещества-соевая мука, экстракт кукурузы, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, водородный фосфат калия, витамины, промышленное масло. Грибы очень чувствительны к изменениям состава окружающей среды и подвержены заражению. Перед отправкой в ферментатор дезинфицируют путем добавления в среду антибиотиков и антисептиков. Посев жидкой питательной среды и дрожжевой культуры готовят в различных емкостях - на заквасках и в посевной машине.

Споры эремотециума эшби (29-30°с 7-8 дней), выращенные на просе, используются в качестве посева. После стерилизации жидкое семя подается в ферментатор. Процесс брожения грибов для получения кормового рибофлавина длится 3 дня при температуре 28-30°С. Концентрация рибофлавина в питательной жидкости может достигать 1,4 мг / мл. После окончания процесса ферментации культуральную жидкость концентрируют в вакууме, сушат в распылительной сушилке (влажность 5-10%) и перемешивают с добавками. В 1983 году во Всероссийском научно-исследовательском институте микробной генетики был разработан рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризующийся высокой дозой оперонов, контролирующих синтез рибофлавина. Всего 40 часов ферментации путем клонирования генов рибофлавинового оперона в одной из созданных плазмид E. получен промышленный штамм, продуцирующий витамин В2, способный синтезировать в три раза больше рибофлавина по сравнению с ashbyii.

13. Витамин Д

Витамин D (кальциферол) образуется на коже человека под воздействием ультрафиолетовых лучей солнца. Он ускоряет отделение кальция и фосфора из кишечника и влияет на прочность костной ткани. Организм человека также принимает витамин D из состава пищи. Заболевание, вызванное недостатком витамина D у маленьких детей, называется мешел (рахит). Скелет детей, страдающих болезнью мешеля, формируется неправильно. Кости ног сгибаются под действием массы тела, косточка развивается медленно, сон становится беглым. Много болеет инфекционными заболеваниями. Поэтому, чтобы маленькие дети не заболели мешелевой болезнью, их выгоняют на солнце. Витамин D содержится в рыбьем жире, печени, икре, яичных желтках, печени животных, молочных продуктах. Необходимая суточная доза витамина D составляет 2,5 мг.

По своей химической структуре группа витаминов D является производными стероидов.

Витамин D3 представляет собой белый или желтоватый кристаллический порошок. Нерастворим в воде, но хорошо растворяются в маслах и оргапических растворителях и быстро разрушаются кислородом. Поэтому вводить витамин D в кормовые добавки рекомендуется только в стабилизированной форме (желатина, этшщеллюлоза).

Витамин D3 производится растениями и грибами при воздействии солнечного света. Эргокальциферол (Д3) не производится естественным образом в организме человека и, следовательно, эта форма витамина подобна, но не идентична тому, что производиться человеком под действием солнечного света.

Холекальциферол получают путем облучения спиртовых растворов 7-дегидрохолестерина ультрафиолетом.

На основании исследований В. Вендта применяют двухступенчатый процесс облучения [30] с применением эритемных и бактерицидных ламп. Процесс осуществляют следующим образом.

В реактор-смеситель 54 загружают 7-дегидрохолестерин, из мерника 55 спирт и при перемешивании приготовляют при температуре 40-50° С раствор, содержащий 0,1-0,2% провитамина. Раствор фильтруют через нутч - фильтр 56 в сборник 57, откуда поступает в мерник 58. Из последнего раствор 7-дегидрохолестерина поступает Ё облучательные аппараты 59, снабженные люминесцентными эритемными (>.тах=310-312 нм) и бактерицидными (ХШах =253,7 нм) лампами. Вначале из баллона 60 подают азот, затем включают эритемные лампы. Через 60 - 100 мин (пока 35% провитамина не превратится в люмистерин) [30] включают бактерицидные лампы, излучение которых превращает люмистерин в тахистерин. Последний под влиянием излучения эритемных ламп превращается в провитамин и витамин D3. Общая продолжительность процесса облучения в аппаратах периодического действия составляет 2,0-2,5 ч. Из облучательного аппарата облученный раствор направляют в сборник 61, а из него в вакуум-аппарат 62 для отгонки спирта и сгущения (в 8-10 раз); далее сгущенный раствор поступает в кристаллизатор 63, где при температуре - 10-15° С выкристаллизовывают непрореагировавший 7-дегидрохолестерин, который отфильтровывают на нучт-фильтре 64, осадок промывают спиртом из сборника 65 и направляют в реактор 41 для перекристаллизации. Фильтрованный облученный раствор из нутч-фильтра 64 засасывают в вакуум-аппарат 66 для дополнительной отгонки спирта. Затем полученный концентрат фильтруют через нутч-фильтр 67 в сборник 68, откуда далее его направляют либо для приготовления масляного препарата, либо для получения виде- ина-3. Выход холекальциферола составляет 55,7% [30].

Видеин-3 является искусственным комплексом витамина D3 с казеином [65]. Применяется для профилактики и лечения рахита у детей, а также для витаминизации продуктов детского питания. Препарат обладает большей антирахитической активностью по сравнению с другими препаратами витамина D [66-69]. Метод получения видеина основан на совмещении процесса осаждения белка в момент изоэлектрического его состояния с процессом образования коллоидного раствора витамина D3, происходящего в результате замены растворителя. Витамин D3 применяется в виде кристаллического комплекса его с холестерином, названного авторами видехолом.

Получение видеина предусматривает следующие процессы: приготовление раствора препарата Г) 3-видехола; приготовление раствора казеина; осаждение комплекса витамина D3 с казеином.

В реактор 69 наливают из мерника 70 раствор казеина в 0,05 н. растворе едкого натра. Затем тонкой сильной струей азота (баллон 71) из мерника 72 вводят при энергичном перемешивании спиртовый раствор видехола. Предварительно в мерник 72 добавляют из мерника 73 уксусную кислоту в количестве, необходимом для нейтрализации щелочи и достижения изоэлектрической точки казеинового раствора [70]. Процесс осаждения проводят в течение 1,5-2 мин. После отстаивания осадок выделяют в центрифуге 74, высушивают в сушилке 75 при температуре 55-60° С и измельчают в микромельнице 76. В 1 г препарата содержится 200 тыс. и. е. витамина D3.

14. Аспаргиновая кислота

Аспарагиновая кислота (ионная форма известна как аспартат), представляет собой б-аминокислоту, которая используется в биосинтезе белков. Как и все другие аминокислоты, она содержит аминогруппу и карбоновую кислоту.

Аспарагиновая кислота была впервые обнаружена в 1827 году Огюстом-Артуром Плиссоном и Этьеном Оссианом Генри путем гидролиза аспарагина, который был выделен из сока спаржи в 1806 году. В их первоначальном методе использовался гидроксид свинца, но теперь вместо него чаще используются различные другие кислоты или основанияэ



15. Пенициллины

Пенициллины-антимикробные препараты, относящиеся к классу в-лактамных антибиотиков. Открыт Александром Флемингом в 1929 году. Естественным продуцентом пенициллинов являются грибы рода Penicillium, наиболее активным из натуральных пенициллинов является бензилпенициллин, используемый с конца 1940-х годов. Основным компонентом всех пенициллинов является 6-АПК (6-аминопенициллановая кислота), состоящая из в-лактама и тиазолидинового кольца. Все пенициллины отличаются только строением радикала.

Пенициллины делятся на 4 группы или поколения:

К 1 группе относятся: пенициллины Природного происхождения (синтезированные грибами) бензилпенициллин и феноксиметилпенициллин. Спектр их действия против пиогенных кокков и некоторых грамположительных бактерий узок, так как их в-лактамы не защищены от действия пенициллиназ (ферментов, синтезируемых определенными микроорганизмами, например, Staphylococcus spp.;

Полусинтетические пенициллины, устойчивые к пенициллиназе, поэтому они используются для борьбы с широким спектром микроорганизмов (кокки, стафилококки, грамположительные и некоторые грамотрицательные бактерии). К ним относятся: метициллин, оксациллин, нафциллин; амоксициллин, аминопенициллины с широким спектром ампициллина;

2-3 группе относятся Карбоксипенициллины (тикарциллин, карбенициллин)

4-я группе относятся пенициллины с широким антибактериальным спектром: уреидопенициллины (мезлоцилин, азлоцилин); амидопенициллины (мециллам).

Биосинтез с использованием продуцентов пенициллина G строго определенной средой, но без предшественников. Характеризуется низким выходом брожения, сложным методом экстракции из сырого природного раствора. Общий выход брожения и экстракции был низким, издержки производства были относительно высокими, в то время как с коммерческой точки зрения производство путем брожения 6-АПК неэффективно. Химический метод гидролиза пенициллина. Химическое деацилирование боковой цепи пенициллина для получения 6-АПК требует высокоспецифического реагента, так как в-лактамная связь является высокореактивной и, следовательно, сначала разрушается, а экзоциклическая амидная связь намного сильнее.

Ферментативный гидролиз пенициллина. Наиболее дешевым и технологически простым является ферментативный гидролиз пенициллинов, который позволяет проводить процесс получения 6-АПК в водных растворах в одну стадию.

16. Гентамицин-аминогликозидные антибиотики широкого спектра действия

Подавляющие бактериальный синтез белка, очень активны в отношении аэробных грамотрицательных бактерий. Гентамицины производятся бактериями Micromonospora, промышленный производитель-Micromonospora purpurea. Побочные эффекты со стороны пищеварительной системы: тошнота, рвота, повышение активности печеночных трансаминазСо стороны центральной нервной системы и периферической нервной системы: головная боль, сонливость, нарушение нервно-мышечной проводимости, снижение слуха, вестибулярные нарушения, необратимая глухота. Аллергические реакции: кожная сыпь, зуд, крапивница, лихорадка, редко - отек Квинке. Может вызвать сенсибилизацию организмаПротивопоказанияПовышенная чувствительность к гентамицину и другим антибиотикам группы аминогликозидов, неврит слухового нерва, тяжелое нарушение функции почек, уремия, беременность, лактация (грудное вскармливание).

Гентамицин сульфат-антибиотик, относящийся к группе аминогликозидов; это смесь сульфатов гентамицина, образуемая культурой Micromonospora purpurea. Гентамицин подавляет развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе Proteus, Pseudomonas, не влияет на грибок. Гентамицин сульфат применяется при различных инфекционных заболеваниях, вызываемых чувствительными к нему микроорганизмами. Препарат особенно эффективен при инфекциях мочевыводящих путей, респираторных и желудочно-кишечных заболеваниях. Из-за широкого спектра действия гентамицин часто назначают при смешанной инфекции, а также при отсутствии возбудителя.



17. Цефалоспорины -

это класс в-лактамных антибиотиков, в основе химической структуры которых лежит 7-аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК).

• Основная особенность - большая резистентность по отношению к в-лактамазам - ферментам, вырабатываемым микроорганизмами. Цефалоспорины обладают также более широким спектром действия, включая влияние на грамотрицательные микроорганизмы. Благодаря высокой эффективности и низкой токсичности, цефалоспорины занимают одно из первых мест по частоте клинического использования среди всех АМП.

Цефалоспорины были впервые выделены из культур Cephalosporium acremonium в 1948 году итальянским ученым Джузеппе Бротзу который заметил, что культуры продуцировали вещества, эффективно уничтожавшие Salmonella typhi, возбудителя тифа, которая имела активный фермент бета-лактамазу.

С 1955 по 1962 г. детально изучались культуры С.acremonium рабочими группами H. Florey и E.P. Abraham. Из продуктов обмена веществ этого гриба удалось выделить бактерицидную субстанцию - цефалоспорин С, ставшую исходным веществом для получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты - структурной основы цефалоспоринов.

В 1962 г. в клиническую практику был введен первый антибиотик класса цефалоспоринов - цефалоридин.

По физическим свойствам препараты представляют собой белые порошки. Они практически нерастворимы в хлороформе и эфире. Цефалотина натриевая соль легко растворима в воде и мало растворима в этаноле, цефалексин трудно растворим в воде и практически нерастворим в этаноле.

Химические свойства цефалоспоринов обусловлены наличием карбоксильной группы, поэтому они могут образовывать соли, в виде которых некоторые из них применяют в медицинской практике.

• Основной продуцент этого антибиотика - гриб Cepholosporium acremonium.

• В последнее время методом смешанного (биологического и химического) синтеза получено большое число аналогов цефалоспорина. Многие из этих соединений имеют важное практическое значение.

• Основой полусинтеза цефалоспоринов служит 7-аминоцефалоспорановая кислота, которая получается в результате отщепления ацильного остатка от цефалоспорина С под действием фермента ацилазы. Модификация основного ядра цефалоспорина может происходить с двух сторон молекулы.

Схема промышленного биотехнологического производства цефалоспоринов

1. получение соответствующего штамма - продуцента антибиотика - гриб Cepholosporium acremonium, пригодного для промышленного производства;

2. подготовка питательной среды: в технологии получения антибиотиков применяют твердые питательные среды - агаризованные или сыпучие субстраты (пшено, ячмень, пшеничные отруби и т.п.) и жидкие питательные среды.

3. Подготовка посевного материала (продуценты - мутанты > колба на качалке > первый инокулятор (10 л) > второй инокулятор (100-500 л) > ферментер).

4. Ферментация: для получения антибиотиков используют метод глубинного культивирования. В ходе ферментации культура непрерывно аэрируется стерильным подогретым воздухом. Процесс ферментации осуществляется в строго стерильной глубинной аэробной периодической культуре, носит выраженный двухфазный характер. Период ферментации длится 7-10 суток.

5. Выделение антибиотиков. Если антибиотик находится в клетках, на первом этапе обработки биомассу выделяют из культуральной жидкости (фильтрацией или центрифугированием); после разрушения клеток антибиотик экстрагируют и переводят в растворимую фазу. Затем данный раствор и культуральные среды (если антибиотик выделяется из клеток в среду) подвергают разным методам экстракции, разделения, очистки и концентрирования для получения готового продукта.

• 6. Очистка антибиотиков. включает стадии: осаждение, сорбцию, сушку. Затем препарат фасуют в стерильные флаконы с соблюдением условий, гарантирующих стерильность.

• 7. Получение готового продукта: Готовый продукт подвергается биологиескому и фармакологическому контролю. Биологический контроль определяет степень стерильности препарата. При фармакологическом контроле проводят всесторонние испытания препарата на токсичность, пирогенность, токсикогенность и др., оценивают антимикробный спектр препарата, действие на лейкоциты крови, устанавливают максимально переносимую дозу антибиотика, дозы, вызывающие полную и 50% гибель экспериментальных животных.



18. Стрептомицин

Стрептомицимн - исторически второй антибиотик (после пенициллина), он же первый из группы аминогликозидов, а также первый, оказавшийся эффективным против туберкулёза и чумы.

Был открыт американским микробиологом Зельманом Ваксманом. Образуется в процессе жизнедеятельности лучистых грибов

Альберт Шац впервые выделил стрептомицин в 1943 году из Streptomyces griseus.

Входит в Список основных лекарственных средств Всемирной организации здравоохранения. Всемирная организация здравоохранения классифицирует его как критически важный для медицины человека.

Для производства стрептомицина используют штаммы актиномицета Streptomyces griseus, образующего воздушный мицелий и споры. Продуцент образует максимальное количество стрептомицина в жидкой питательной среде, содержащей мясной экстракт

В качестве основы питательных сред используют гидролизаты растительных или животных белков. Среду стерилизуют при 120°С, охлаждают и засевают посевным материалом. Культивирование проводится при 25 - 30°С и сопровождается аэрацией и перемешиванием.

Затем культуральная жидкость фильтруется для удаления мицелия. С этой целью пользуются фильтр-прессами, обеспечивающими высокую скорость фильтрации. Для улучшения фильтрации примешивают наполнитель, не поглощающий стрептомицин. После такой первичной фильтрации рН фильтрата доводят до определенной величины, а затем окончательно отфильтровывают его с помощью второго фильтра. Осадок, оставшийся после фильтрации, утилизируется.

Стрептомицин и некоторые примеси извлекают из фильтрата путем адсорбции на активированном угле, который затем автоматически подается в фильтр-пресс, где остатки неактивной жидкости отделяются.

Стрептомицин смывается с активированного угля разбавленным спиртовым раствором соляной кислоты, нейтрализуется и затем концентрируется путем упаривания. Полученный концентрат обрабатывается ацетоном, который осаждает солянокислый стрептомицин. Смесь фильтруется через пресс, причем фильтрат поступает на регенерацию растворителя. К безводному спиртовому раствору соли стрептомицина добавляют спиртовой раствор хлористого кальция, чтобы получить кристаллическую соль стрептомицина.

В асептических условиях соль стрептомицина растворяют в воде, пропускают через бактериальный фильтр для удаления микроорганизмов, лиофильно высушивают, измельчают в порошок и фасуют.

19. Фторхинолоны

- большая группа антимикробных средств класса хинолонов, ингибиторов ДНК-гиразы. Это высокоактивные синтетические химиотерапевтические средства широкого спектра действия, характеризующиеся хорошими фармакокинетическими свойствами, высокой степенью проникновения в ткани и клетки, включая клетки макроорганизма и бактериальные клетки»

20. Биотехнология вторичных метаболитов. Аминогликозиды

Аминогликозиды - группа органических веществ, общим в химическом строении которых является наличие в молекуле аминосахара, соединённого гликозидной связью с аминоциклическим кольцом. Многие аминогликозиды являются антибиотиками. По химическому строению к аминогликозидам близок также спектиномицин, аминоциклитоловый антибиотик. Основное клиническое значение аминогликозидов заключается в их активности в отношении аэробных грамотрицательных бактерий.

Аминогликозиды - это класс антибиотиков, применяемых для лечения серьезных бактериальных инфекций, например, вызванных грамотрицательными бактериями (особенно Pseudomonas aeruginosa).

Аминогликозиды включают следующие антибиотики:

? Амикацин

? Гентамицин

? Канамицин

? Неомицин

? Плазомицин

? Стрептомицин

? Тобрамицин

Способ получения антибиотика канамицина осуществляют культивированием продуцента Streptomyces kanamyceticus в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли в условиях аэрации и перемешивания, при этом в процессе культивирования проводят доливы гидролизата кукурузной муки или стерильной воды в количестве, достаточном для поддерживания вязкости на уровне 60 - 100*10³ Па*с. В процессе выделения бактериями нужного стрептомицина следят за различными условиями, в которых собственно и осуществляется синтез: производят выбор наиболее активных штаммов, оптимизированных сред и других условий. Среды используют в основном с соевой мукой, кукурузным экстрактом, а также глюкозу, мел, жиры и другие. Для сбора получившегося антибиотика его пропускают через катионы (то есть применяют ионообменный метод), потом очищают, как правило, оксидом алюминия. Метод получения антибиотика несильно отличается от других, однако в особенности получения стрептомицина можно выделить подкисление культуральной жидкости, например, с помощью щавелевой и серной кислот.



21. Амоксициллин, технология получения

Амоксициллин - полусинтетический антибиотик широкого спектра действия группы пенициллинов для лечения бактериальных инфекций. К ним относятся инфекции среднего уха, тонзиллит, пневмония, кожные инфекции и инфекции мочевыводящих путей. Он принимается перорально или реже через инъекцию. Антибиотики-группа высокоэффективных биологически активных веществ, синтезируемых микроорганизмами и способных убивать живые клетки или ингибировать их рост.

Амоксициллин относится к классу пенициллинов. Они представляют собой органические соединения на основе 6-аминопенициллиновой кислоты, полученной из культур грибов плесени Penicillium chrysogenum.

В качестве продуцентов антибиотиков используются микроорганизмы, плесневые грибы, актиномицеты, ткани высших растений и животных. Микроорганизмы одного вида могут синтезировать антибиотики различной природы и, наоборот, микроорганизмы из разных таксономических групп могут производить один и тот же антибиотик.

При этом способе для получения антибиотиков используются высокопродуктивные штаммы микроорганизмов и специальные питательные среды, в которых они выращиваются. С помощью биологического синтеза получают, например, пенициллин

Биосинтез с последующими химическими модификациями (так делают полусинтетические антибиотики).

Сначала посредством биосинтеза получают природный антибиотик, а затем его исходную молекулу модифицируют химическими модификациями, например, закрепляют определенные радикалы, в результате чего улучшаются антимикробные и фармакологические свойства препарата.

Химический синтез.

После изучения структуры некоторых природных антибиотиков удалось получить их путем химического синтеза.

22. Тетрациклин

Тетрациклимн (новолат. Tetracyclinum) - антибиотик из группы тетрациклинов.

Глазная мазь тетрациклина входит в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов.

Тетрациклин включен в WHO Model List of Essential Medicines - список важнейших лекарственных средств, составляемый Всемирной организацией здравоохранения.

Тетрациклины (англ. tetracyclines) - группа антибиотиков, относящихся к классу поликетидов, близких по химическому строению и биологическим свойствам. Представители данного семейства характеризуются общим спектром и механизмом антимикробного действия, полной перекрёстной устойчивостью, близкими фармакологическими характеристиками. Различия касаются некоторых физико-химических свойств, степени антибактериального эффекта, особенностей всасывания, распределения, метаболизма в макроорганизме и переносимости

Физико-химические свойства.

Тетрациклины представляют собой жёлтые кристаллические вещества, устойчивые в твёрдом состоянии. Они обладают амфотерными свойствами, на чём основана способность этих антибиотиков образовывать соли с органическими и неорганическими кислотами, щелочными и щелочноземельными металлами. Образуют нерастворимые комплексы с катионами многовалентных металлов, борной кислотой, солями б-оксикарбоновых кислот (глюконовая, яблочная, лимонная и др.). В определённых условиях растворы тетрациклинов флюоресцируют.

Тетрациклины хорошо растворимы в этиленгликоле, пиридине, кислотах и щелочах, значительно хуже в органических растворителях, плохо растворимы в воде.



23. Эритромицимн

(Erythromycin) - является первым антибиотиком, положившим начало классу макролидов. IUPAС название: 6 - (4-Dimethylamino-3-hydroxy-6-methyl-oxan-2-yl) oxy-14-ethyl - 7,12,13 - trihydroxy-4 - (5-hydroxy-4-methoxy - 4,6 - dimethyl-oxan-2-yl) - oxy - 3,5,7,9,11,13 - hexamethyl-1-oxacyclotetradecan - 2,10 - dion. Впервые получен учеными американской фармацевтической компании «Эли Лилли» в 1952 году^[1] из почвенного актиномицета Streptomyces erythreus.

? Получение эритромицина осуществляют методом микробиологического синтеза C помощью культуры продуцента Streptomyces erythreus. Антибиотик выделяют из нативного раствора экстракцией B бутилацетате, предварительно проведя обработку культуральной жидкости микрофильтрацией. Выделение эритромицина из экстракта проводят химическими методами.

24. Левомицетин

n является антибиотиком широкого спектра действия,

n Подавляет синтез белка и НК.

n эффективен в отношении многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, риккетсий, спирохет и некоторых крупных вирусов.

n действует на штаммы бактерий, устойчивые к пенициллину, стрептомицину, сульфаниламидам.

n В обычных дозах действует бактериостатически (препятствует размножению бактерий).

n Слабоактивен в отношении кислотоустойчивых бактерий, синегнойной палочки, клостридий и простейших.



25. Технология получения рекомбинантного интерферона

• Белок интерферон-альфа - это важнейший компонент иммунной системы человека. Каскад реакций имунной системы, запускаемый интерфероном, мобилизует весь организм на эффективную защиту от инфекций, опухолей, воспалительных реакций. Поэтому препараты на основе интерферона обладают противовирусным, иммуномодулирующим и противоопухолевым действием.

• Интерферон препятствует размножению вируса внутри клетки. Когда в клетку внедряется вирус, то через 20 минут из нее выходят уже 100 свежих вирусов, потомков первого. Каждый из них внедряется в здоровые клетки и снова размножаются. Так как организм человека не способен вырабатывать интерферон с такой же скоростью на начальной стадии заболевания, медицинские препараты помогают справится с болезнью.

• Интерферон делает здоровые клетки невосприимчивыми к вирусу. Здоровая клетка под воздействием интерферона становится непроницаемой для вируса.

• Интерферон активизирует иммунную систему, запуская выработку целого ряда ферментов, антител и других агентов иммунной системы, защищающих организм от инфекций.

• Интерферон оказывает противоопухолевое действие за счет способности подавлять или замедлять рост клеток и активации клеток иммунной системы, которые обнаруживают и уничтожают атипичные клетки организма.

...