Молекулярно-генетическая идентификация штаммов бактерий-антагонистов фитопатогенов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Молекулярно-генетическая идентификация штаммов бактерий-антагонистов фитопатогенов

В.П. Терлецкий

Summary

MOLECULAR-GENETIC IDENTIFICATION OF STRAINS OF BACTERIA-ANTAGONISTS OF PHYTOPATOGENS

V.P. Terletskiy^1,2

¹State Autonomous Educational Institution of Higher Education of the Leningrad Region «Leningrad State University named after A.S. Pushkin», St. Petersburg, Pushkin ²Federal State Budget Scientific Institution «All-Russian Institute of Plant Protection» St. Petersburg,

The article is devoted to application of molecular genetic approach (DDSL - double digest and selective label) for fast and inexpensive identification of bacterial strains which are used as antagonists suppressing phytopathogenic microorganisms. Results demonstrate a potential for routine usage of this technique. It based on generation of genetic profile specific for each bacterial strain certifying its origin

Introduction. Microbiological methods of plant protection from phytopathogens and insect pests have recently acquired particular importance due to the global trend towards the use of environmentally friendly food products. Among such microorganisms, strains of Xenorhabdus nema- tophila and Bacillus thuringiensis can be underlined. The industrial use of these bacteria requires regular confirmation of their authenticity to the original patented originals from the established collections of beneficial microorganisms. Object. The object of research are isolates of bacteria belonging to two different species - Xenorhabdus nematophila and Bacillus thuringiensis. The former being a part of intestine microbiota in soil nematodes is able to produce secondary metabolites deadly for harmful insects. The latter possesses valuable feature - under appropriate conditions it produces spores which are highly stable and constitute a functionally active part of biopreparations. Materials and methods. The previously developed method for genetic certification of bacterial strains, based on double digest and selective label of DNA fragments (DDSL), was used for molecular-genetic identification of strains of these two species. The method uses two restriction endonucleases simultaneously, one produces “sticky” ends that can be labeled with biotinylated deoxycytosine triphosphate, and the other produces blunt ends that are not capable of incorporating the label. As a result, out of thousands of DNA fragments, only a limited number will carry the tag; the number and distribution of such labeled fragments after electrophoresis in a conventional agarose gel is easily visualized on a nylon filter. The set of fragments is characteristic for each bacterial strain and is a sort of genetic certificate. The aim of the work was to apply this method to identify strains of two bacterial species. Results and conclusion. Using Bacillus thuringiensis as an example, it was demonstrated that the resolution of the method depends on the number of detected DNA fragments. For example, SgrAI/Eco24I enzyme pair generates more than 25 fragments whereas SgsI/Eco32I - just a few bands. The higher number of bands the better resolving power of any technique. In case of application of SgrAI/Eco24I all isolates were discriminated into distinct genotypes except pair ЕП-Е isolates. In contrast, SgsI/Eco32I generating a small number of bands did not resolve most strains. As for entomopathogenic bacteria Xenorhab- dus nematophila the optimal pair of enzymes was a combination of restriction endonucleases SgsI/Eco32I. Application of SgsI/Eco32I enzymes in Xenorhabdus nematophila revealed the identity of the C/s and P strains, while the J strain differed significantly from them. DDSL method makes it possible to identify rearrangements in the genomic DNA for the certification of strains of beneficial bacteria producing bioinsecticides and having antagonistic activity. Thus, this typing technique can be a valuable tool in identification of bacterial strains having antagonistic activity and nowadays used commercially.

Key words: genotyping, DNA, bacterial strains, producers, bioinsecticides.

Citation.

Молекулярно-генетическая идентификация штаммов бактерий-антагонистов фитопатогенов

В.П. Терлецкий^1,2, доктор биологических наук, профессор

¹ФГБОУ ВО ЛО Ленинградский государственный университет им. А. С. Пушкина, 2ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург, г. Пушкин

Актуальность. В силу общемировой тенденции к использованию экологически чистой пищевой продукции микробиологические методы защиты растений от фитопатогенов и насекомых-вредителей приобретают в последнее время особое значение. Среди таких микроорганизмов можно выделить штаммы Xenorhabdus nematophila и Bacillus thuringiensis. Промышленное использование этих бактерий требует регулярного подтверждения их аутентичности оригинальным запатентованным оригиналам из хранящихся коллекций полезных микроорганизмов. Объект. Объектом исследования были бактериальные изоляты, относящиеся к двум видам - Xenorhabdus nematophila и Bacillus thuringiensis. Первый, являясь частью кишечной микробиоты почвенной нематоды, производит вторичные метаболиты, губительные для вредных насекомых. Второй - в определенных условиях обладает ценным качеством, производя устойчивые к внешним условиям споры, являющиеся функционально активным компонентом биопрепаратов. Материалы и методы. Ранее разработанный метод генетической паспортизации бактериальных штаммов, основанный на двойном расщеплении и избирательном мечении фрагментов ДНК (ДРИМ) был использован для молекулярно-генетической идентификации штаммов этих двух видов. В этом методе одновременно используются две эндонуклеазы рестрикции, одна производит усеченные концы, которые могут быть помечены биотинилированным дезоксицитозинтрифосфатом, а другая - тупые концы, не способные к включению метки. В результате - из тысяч фрагментов ДНК только ограниченное число будет нести метку; число и распределение таких меченых фрагментов после электрофореза в обычном агарозном геле легко визуализируется на нейлоновом фильтре. Набор фрагментов характерен для каждого бактериального штамма и является своего рода генетическим паспортом.

Цель работы состояла в применении этого метода для идентификации штаммов бактерий двух видов. Результаты и выводы. На примере Bacillus thuringiensis было показано, что разрешающая способность метода зависит от числа детектируемых фрагментов ДНК. Например, пара ферментов SgrAI/Eco24I генерирует более 25 фрагментов ДНК, в то же время, SgsI/Eco32I - всего несколько.

Чем больше фрагментов ДНК выявляется на фильтре, тем большая дискриминационная способность метода. В случае использования SgrAI/Eco24I все изоляты были разделены на отдельные генотипы за исключением двух - ЕП и Е. Наоборот, пара ферментов SgsI/Eco32I, продуцируя малое число полос на фильтре, не разделила большинство изолятов на генотипы. Что касается энтомопатогенной бактерии Xenorhabdus nematophila, оптимальной парой ферментов была SgsI/Eco32I. Применение ферментов SgsI/Eco32I у Xenorhabdus nematophila показало идентичность изолятов C/s и P, в то же время изолят J существенно от них отличался. Метод ДРИМ способен выявлять перестройки в геномной ДНК бактерий для паспортизации полезных бактерий, продуцирующих биоинсектициды и проявляющих антагонистическую активность. Таким образом, эта методика генотипирования может быть полезным инструментом в идентификации бактериальных штаммов, проявляющих антагонистическую активность и используемых сейчас на практике.

Ключевые слова: бактерии-антагонисты, штаммы бактерий-антагонистов, продуценты, биоинсектициды.

Авторский вклад. Автором этой исследовательской работы была непосредственно проведена экспериментальная часть, разработана, спланирована и выполнена письменная часть рукописи. изучать. Автор этой статьи прочитал и одобрил представленную окончательную версию.

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Введение

Биологический метод контроля над фитопатогенами различной этиологии в последние годы становится все более популярным. Сейчас разработано и внедрено в промышленное производство значительное число антагонистов фитопатогенных бактерий и грибов, а также штаммов-продуцентов биоинсектицидов. К числу востребованных антагонистов можно отнести бактерии видов Xenorhabdus nematophila и Bacillus thurin- giensis [3, 12]. Последний обладает ценным качеством - производство спор, что позволяет конструировать высокостабильные биопрепараты для защиты растений. Xenorhabdus nematophila является частью микробиоты в пищеварительном тракте почвенных нематод и при инвазии насекомых попадает в их кишечник [2, 10]. Бактерии, размножаясь, экскретируют множество метаболитов, приводящих к угнетению и гибели этих вредителей. Данный симбиоз бактерии и нематоды обеспечивает нематоду пищей, а бактерия получает возможность распространяться во внешней среде, используя червя как вектор [7, 9].

Таким образом, эти два вида полезных бактерий являются объектами биотехнологии и могут использоваться в программах биологической защиты растений от фитопатогенов и жесткокрылых насекомых. Многие штаммы бактерий Xenorhabdus производят разнообразные экзоэнзимы. Лецитиназа, производимая X. nematophila, расщепляет фосфолипиды в организме насекомых, обеспечивая получение липидов для роста и развития нематод [1]. Антибиотики, производимые симбиотическими бактериями X. nematophila, могут быть различными у бактериальных штаммов этого энтомопатогенного вида [6].

Потенциальной опасностью промышленного производства биопрепаратов на основе штаммов микроорганизмов является контаминация посторонней микрофлорой, которая может иметь селективное преимущество в процессе размножения, вытесняя, таким образом, полезные бактерии из питательной среды в биореакторе.

Использовавшиеся ранее методы идентификации бактерий, основанные на культуральных и биохимических свойствах, зачастую не дают результата, так как различные бактерии могут иметь сходный профиль этих свойств. Молекулярная генетика, изучающая особенности чередования нуклеотидов в цепи ДНК в разных бактериальных штаммах, позволяет использовать эти данные для точной идентификации микроорганизмов [4]. Современные методы генотипирования позволяют провести паспортизацию биоматериала, доказав идентичность коммерческого штамма в биореакторе запатентованному оригиналу из коллекций полезных микроорганизмов. Существует три группы молекулярно-генетических методов паспортизации: методы, основанные на секвенировании отдельных генов в геномной ДНК, такие как мультилокусное секвенирование (MLST), ПЦР-анализ (MLVA, RAPD) и фрагментный анализ. MLST требует использования дорогостоящего секвенатора и реактивов и часто не дает необходимого разрешения при анализе близкородственных микроорганизмов [5, 8]. Полногеномное секвенирование дает большой объем информации, но этот подход крайне затратный, часто не доступен в обычных микробиологических лабораториях и существует неопределенность, какую часть генома учитывать в сравнениях [13]. Метод со случайными праймерами RAPD является быстрым, недорогим, но характеризуется низкой воспроизводимостью результатов генотипирования [5]. MLVA иногда требует комбинирования с другими методами, так как разрешающей способности недостаточно для определения штаммовой принадлежности. К числу часто используемых методов фрагментного анализа относят метод, основанный на разделении больших фрагментов ДНК в пульсирующем поле - пульс-гель электрофорез. Метод дает хорошее разрешение, но требуется специализированное оборудование (камера) и процесс разделения фрагментов длится несколько дней [11].

Ранее при идентификации бактериальных штаммов - антагонистов был предложен альтернативный вариант фрагментного анализа. Данный метод основан на идее двойного расщепления и избирательного мечения фрагментов ДНК - ДРИМ [4]. Целью исследований было использование метода для генетической идентификации штаммов двух бактериальных видов B. thuringiensis и X. nematophila.

Материалы и методы

Бактериальные культуры выращивали по общепринятым методикам в лаборатории микробиологической защиты ФГБНУ ВИЗР (Санкт-Петербург, Россия). Идентификация бактериальных штаммов на первом этапе подразумевает выделение высокомолекулярной геномной ДНК, пригодной для расщепления эндонуклеазами рестрикции. В связи с тем что бактерии X. nematophila относятся к грам-отрицательным микроорганизмам, их клеточная стенка содержит тонкий слой муреина, который может быть легко разрушен обычными детергентами. Вкратце - лизис клеток проводили с применением 1 % раствора додецилсульфата натрия (SDS) в буфере TES (10 мМ трис - 10 мМ NaCL - 20мМ ЭДТА, рН 8,0). Осажденную центрифугированием ДНК растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис-1мМ ЭДТА, рН 7,5). Выделение геномной ДНК из грамм- положительных бактерий B. thuringiensis требовала предварительного инкубирования клеток в лизоциме, все последующие этапы были аналогичны и для X. Nematophila.

Методика генотипирования бактерий ДРИМ основана на одновременном использовании двух эндонуклеаз рестрикции. Первая расщепляет геномную ДНК на небольшое число фрагментов (20-30), производя «липкие» 3-штрих-усеченные концы, способные к включению метки биотинилированный дезоксицитозинтрифосфат (Bio- dCTP). Вторая - расщепляет чаще (около 1000 сайтов), производя укорочение фрагментов до оптимальной величины при разделении в стандартном агарозном геле. В результате двойного расщепления в смеси будет небольшое число меченых Bio-dCTP фрагментов, которые будут разделены по размеру в 0,8 % агарозном геле. Мечение достигается наличием в реакционной смеси Тод-полимеразы и Bio-dCTP. Все процессы идут одновременно в одной реакционной микропробирке в течение 1 часа при 37 °С. Несмотря на то что Тод-полимераза предпочитает температуру 72 °С, реакцию можно проводить и при 37 °С, обеспечивающей 10% полимеразной активности фермента, что вполне достаточно для мечения фрагментов ДНК. Геномы B. thuringiensis и X. nema- tophilae секвенированы, т.е. известна их полная нуклеотидная последовательность. Используя программу in-silico (http://insilico.ehu.es/DDSL), можем теоретически подобрать оба фермента рестрикции, которые затем тестируются в реальном эксперименте. Поиск in-silico выявил, что оптимальным первым ферментом для X. nematophila является 5gsI, имеющий сайт расщепления GG/CGCGCC, для B. thuringiensis таким ферментом был SgrAI с сайтом расщепления CR^CCGGYG. В реакции достройки (fill-in) Taq- полимераза будет вставлять метку Bio-dCTP в первые две позиции в липких концах фрагментов ДНК. Одновременное укорочение фрагментов ДНК (необходимо для разделения в агарозном геле) происходит при действии второго фермента рестрикции. В отношении X. nematophila используется Eco32I, а для B. thuringiensis - Eco24I. Особенностью второго фермента, помимо большого числа сайтов расщепления, является то, что получаемые фрагменты ДНК имеют тупые концы, в которые Taq-полимераза не может включить метку биотина (Bio-dCTP).

Технически реакция ДРИМ сводится к последовательному внесению в микропробирку на 200 мкл следующих компонентов: 15 мкл дистиллированной воды, 2 мкл 10-кратного буфера для ферментов, 1 мкл ферментной смеси (два фермента рестрикции, Taq-полимераза и метка Bio-dCTP), 2 мкл бактериальной ДНК. Через один час по завершению ферментативных реакций, образец переносится в лунки для проведения электрофореза в трис-ацетатном буфере при напряжении 150 В на 3 часа. После электрофореза ДНК из геля переносится на нейлоновую подложку в аппарате вакуумного переноса в течение 20 минут. В реакции ДРИМ молекулярная гибридизация не проводится, поэтому этапы денатурации и нейтрализации ДНК не требуются, а перенос проходит в дистиллированной воде. После фиксации фрагментов ДНК на фильтре в течение 4 минут под ультрафиолетовым облучением меченые фрагменты ДНК визуализируют с помощью конъюгата стрептивидин-щелочная фосфатаза и цветных реагентов NBT и BCIP (Thermo Fischer Scientific) согласно стандартным протоколам.

Результаты и обсуждение. В генотипировании методом ДРИМ Xenorhabdus nematophila было использовано 3 изолята бактерии, выделенные из разных источников - J, П и C/3 (рисунок 1).

J П С/з к

Рисунок 1 - Генотипирование методом ДРИМ трех изолятов X. nematophila с использованием ферментов SgsI/Eco32I, к - контрольный образец (Bacillus subtilis штамм М-22)

Figure 1 - Genotyping X. nematophila three isolates by DDSL method with

Изолят J генетически сильно отличается от двух других изолятов, которые оказались генетически идентичными. Распределение фрагментов ДНК в изолятах П и C/3 говорит либо о полной генетической идентичности, либо о высокой степени генетической близости. Не исключено, что, используя другие методы генотипирования, удастся их различить. Вероятно, они отличаются друг от друга на уровне всего одного или нескольких генов, которые ускользают при скрининге. При накоплении достаточного числа мутаций в штаммах любой метод генотипирования начинает дискриминировать штаммы, причем, чем большее число фрагментов ДНК учитывается в анализе, тем более чувствительным становится данный метод. Метод ДРИМ позволяет идентифицировать одновременно около 35 фрагментов ДНК, что является рекордным показателем для методов генотипирования (RAPD - 5-10 фрагментов, PFGE - 15-20 фрагментов).

Генотипирование изолятов B. thuringiensis проводили с помощью ферментов SgrAI/Eco24I и SgsI/Eco32I. Выявлена генетическая идентичность штаммов Е/П и Е (рисунок 2, слева). Остальные штаммы отличаются от Е/П и Е и друг от друга по многим фрагментам ДНК, что свидетельствует о значительной генетической дивергенции в этих штаммах.

Рисунок 2 - Генотипирование методом ДРИМ изолятов B. thuringiensis с помощью ферментов SgrAI/Eco24I (слева) и SgsI/Eco32I (справа), М - молекулярный маркер длин фрагментов ДНК, к - контрольный штамм (B. subtilis, штамм В10)

Figure 2 - Genotyping B. thuringiensis by DDSL method with SgrAI/Eco24I (left) and SgsI/Eco32I (right), M - molecular size DNA marker, k - control sample (Bacillus subtilis strain B-10)

Параллельно изучили картину распределения фрагментов ДНК в геноме B. thu- ringiensis при использовании тех же ферментов - SgsI/Eco32I, которые были оптимальными при генотипировании X. nematophila. В связи с тем что SgsI имеет всего несколько сайтов расщепления в геноме B. thuringiensis по данным программы in-silico (http://insilico.ehu.es/), на картине генотипирования видны всего 5-7 фрагментов ДНК (рисунок 2, справа). Такое число фрагментов не позволяет добиться высокого разрешения при идентификации бактериальных штаммов. Например, удается визуализировать две группы идентичных штаммов - Л, 14 и 75, а также Е/П, Е и Т. В то же время генотипирование бактерий другой парой ферментов - SgrAI/Eco24I определяет только два идентичных штамма - Е/П и Е. Остальные штаммы генетически отличаются друг от друга. Наиболее генетически удаленным штаммом является штамм 10, который отличается от всех других штаммов по большинству фрагментов. Это наблюдение подтверждено даже при использовании пары низкоинформативных ферментов SgsI/Eco32I, приводящих к выявлению 5 фрагментов, которые характерны только для данного штамма (рисунок 2, справа).

Выводы

микробиологическая защита растений бактерия экологический

Штаммы Xenorhabdus nematophila С/з и П по данным генотипирования с ферментами SgsI и Eco32I являются генетически идентичными, в то время как штамм J значительно от них отличается.

Генотипирование штаммов Bacillus thuringiensis с применением ферментов SgrAI и Eco24I позволило определить, что штаммы Е/п и Е являются идентичными, остальные штаммы являются генетически уникальными и отличаются друг от друга большим числом фрагментов ДНК, что дает возможность проводить индивидуальную идентификацию (паспортизацию) бактериальных штаммов.

Таким образом, метод ДРИМ можно рекомендовать для проведения детекции нуклеотидного полиморфизма и мелких перестроек генома штаммов-продуцентов биоинсектицидов.

Библиографический список

1.Данилов Л. Г., Зорина Е. А., Нащекина Т. Ю. Антибиотическая активность Xenorhabdus sp. (enterobacteriaceae) симбионтов энтомопатогенных нематод (Rhabditida: Steinernematidae) // Вестник защиты растений. 2017. Т. 3 (93). C. 33-38.

2.Данилов Л. Г., Лайшев К. А., Данилова Т. А. Особенности поведения энтомопатогенных нематод (Nematoda: Steinernematidae) в присутствии мертвых насекомых-хозяев // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2020. № 1. С. 95-104.

3.Эффективность микробиологических препаратов против основных вредителей овощных, ягодных культур и картофеля в Ленинградской области / С. А. Доброхотов, А. И. Анисимов, С. Д. Гришечкина, Л. Г. Данилов, Г. Р. Леднев, К. Н. Фурсов // Сельскохозяйственная биология. 2015. Т. 50. № 5. С. 694-704.

4.Эффективный метод генетической паспортизации штаммов Bacillus subtilis - перспективных продуцентов биопрепаратов / В. П. Терлецкий, В. И. Тыщенко, И. И. Новикова, И. В. Бойкова, С. Д. Тюлебаев, И. Я. Шахтамиров // Микробиология. 2016. Т. 85. № 1. С. 50-55.

5.A Novel Target Pathogen Identification and Tracking System Using Capillary Electrophoresis-Random Amplified Polymorphic DNA / W. J. Lin, C. Y. Tung, M. Y. Yen, Yu. J. Chan, C. H. Lin, P. R. Hsueh // Sci Rep. 2018. V. 8. P. 15365.

6.Booysen E., Dicks L. M. T. Does the Future of Antibiotics Lie in Secondary Metabolites Produced by Xenorhabdus spp.? // A Review. Probiotics Antimicrob Proteins. 2020. V. 12 (4). P.1310-1320.

7.Fabclavine diversity in Xenorhabdus bacteria / S. L. Wenski, H. Cimen, N. Berghaus, S. W. Fuchs, S. Hazir, H. B. Bode // Beilstein J. Org. Chem. 2020. V. 16. P.956-965. DOI: 10.3762/bjoc.16.84.

8.Humphreys H., Coleman D. C. Contribution of whole-genome sequencing to understanding of the epidemiology and control of meticillin-resistant Staphylococcus aureus // J. Hosp. Infect. 2019. V. 102 (2). P. 189-199.

9.PirAB protein from Xenorhabdus nematophila HB310 exhibits a binary toxin with insecticidal activity and cytotoxicity in Galleria mellonella / Q. Yang, J. Zhang, T. Li, S. Liu, P. Song, Z. Nangong, Q. Wang // J. Invertebr. Pathol. 2017. V. 148. P. 43-50.

10.Raymond B., Federici A. In defense of Bacillus thuringiensis, the safest and most successful microbial insecticide available to humanity - a response to EFSA // FEMS Microbiol. Ecol. 2017. V. 93. No 7.

11.Rumore J. L., Tschetter L., Nadon C. The Impact of multilocus variable-number tandemrepeat analysis on PulseNet Canada Escherichia coli O157:H7 laboratory surveillance and outbreak support, 2008-2012 // Foodborne Pathog. Dis. 2016. V. 13 (5). P. 255-261.

12.Systematic characterization of Bacillus Genetic Stock Center Bacillus thuringiensis strains using Multi-Locus Sequence Typing / K. Wang, C. Shu, M. Soberon, A. Bravo, J. Zhang // J. Invertebr. Pathol. 2018. V. 155. P. 5-13.

13.Whole genome sequencing options for bacterial strain typing and epidemiologic analysis based on single nucleotide polymorphism versus gene-by-gene-based approaches / A. C. Schurch, S. Arredondo- Alonso, R. J. L. Willems, R. V. Goering // Clin. Microbiol. Infect. 2018. V. 24 (4). P. 350-354.

Размещено на Allbest.ru