Влияние потребления этанола матерями на активность карбоксипептидазы E у потомства крыс разного возраста

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние потребления этанола матерями на активность карбоксипептидазы E у потомства крыс разного возраста

А.Н. Вернигора

Н.В. Волкова

Аннотация

Актуальность и цели. Потребление этанола матерями сильно влияет на организм потомства, на его здоровье, как при рождении, так и в течение всей жизни. Особенно сильно это влияние сказывается на функционировании различных регуляторных систем, в частности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и опиоидергической. В конечной стадии образования эффекторов этих систем - билогически активных пептидов участвует карбоксипептидаза E (КПЕ, EC 3.4.17.10, NF-al). Поэтому целью работы было изучение влияния потребления этанола матерями на активность этого фермента. Материалы и методы. Опыты проводили на самцах и самках белых беспородных крыс (Rattus norvegicus) различного возраста. В работе использовали две группы крыс: пренатально алкоголизированную (ПА, опытную) и контрольную. Активность КПЕ определяли флюорометрическим методом Fricker и соавт. с субстратом дансил-Phe-Ala-Arg по ингибированию гуанидиноэтилмеркапто-янтарной кислотой. Белок определяли методом Лоури. Результаты. ПА достоверно влияла на активность КПЕ в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках, возраст - во всех изученных отделах, взаимодействие ПА и пола - в гипоталамусе, взаимодействие ПА и возраста - в гипоталамусе и стриатуме, взаимодействие пола и возраста - во всех исследованных отделах, взаимодействие всех трех факторов - в стриатуме и надпочечниках. Выводы. Таким образом, потребление этанола матерями оказывало существенное влияние на активность КПЕ в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках потомства, причем в гипоталамусе и стриатуме это влияние зависело от пола и возраста животных. Вероятно, изменение активности фермента способствует вызываемым ПА нейрофизиологическим, нейрохимическим, нейрогуморальным и поведенческим нарушениям.

Ключевые слова: крысы, потребление этанола матерями, возраст, пол, карбоксипептидаза Е, гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система, энкефалины

The effect of ethanol consumption on the carboxypeptidase E activity on different age rats posterity

A.N. Vernigora, N.V. Volkova

Abstract

Background. The consumption of ethanol by dams strongly effects the off-spring's body, its health both at birth and throughout life. This effect has a particularly strong effect on the functioning of various regulatory systems, in particular hypothalamic-pituitary-adrenal and opioidergic. Carboxypeptidase E (CPE, EC 3.4.17.10, NF-al) participates in the final stage of the formation of effectors of these systems - biologically active peptides. Therefore, the purpose of the work is to study the effect of ethanol consumption by mothers on the activity of this enzyme. Materials and methods. Experiments were carried out on males and females of white mongrel rats (Rattusnorvegicus) of different ages. 2 groups of rats were used in the study: prenatally alcoholized (PA, experimental) and control. The activity of CPE was determined by the fluorometric method of Fricker et al. with dancyl-Phe-Ala-Arg substrate for inhibition by guanidinoethylmercaptosuccinic acid. Protein was determined by the Lowry method. Results. PA significantly influenced the activity of CPE in the hypothalamus, striatum and adrenal glands, age - in all the studied departments, the interaction of PA and sex - in the hypothalamus, the interaction of PA and age - in the hypothalamus and striatum, the interaction of sex and age - in all the studied departments, the interaction of all three factors - in the striatum and adrenal glands. Conclusions. Thus, the consumption of ethanol by dams had a significant effect on the activity of CPE in the hypothalamus, striatum and adrenal glands of the offspring, and in the hypothalamus and striatum this effect depended on the sex and age of the animals. Probably, changes in enzyme activity contribute to neurophysiological, neurochemical, neurohumoral and behavioral disorders caused by PA.

Keywords: rats, maternal ethanol consumption, age, gender, carboxypeptidase E, hypothalamic-pituitary-adrenal system, enkephalins

Введение

этанол надпочечник потомство активность

Потребление этанола крысами во время беременности длительно негативно влияет на функционирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) потомства [1-4]. Длительное изменение функционирования ГГНС при этом связано с широким спектром молекулярных, нейрофизиологических и поведенческих нарушений у потомков. При этом изменяется уровень как мРНК различных регуляторных пептидов, так и самих пептидов [3, 5]. Пренатальная алкоголизация вносит нарушения и в функционирование опиоидергической системы [5], вызывая изменение уровня опиоидных рецепторов [5]. Все эти изменения носят тканеспецифичный характер и зависят от возраста и пола потомков.

Биологически активные пептиды синтезируются в виде высокомолекулярных неактивных предшественников. Последние активируются путем протеолитического расщепления (процессинга) [6]. В процессинге участвует и карбоксипептидаза E (КПБ, EC 3.4.17.10, NF-al) [6-10]. Она катализирует отщепление остатков аргинина и лизина с C-конца пептидов [7-10] и играет большую роль в функционировании центральной нервной, эндокринной, половой, опиоидергической системы [7-10], в ответе на стресс, этанол и в процессах адаптации [11].

Описаны половые [12] и возрастные [13] отличия в активности КПБ в отделах ГГНС и отделах мозга. Фермент также вовлекается в ответ на однократное и хроническое потребление этанола. Показано, что пренатальная алкоголизация усиливает изменения активности фермента в отделах мозга при последующей алкоголизации взрослых самцов крыс [14].

Целью работы было изучение влияния потребления этанола матерями на активность карбоксипептидазы E в гипоталамусе, гипофизе, надпочечниках истриатуме самцов и самок крыс разного возраста.

Материалы и методы

Опыты проводили на самцах и самках белых беспородных крыс (Rattus norvegicus) в возрасте 0 (новорожденные, P0), 14 (инфантильные, P14), 28 (P28), 45 (P45) и 120 (P120) суток. В работе использовали две группы крыс: пренатально алкоголизированную (ПА, опытную) и контрольную. Крысы ПА группы являлись потомством самок, получавших в течение всего периода беременности в качестве единственного источника жидкости 12 % раствор этанола, содержащий 5 % сахарозы; контрольной - потомством самок, получавшим в этот период 5 % раствор сахарозы. Схема формирования экспериментальных групп представлена на рис. 1. После декапитации животных извлекали гипофиз, гипоталамус, стриатум и надпочечники.

Активность КПЕ определяли флюорометрическим методом Flicker и соавт. с субстратом дансил-Phe-Ala-Arg по ингибированию гуанидиноэтил-меркаптоянтарной кислотой [15]. Также определяли белок методом Лоури [16]. Активность фермента выражали в нмоль дансил-Phe-Ala, освободившегося за 1 мин инкубации в расчете на 1 мг белка.

Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартная ошибка среднего. Дисперсионный анализ проводили с помощью программы Stat Soft Statistica Bаsic Academic 13 for Windows (лицензия ООО «АйТи Штурман Пенза», Договор № 074-19-223 от 30 декабря 2019 г.). Достоверность влияния факторов (пола, возраста и пренатальной алкоголизации) (трехфакторный статистический комплекс, все группы животных, рис. 1) оценивали с помощью трехфакторного дисперсионного анализа в режиме Factorial ANOVA.

Рис. 1. Схема формирования экспериментальных групп и статистических комплексов для дисперсионного анализа

Для сравнения возрастной динамики изменений активности КПЕ оценивали достоверность влияния возраста для каждой экспериментальной группы (однофакторные статистические комплексы, рис. 1). Для этого проводили однофакторный дисперсионный анализ в режиме One-way ANOVA. В случае достоверности отношения Фишера с помощью post-hoctest Range test Duncan's оценивали принадлежность каждой из возрастных подгрупп животных к разным гомогенным группам. Полученные результаты выражали в баллах. Баллы временным подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом наименьший балл, равный единице, получала временная подгруппа с наименьшим средним, а наибольший балл - временная подгруппа с наибольшим средним. Дробный балл (1,5, 2,5 и т.д.) получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы.

Результаты

На рис. 2 представлены значения активности КПЕ у самцов и самок контрольных крыс и животных, являющихся потомством самок, потреблявших во время беременности этанол.

Рис. 2. Активность карбоксипептидаза E (КПЕ) в гипоталамусе (а, д), гипофизе (б, е), стриатуме (в, ж) и надпочечниках (г, з) самцов (а, б, в, г) и самок (д, е, ж, з) пренатально алкоголизированных крыс

Примечание. По оси абсцисс: возраст, сут; по оси ординат: активность. Незакрашенные столбики - контрольные, закрашенные - пренатально алкоголизирован- ные животные.

Для выявления половых отличий во влиянии потребления этанола матерями на активность КПЕ у потомства и сравнения динамики возрастных изменений фермента у ПА и контрольных животных экспериментальный материал был подвергнут трехфакторному дисперсионному анализу (по факторам пол, ПА и возраст) активности КПЕ (табл. 1), а также однофакторному дисперсионно и ранговому анализу (табл. 2) (формирование статистических комплексов см. на рис. 1).

ПА достоверно влияла на активность КПЕ в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках, возраст - во всех изученных отделах, взаимодействие ПА и пола - в гипоталамусе, взаимодействие ПА и возраста - в гипоталамусе и стриатуме, взаимодействие пола и возраста - во всех исследованных отделах, взаимодействие всех трех факторов - в стриатуме и надпочечниках. Достоверного влияния пола животных на активность фермента не выявлено (табл. 1).

Таблица 1. Трёхфакторный дисперсионный анализ влияния потребления этанола матерями на активность карбоксипептидазы Е в тканях потомства

Примечание. Здесь и в табл. 2 звездочками показана достоверность критерия Фишера: * -р< 0,05, ** -р< 0,01, *** -р< 0,001.

Согласно результатам однофакторного дисперсионного анализа (табл. 2) достоверное влияние возраста на активность КПЕ наблюдалось у всех экспериментальных групп животных (контрольные самцы, контрольные самки, ПА самцы, ПА самки) в гипофизе, стриатуме и надпочечниках. В гипоталамусе достоверное влияние возраста на активность фермента наблюдалось только у контрольных самок. У контрольных животных наблюдались некоторые отличия в динамике изменения активности КПЕ у самцов и самок. У обеих групп животных сначала наблюдалось повышение активности фермента, а затем - ее снижение (рис. 1, табл. 2), однако у самок максимальная активность достигалась к P14, а у самцов - к P28. У ПА самцов в надпочечниках и ПА самок в гипоталамусе и стриатуме наблюдалось изменение динамики активности фермента: в надпочечниках ПА самцов максимальная активность фермента наблюдалась в P0, затем она постепенно снижалась; у ПА самок в гипоталамусе возрастная динамика активности КПЕ исчезала, а в стриатуме максимум активности фермента смещался в P45.

Таблица 2. Дисперсионный и ранговый анализ влияния возраста на активность карбоксипептидазы E в тканях потомства

Примечание. Условные обозначения: F - значения критерия Фишера, m - число гомогенных групп.

Обсуждение

Таким образом, потребление этанола матерями сильно влияло на активность КПЕ в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках потомства, причем в гипоталамусе и стриатуме это влияние зависело от пола и возраста животных (табл. 1). У самок это влияние было более выраженным, чем у самцов (рис. 2, табл. 2), причем в гипоталамусе и стриатуме ПА самок и в надпочечниках ПА самцов наблюдалось изменение возрастной динамики активности КПЕ (табл. 2). Постнатальное развитие крыс характеризуется определенной последовательностью «включения» различных систем организма, в особенности гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы [17], функциональная активность которой регулируется рилизинг-факторами гипоталамуса [17]. Поэтому нарушение возрастной динамики изменения активности КПЕ в гипоталамусе ПА самок может, вероятно, приводить к нарушениям возрастной динамики уровня гонадотропин-рилизинг фактора [17], в процессинге которого она участвует, и к нарушениям процессов полового созревания у потомков алкоголизированных самок. В литературе приводятся многочисленные данные о половых отличиях влияния ПА на уровень мРНКпропептидов и различных биологически активных пептидов [4]. Представляется возможным, что обнаруженные половые отличия во влиянии ПА на активность КПЕ могут способствовать формированию половых отличий к изменению уровня биологически активных пептидов у ПА самцов и самок.

Следует отметить, что у новорожденных (P0) и инфантильных (P14) ПА животных наблюдалось в основном снижение активности КПЕ (рис. 2). Такие изменения активности фермента несколько противоречат традиционно сложившимся представлениям о том, что потребление этанола матерями вызывает гиперреактивность ГГНС [4]. Последняя проявляется в однократном и/или длительном повышении уровня адренокортикотропина (АКТГ) и/или кортикостерона, в том числе и в ответ на стресс, увеличении чувствительности надпочечников к АКТГ, изменении чувствительности гипофиза к кортикотропин-рилизинг фактору [4]. Однако последние исследования свидетельствуют скорее о нарушениях регуляции ответа на стресс ГГНС ПА крыс [1-3], что проявляется в изменении соотношения проопиомеланокортин-происходящих пептидов в различных отделах ГГНС. Так, например, при повышении уровня мРНКпроопиомеланокортина (ПОМК) и уровня синтеза и секреции АКТГ в гипофизе [1] наблюдается снижение уровня экспрессии гена ПОМК и уровня Р-эндорфинав гипоталамусе [2, 3], т.е. ПА изменяет соотношение между пептидами, образующимися из одного и того же предшественника, т.е. изменяет его процессинг. Вероятно, снижение активности КПЕ-фермента, участвующего в конечной стадии образования Р-эндорфина из ПОМК [8], способствует описанному снижению уровня Р-эндорфина. Функции АКТГ и Р-эндорфина в ответе на стресс несколько отличаются. Если АКТГ активирует надпочечники и инициирует периферический ответ на стресс [4], то Р-эндорфин ослабляет ответ на стресс, в частности, ингибируя секрецию КРФ [5] и блокируя стресс-индуцируемую ноцицепцию [5]. Таким образом, снижение активности КПЕ в ранний постнатальный и инфантильный периоды ПА крыс, особенно выраженные в гипоталамусе самок, могут способствовать усилению ответа на стресс и формированию предрасположенности к стрессу [2].

Вместе с тем у взрослых ПА самок (P120) в гипоталамусе и гипофизе активность КПЕ была выше, чем у контрольных крыс, что хорошо согласуется с представлениями о гиперреактивности ГГНС у ПА животных [4] и может способствовать повышению уровня АКТГ [4]. Следует также отметить, что в стриатуме и надпочечниках - тканях с высоким содержанием энкефалинов, дефицит которых возникает у пренатально алкоголизированных взрослых животных, активность КПЕ у пренанально алкоголизированных взрослых крыс была либо ниже, либо не отличалась от таковой у контрольных животных.

Заключение

Таким образом, потребление этанола матерями оказывало существенное влияние на активность КПЕ в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках потомства, причем в гипоталамусе и стриатуме это влияние зависело от пола и возраста животных. У самок влияние ПА на активность фермента было более выраженным, чем у самцов, причем в гипоталамусе и стриатуме ПА самок и в надпочечниках ПА самцов наблюдалось изменение возрастной динамики активности КПЕ. Наиболее выраженные изменения активности КПЕ (снижение) наблюдались у новорожденных (P0) и инфантильных (P14) ПА животных. Вероятно, что снижение активности фермента в этот период способствует вызываемым ПА нейрофизиологическим, нейрохимическим, нейрогуморальным и поведенческим нарушениям.

Список литературы

1. Zhang X., Sliwowska J. H., Weinberg J. Prenatal alcohol exposure and fetal programming: effects on neuroendocrine and immune function // Bxperimental Biology and Medicine (Maywood). 2005. Vol. 230, № 6. P. 376-388. doi: 10.1177/153537020323006-05.

2. Bekdash R., Zhang C., Sarkar D. Fetal alcohol programming of hypothalamic proopiomelanocortin system by epigenetic mechanisms and later life vulnerability to stress // Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 2014. Vol. 38, № 9. P. 2323-2330. doi: 10.1111/acer.12497.

3. Gangisetty O., Bekdash R., Maglakelidze G., Sarkar D. K. Fetal alcohol exposure alters proopiomelanocortin gene expression and hypothalamic-pituitary-adrenal axis function via increasingMeCP2expression in the hypothalamus // PLoS One. 2014. Vol. 9, № 11. P. 1-9. doi:10.1371/journal.pone.0113228.

4. Osborn J.A., Yu.C., Stelzl G.E., Weinberg J. Effects of fetal ethanol exposure on pituitary-adrenals sensitivity to secretagogues // Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 2000. Vol. 24, № 7. P. 1110-1119.

5. Fricker L.D., Margolis E.B., Gomes I., Devi L.A. Five decades of research on opioid peptides: current knowledge and unanswered questions molecular pharmacology // Molecular Pharmacology. 2020. Vol. 98. P. 96-108. doi: 10.1124/mol.120.119388.

6. Hook V., Funkelstein L., Lu D. [et al.]. Hwang proteases for processing proneuropeptides into peptide neurotransmitters and hormones // Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 2008. Vol. 48. P. 393-423. doi: 10.1146/annurev.pharmtox. 48.113006.094812.

7. Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Механизмы регуляции активности и биологическая роль карбоксипептидазы H-фермента процессинга нейропептидов // Биохимия. 1995. Т. 60, № 12. С. 1953-1963.

8. Ji L., Wu H.-T., Qin X.-Y., Lan R. Dissecting carboxypeptidase E: properties, functions and pathophysiological roles in disease // Endocrine Connections. 2017. Vol 6. P. 18-38. doi: 10.1530/EC-17-0020.

9. Xiao L., Yang X., Loh Y.P. Neurotrophic, gene regulation, and cognitive functions of carboxypeptidase E - neurotrophic factor-a1 and its variants // Frontiers in Molecular Neuroscience. 2019. Vol. 13. № 243. P. 1-10. doi: 10.3389/fnins.2019.00243.

10. Xiao L., Loh Y.P. Neurotrophicfactor-a1/carboxypeptidase E functions in neuroprotection and alleviates depression // Frontiers in Molecular Neuroscience. 2022. Vol. 15, № 918852. P. 1-8. doi: 10.3389/fnmol.2022.918852.

11. Гомазков О. А. Функциональная биохимия регуляторных пептидов. М.: Наука, 1993. 160 с.

12. Щетинина Н.В., Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Активность основных карбоксипептидаз у крыс разного пола // Украинский биохимический журнал. 1997. Т. 70, № 3. С. 110-113.

13. Вернигора А.Н., Щетинина Н.В., Генгин М.Т. Исследование активности основных (отщепляющих остатки аргинина и лизина) карбоксипептидаз у крыс разного возраста // Биохимия. 1996. Т. 61, № 10. С. 1848-1856.

14. Вернигора А.Н., Мухина Е.С., Балыкова Н.В., Генгин М.Т. Влияние хронического потребления этанола на активность основных карбоксипептидаз в отделах мозга пренатально-алкоголизированных крыс // Нейрохимия. 2002. Т. 19, № 4. С. 283-286.

15. Fricker L.D., Supattapone S., Snyder S.H. Enkephalinconvertase: a specific enkephalin synthesizing carboxypeptidase in adrenal chromaffin granules, brain and pituitary gland // Life sciences. 1982. Vol. 31. P. 1841-1844.

16. Lowry O.H., Rosebrought N.J., Farr A.G., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // The Journal of biological chemistry. 1951. Vol. 193, № 1. P. 265-275.

17. Бабичев В.Н. Нейроэндокринный контроль процессов пубертации // Успехи современной биологии. 1994. Т. 114, № 3. С. 330-344.

References

1. Zhang X., Sliwowska J.H., Weinberg J. Prenatal alcohol exposure and fetal programming: effects on neuroendocrine and immune function. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 2005;230(6):376-388. doi: 10.1177/15353702-0323006-05.

2. Bekdash R., Zhang C., Sarkar D. Fetal alcohol programming of hypothalamic proopiomelanocortin system by epigenetic mechanisms and later life vulnerability to stress. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 2014;38(9):2323-2330. doi: 10.1111/acer.12497.

3. Gangisetty O., Bekdash R., Maglakelidze G., Sarkar D.K. Fetal alcohol exposure alters proopiomelanocortin gene expression and hypothalamic-pituitary-adrenal axis function via increasingMeCP2expression in the hypothalamus. PLoS One. 2014;9(11):1-9. doi:10.1371 / journal.pone.0113228.

4. Osborn J.A., Yu C., Stelzl G.E., Weinberg J. Effects of fetal ethanol exposure on pituitary-adrenals sensitivity to secretagogues. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 2000;24(7):1110-1119.

5. Fricker L.D., Margolis E.B., Gomes I., Devi L.A. Five decades of research on opioid peptides: current knowledge and unanswered questions molecular pharmacology. Molecular Pharmacology. 2020;98:96-108. doi: 10.1124/mol.120.119388.

6. Hook V., Funkelstein L., Lu D. [et al.]. Hwang proteases for processing proneuropeptides into peptide neurotransmitters and hormones. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 2008;48:393-423. doi: 10.1146/annurev.pharmtox.48.113006.094812.

7. Vernigora A.N., Gengin M.T. Mechanisms of regulation of activity and the biological role of carboxypeptidase X, an enzyme of neuropeptide processing. Biokhimiya = Biochemistry. 1995;60(12):1953-1963. (In Russ.).

8. Ji L., Wu H.-T., Qin X.-Y., Lan R. Dissecting carboxypeptidase E: properties, functions and pathophysiological roles in disease. Endocrine Connections. 2017;6:18-38. doi: 10.1530/EC-17-0020.

9. Xiao L., Yang X., Loh Y.P. Neurotrophic, gene regulation, and cognitive functions of carboxypeptidase E - neurotrophic factor-a1 and its variants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 2019;13(243):1-10. doi: 10.3389/fnins.2019.00243.

10. Xiao L., Loh Y.P. Neurotrophicfactor-a1/carboxypeptidase E functions in neuroprotection and alleviates depression. Frontiers in Molecular Neuroscience. 2022;15(918852):1-8. doi: 10.3389/fnmol.2022.918852.

11. Gomazkov O.A. Funktsional'naya biokhimiya regulyatornykh peptidov = Functional biochemistry of regulatory peptides. Moscow: Nauka, 1993:160. (In Russ.).

12. Shchetinina N.V., Vernigora A.N., Gengin M.T. Activity of the main carboxy-peptidases in rats of different sexes. Ukrainskiy biokhimicheskiy zhurnal = Ukrainian biochemical journal. 1997;70(3):110-113. (In Russ.).

13. Vernigora A.N., Shchetinina N.V., Gengin M.T. Investigation of the activity of basic (cleaving off arginine and lysine residues) carboxypeptidases in rats of different ages. Biokhimiya = Biochemistry. 1996;61(10):1848-1856. (In Russ.).

14. Vernigora A.N., Mukhina E.S., Balykova N.V., Gengin M.T. The effect of chronic ethanol consumption on the activity of the main carboxypeptidases in the brain regions of prenatal alcoholized rats. Neyrokhimiya = Neurochemistry. 2002;19(4):283-286. (In Russ.).

15. Fricker L.D., Supattapone S., Snyder S.H. Enkephalinconvertase: a specific enkephalin synthesizing carboxypeptidase in adrenal chromaffin granules, brain and pituitary gland. Life sciences. 1982;31:1841-1844.

16. Lowry O.H., Rosebrought N.J., Farr A.G., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. The Journal of biological chemistry. 1951;193(1):265-275.

17. Babichev V.N. Neuroendocrine control of puberty processes. Uspekhi so-vremennoy biologii = Advances in modern biology. 1994;114(3):330-344. (In Russ.).

Размещено на Allbest.ru