Особенности определения чувствительности микроорганизмов к сорбционным препаратам на основе силикатов естественного происхождения

Размещено на http://www.allbest.ru

Особенности определения чувствительности микроорганизмов к сорбционным препаратам на основе силикатов естественного происхождения

В.Д. Буханов

А.И. Везенцев

В.Н. Карайченцев

Аннотация

Предпосылками, обусловливающими данный научный труд, послужили длительные эксперименты, в результате которых сформировались оптимальные решения при определении чувствительности микроорганизмов к сорбционным препаратам на основе силикатов естественного происхождения. Цель данного исследования заключается в разработке методов определения чувствительности микроорганизмов к сорбционным препаратам и подготовке методических рекомендаций по их применению. Ввиду отсутствия методики определения чувствительности микроорганизмов к сорбционным препаратам появилась необходимость в создании современной клинически обоснованной разработки на основании существующих МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». В статье рассмотрены наиболее значимые положения при определении чувствительности in vitro микроорганизмов к сорбционным препаратам методом последовательных разведений в жидкой питательной среде. Обсуждены вопросы интерпретации результатов определения чувствительности микроорганизмов к сорбционным препаратам с клинической и микробиологической точек зрения. В разработанных методических указаниях систематизированы современные подходы определения чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных к сорбционным препаратам, учитывающие рекомендации Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам, а также Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США.

Ключевые слова: силикаты, сорбционные препараты, определение чувствительности микроорганизмов, метод последовательных разведений.

FEATURES OF DETERMINING THE SENSITIVITY OF MICROORGANISMS TO SORPTION

PREPARATIONS BASED ON SILICATES OF NATURAL ORIGIN

Abstract. The prerequisites for this scientific work were long-term experiments, as a result of which optimal solutions were formed in determining the sensitivity of microorganisms to sorption drugs based on silicates of natural origin. The purpose of the study: It consists in the development of guidelines for determining the sensitivity of microorganisms to sorption drugs. Research materials and discussion of the results: Due to the lack of a methodology for determining the sensitivity of microorganisms to sorption drugs, it became necessary to create a modern clinically sound development based on the existing MUK 4.2.1890-04 “Determining the sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs”. The article discusses the most significant provisions in determining the sensitivity of in vitro microorganisms to sorption drugs by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium. The issues of interpreting the results of determining the sensitivity of microorganisms to sorption drugs from a clinical and microbiological point of view are discussed. Conclusions: The developed methodological guidelines systematize modern approaches to determining the sensitivity of bacterial pathogens of infectious diseases of humans and animals to sorption drugs, taking into account the recommendations of the European Committee for the Determination of Sensitivity to Antibiotics, as well as the US National Committee for Clinical Laboratory Standards.

Keywords: silicates, sorption preparations, determination of the sensitivity of microorganisms, serial dilution method.

Введение

чувствительность микроорганизм сорбционный

В литосфере Земли класс силикатов самый обширный, он представляет собой породообразующие минералы магматических, метаморфических горных пород, это - 95 мас. % земной коры. Главной составляющей единицей во всех силикатах является кремнекислородный тетраэдр [SiO4]4' - анионный комплекс, где атом кремния находится в окружении четырех атомов кислорода. Алюминий - второй по распространению химический элемент земной коры, может замещать кремний в [SiO4]4- группах и создавать анионные группы [АЮ4]5'. В отдельных соединениях алюминий выявляется как в качестве катиона, так и в анионной группировке, замещая позиции кремния. Минералы, содержащие ^Ю4]-группы, называются силикатами, а минералы, в составе которых находятся [АЮ4]-группы, относятся к их аналогам, относящимся к таксономической разновидности - алюмосиликаты [2].

В технологических циклах промышленного производства природные силикаты и сам кремнезем являются основным сырьем. В керамической, стекольной и цементной промышленности используют алюмосиликаты - плагиоклазы, калиевый полевой шпат и кремнезем - в качестве основного сырья. В производстве жаропрочных текстильных изделий, имеющих электроизоляционные свойства (ткани, шнуры, канаты), в значительном объеме применяются асбесты, принадлежащие гидросиликатам - амфиболам. Отдельные разновидности асбестов, имея определенный уровень кислотостойкости, необходимы для химической промышленности. Стоит отметить, что в строительстве и приборостроении целесообразно использовать как электро- и теплоизоляционные материалы биотиты (представители группы слюд). Для металлургии и в каменно-литейном производстве нужны пироксены, при этом металлический литий извлекают из пироксена LiAl [БЬОб]. Кроме того, в народном хозяйстве пироксены, состав которых близок к составу смесей цемента, присутствующие в доменных шлаках и шлаках цветной металлургии в виде силикатного шлакового остатка, необходимы для изготовления стройматериалов. Также в градостроении практичными материалами могут служить горные породы: гранит, базальт, габбро и диабаз [21]. Принцип классификации силикатов основан на их кристаллохимической структуре и виде связей кремнекислородных тетраэдров. Обычно структурные единицы тетраэдров в силикатах присутствуют автономно, но иногда вершины тетраэдров соединяются посредством атомов кислорода. На основании существующей конфигурации силикаты подразделяются на ряд подклассов, характеризующихся отличительными особенностями структуры и стандартными анионными группировками: островные, кольцевые, цепочечные, ленточные, слоевые, каркасные.

Подкласс слоистых силикатов и гидроалюмосиликатов составляют тальк, серпентин, разнообразные слюды, хлориты, глинистые и другие минералы. Их характерная особенность обусловлена изовалентным и гетеровалентным изоморфизмом. Неординарное строение кристаллических структур, ослабленные межпакетные связи создают благоприятные условия для образования слоевыми минералами тонкодисперсных агрегатов. Редко регистрирующиеся большие, хорошо ограненные кристаллы флогопита, мусковита, хлорита, хрупких слюд также относятся к минералам этой подгруппы. Глинистые минералы (бейделлит, нонтронит, монтмориллонит) подкласса слоистых силикатов из группы смектитов (монтмориллонита) представлены трехслойными пакетами. Указанные минералы имеют диоктаэдрическое строение, содержат в своем составе связанную воду, обладают избыточным количеством катионов Ca2+ и Na+, набухают в присутствии воды, проявляют адсорбционные и ионнообменные свойства. Наиболее распространенным минералом из группы смектитов считается монтмориллонит - главный породообразующий минерал бентонитовых глин [2].

На данный период времени применение препаратов с высокой сорбционной емкостью на основе силикатов естественного происхождения при острых кишечных инфекциях представляет определенный интерес, так как они обладают высокой эффективностью и минимумом возможных отрицательных проявлений. Натуральный состав, невысокие цены и широкий ассортимент наименований кремнийсодержащих энтеросорбентов, представленных на фармацевтическом рынке РФ, сделали их популярными как среди врачей разных специальностей, так и среди пациентов [15, 18].

За рубежом наиболее распространенными энтеросорбентами (на основе природных глинистых минералов) являются Смекта (производства компании Ipsen, Франция) и Аттапуль- гит (производства компании Geohellas S.A., США) [1, 19]. Благодаря простоте, безопасности и экономичности энтеросорбция в качестве детоксикационной терапии успешно применяется в клинической практике при лечении различных заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Залог успеха энтеросорбции в том, что отсутствуют противопоказания к ее применению, а возможность комбинации с другими лекарственными средствами позволяет индивидуализировать лечебную тактику, избежать побочных эффектов терапии и достичь высокой эффективности лечения при сокращении его длительности. Устранение интоксикационного синдрома при различных заболеваниях основано на способности энтеросорбентов связывать и выводить из организма различные экзогенные вещества, микроорганизмы и их токсины, эндогенные промежуточные и конечные продукты обмена, способные накапливаться или проникать в ЖКТ в ходе течения патологического процесса [3]. Одной из особенностей эффективного применения антибактериальных препаратов при инфекционных заболеваниях является определение чувствительности возбудителя болезни к лекарственным средствам. Это способствует выбору наиболее результативного лечебного соединения из большого числа медикаментов, выпускаемых биологической промышленностью, и для замены длительно используемого препарата другим, если регистрируется развивающаяся к нему устойчивость микроорганизмов. Определение чувствительности также проводят при наблюдении за распространением резистентности среди микроорганизмов и в процессе изучения новых препаратов [10].

Залог успеха антибактериальной терапии лежит в клиническом эффекте эмпирического или этиотропного пути назначения лекарственных средств. Алгоритм медикаментозного лечения эмпирическими антибиотиками проводится в течение 1 - 4 ч после постановки диагноза болезни, протекающей в тяжелой форме. Эмпирическое назначения антибиотиков - это один из реальных вариантов срочной терапии, исключающей расходы на проведение дополнительных исследований. Такой подход обосновывается совокупностью научных сведений о естественной чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам, эпидемиологических данных о существующей резистентности микроорганизмов на региональном уровне или в стационаре и результатах ранее проведенных клинических исследований. В отдельных случаях пониженная результативность эмпирического назначения антибиотиков при нозокомиальных инфекциях из-за сложности выявления внутрибольничного этиотропного возбудителя болезни и отсутствия данных о его чувствительности к антибактериальным препаратам приводит к тому, что лечащие врачи, как правило, проводят этиотропную терапию. Этиотропная терапия предусматривает целевое использование антимикробных препаратов, аргументированное наличием показаний для назначения антибактериального средства, таких как: своевременное выполнение необходимых этапов бактериологического исследования, выделение патогенного микроорганизма из очага инфекции или клинического материала с последующим выяснением чувствительности изолированного штамма к антибиотикам и интерпретации результатов бактериологического исследования [16].

Высокий процент эффективности химиотерапии обусловливается справедливым выбором лечебного препарата, отвечающего критериям ингибирования роста возбудителя заболевания или оказывающего бактерицидное действие при постановке стандартных исследований. Европейский комитет по определению чувствительности микрооганизмов к антимикробным препаратам (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing - EUCAST) также советует устанавливать опытным путём особенности комплексного подхода при этиотропной терапии, способствующей ликвидации возбудителя заболевания. Согласно данным EUCAST, антибиотики, как химиотерапевтические соединения, причисляются к веществам природного, полусинтетического и синтетического происхождения. Их избирательная активность, касательно инфекционного начала, дает неоспоримое основание для целенаправленного применения антибиотиков в клинической практике при лечении инфицированных людей и животных. Акцентируя внимание на антисептики, дезинфектанты и консерванты EUCAST подчеркивает, что эти препараты к антибиотикам не относятся, а широко используемый в русскоязычной литературе термин «антибиотикочувствительность» следует рассматривать как аналог термина «antimicrobial susceptibility» (антимикробная чувствительность) [22]. Определение чувствительности микроорганизмов бактериальной природы к химиотерапевтическим препаратам делится на две группы лабораторных исследований, таких как диффузионные и методы серийных разведений. Обычно выяснение чувствительности микроорганизмов рекомендуется проводить на специализированных питательных средах, санкционированных к употреблению в Российской Федерации, с диапазоном рН 7,2-7,4. В работе диско-диффузионным методом используют агар Мюллера-Хинтона (МХА), на который помещают стандартные диски, пропитанные раствором антибиотика с заведомо известной концентрацией, или проводят исследования с помощью Е-тестов. Под методами серийных разведений подразумевают последовательные серийные разведения лекарственного средства в МХА, разогретого до 42 - 45°С, или в бульоне Мюллера-Хинтона (МХБ). Если некоторые бактерии проявляют повышенные требования к питательным средам, то в МХА или МХБ дополнительно вносят 2-5 % дефибрини- рованной лошадиной или бараньей крови и 20 мг/л P-NAD (Р-никотинамидадениндинуклео- тид), который представляет собой кофермент, играющий важную роль в обмене веществ в живых клетках. В свою очередь, перед добавлением в питательную среду дефибринированную кровь подвергают лизированию посредством замораживания и оттаивания, затем ее центрифугируют для освобождения от теней эритроцитов, т. е. мембранных оболочек эритроцитов. Указанные стимуляторы роста, соблюдая условия стерильности, вносят в питательную среду после ее автоклавирования и охлаждения до 48 - 50°С [8, 13].

Из рассмотренных методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам может быть применен любой, причем во внимание принимается только степень разведения навески препарата. Однако быстро развивающаяся резистентность возбудителей к антибактериальным соединениям, иммунодепрессивные свойства лекарственных препаратов, нарушения микроэкологии и возрастание этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов под влиянием терапевтических средств побуждают исследователей к поиску новых путей оптимизации лечебного процесса [12, 17]. Антибиотикорезистентность болезнетворных микроорганизмов является закономерным явлением интенсивного и нерационального применения антибактериальных препаратов [9]. Перспективным направлением решения этих проблем является применение натуральных сорбентов, которые безопасны для организма человека и животных. Они инактивируют патогенные микроорганизмы и выводят из организма продукты их жизнедеятельности, а также продукты нарушенного метаболизма и токсичные соединения, полученные из внешней среды. В результате развития современной науки на смену общепринятым медицинским технологиям пришли методы эфферентной терапии (от латинского «efferent» - «выводить»). Они повышают эффективность традиционного лечения, а иногда и полностью заменяют его. Эти методы доступны и являются весьма эффективными, так как с помощью сорбентов и комплексных препаратов на их основе можно корригировать состояние раны, функцию желудочно-кишечного тракта и снижать общую токсическую нагрузку на организм [5, 11].

Анализ литературных источников свидетельствует, что зафиксированные механизмы действия сорбентов исключают химические реакции с сорбируемым веществом и не порождают существенных сдвигов в биохимических показателях крови. Во время процесса физиологической фильтрации жидкости и ее реабсорбции ворсинками слизистой оболочки кишечника в жидкости, вышедшей из сосудистого русла в просвет пищеварительного канала, содержатся различные продукты обмена веществ, в том числе и вредные для организма токсические соединения, которые легко адсорбируются и элиминируются вместе с энтеросорбентом, заранее введенным внутрь. Учитывая тот факт, что ворсинки кишечника обладают фильтрующей активностью относительно веществ с молекулярной массой, не превышающей размер молекулы белка альбумина, можно утверждать, что во многих случаях токсичные субстанции в своей основе имеют среднемолекулярную массу. В связи с этим становится понятной эффективность энтеросорбции в ликвидации эндотоксикозов [14].

Отрицательным фактором ряда сорбентов является сорбция витаминов, минеральных солей и других полезных веществ, а также неспецифическая сорбция ферментов (пепсина, трипсина, амилазы), что требует коррекции заместительной терапии ферментными препаратами. Что касается диоксида кремния коллоидного, то при исследовании длительного введения препарата в разных дозах было выявлено, что в терапевтических дозах он не вызывает заметных сдвигов в активности ферментов слизистых оболочек кишечника, отличается меньшим (по сравнению с другими сорбентами) выведением витаминов, микроэлементов и быстрым восстановлением их до обычных уровней без дополнительной лекарственной нагрузки [20].

Чтобы достичь оптимально эффективного использования сорбентов, им необходимо придать целенаправленную селективность путем иммобилизации на их поверхности характерных лигандов и рецепторов. В роли таких лигандов могут быть различные соединения: микро- и макроэлементы, кластеры металлов, витамины, ферменты, аффинные рецепторы на конкретные биомолекулы, адаптогены, биологически активные добавки, антибиотики, цитокины. иммуномодуляторы, иммуноглобулины, антигены, вирусы и бактерии или их отдельные структурные компоненты. Стабильная иммобилизация лигандов препятствует их смыванию с поверхности сорбента, при этом они не проникают в организм, а ослабленная иммобилизация лигандов рассчитана на то, чтобы они довольно свободно десорбировались и легко всасывались из просвета кишечника [6].

По механизмам сорбции различают адсорбенты (Полисорб, Энтеросгель), абсорбенты (активированный уголь), ионообменные материалы, сорбенты с катаболическими свойствами, сорбенты с сочетанными механизмами. По селективности - селективные, моно- би-, поли- функциональные, неселективные (угли активированные, природные препараты - лигнин, хитин, целлюлоза) [4]. К числу энтеросорбентов могут быть отнесены препараты различной структуры, которые способны связывать вещества, надмолекулярные комплексы и клетки путем адгезии, адсорбции, абсорбции, ионообмена и комплексообразования. Все энтеросорбенты можно разделить на 4 основные класса:

угольные (различные марки активированных углей);

волокнистые (пищевые волокна и их производные);

минеральные (глины, цеолиты и др.);

синтетические полимеры (поливинил, кремнийорганические сорбенты) [7].

Ввиду отсутствия методики определения чувствительности микроорганизмов к сорбционным препаратам появилась необходимость в создании современной клинически обоснованной разработки на основе существующих МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» [13]. Предпосылками, обусловливающими данный научный труд, послужили длительные эксперименты, в результате которых сформировались оптимальные решения.

Цель данной работы - разработка методов определения чувствительности микроорганизмов сорбционным препаратам и составление соответствующих методических рекомендаций. Мотивацией этой работы послужили следующие причины:

концентрация сорбента, в отличие от антибактериального препарата, при определении чувствительности микроорганизмов исчисляется не в мкг/мл, а в мг/мл питательной среды;

проведение данного рода исследований на плотной питательной среде приводит к ее повышенному расходу и требует большого количества лабораторной посуды (колб, пробирок, чашек Петри), что очень затратно;

трудоемкая работа, связанная с серийными разведениями сорбента в расплавленном агаре, часто сопровождается быстрым застыванием разогретого агара и неравномерным суспендированием сорбента;

использование дисков не дает достоверных результатов из-за сложности нанесения сорбента на диск, изготовленный из фильтровальной бумаги, и отсутствия диффундирования сорбента в агар.

Материал и методы исследования. Экспериментальные исследования по определению чувствительности микроорганизмов к сорбционным препаратам проводили в специально сертифицированной лаборатории НИУ БелГУ в целях обеспечения инфекционной безопасности.

Приготовление пробирок с МХБ и чашек Петри с МХА. МХБ и МХА приготавливали и автоклавировали согласно инструкции изготовителя. Перед автоклавированием МХБ разливали по флаконам (по 400 мл), коническим колбам (по 250 мл) и пробиркам (по 5 и 9 мл). МХА во время приготовления разливали по стеклянным флаконам по 250 мл. После автоклавирования МХА охлаждали до 42 - 45°C и стерильно разливали по чашкам Петри таким образом, чтобы толщина агара составляла 4,0±0,5 мм. Поверхность агара перед использованием должна быть сухой. При необходимости агар подсушивали, время подсушивания зависит от условий хранения и внешней среды. Нельзя пересушивать агар.

Метод последовательных разведений. Определение чувствительности эталонных тест-культур условно-патогенных микроорганизмов к сорбционно-активным препаратам осуществляли в жидкой питательной среде (МХБ) стандартизованным методом серийных разведений. Каждый ряд разведений состоял из 8 пробирок, содержащих по 5 мл МХБ. В первой пробирке концентрация сорбента составляла 200 мг/мл МХБ, а в каждой последующей - в два раза меньше. Предварительно подготовленные навески сорбционно-активных материалов помещали в пробирки в следующем количестве: в первую пробирку - 1000,0, во вторую - 500,0, в третью - 250,0, в четвёртую - 125,0, в пятую - 62,5, в шестую - 31,25, в седьмую - 15,63, в восьмую - 7,82 мг. Далее пробирки с навесками сорбентов закрывали силиконовыми пробками, выдерживающими температуру до 250°С, и подвергали стерилизации в сушильном шкафу при температуре 160°С в течение 20 мин.

Если на основе природного сорбента изготовлен комплексный препарат, то нанесение термолабильного лекарственного средства на сорбент осуществляли после его стерилизации. Затем в каждую пробирку вносили 5,0 мл стерильного МХБ и 0,1 мл исследуемой суточной культуры бактерий (1 млн. микробных клеток), что составляет 200000 микробных клеток на 1 мл МХБ (2 х 105 КОЕ в 1 мл МХБ). Концентрацию микроорганизмов устанавливали с помощью прибора для определения мутности бактериальной суспензии Densi-La-Meter II, принцип работы которого основан на оптической абсорбции суспензии с выдачей результата измерения в единицах по МакФарланду.

Приготовление инокулята. Для приготовления инокулята использовали метод прямого суспендирования в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида колоний чистой 18 - 24-часовой культуры бактерий, выросшей на плотной неселективной питательной среде. Бактериальную суспензию инокулировали в пробирках с разведениями сорбента в течение 15 минут, но не позже 60 минут после приготовления.

При этом концентрация сорбента в МХБ с первой по восьмую пробирку каждого ряда соответственно составляла: 200,0; 100,0; 50,0; 25,0; 12,5; 6,25, 3,13 и 1,56 мг/мл. Девятую и десятую пробирки ряда использовали в качестве контроля. В девятой пробирке содержалось только 5 мл МХБ, а в десятой - 5 мл МХБ и 1 млн. микробных клеток исследуемой эталонной тест-культуры. Во второй контрольный ряд идентичных разведений сорбционно-активных материалов («отрицательный» контроль) в 5 мл МХБ (8 пробирок) эталонный штамм бактерий не вносили.

Инкубация. Подготовленное должным образом содержимое опытных и контрольных пробирок суспендировали с помощью мешалки «Вортекс V-1 plus». После чего подвергали культивированию в течение 16-18 часов в термостате при температуре 37°С. Затем производили учёт полученных результатов.

Учет результатов определения чувствительности микроорганизмов к сорбентам.

Минимальную концентрацию сорбента (мг/мл), полностью подавившую видимый рост микроорганизмов, принимали как МПК. Установленную МПК сорбента считали бактериостатической. Достоверность полученного результата подтверждали показаниями Денсиламетра (Densi-La-Meter), на котором определяли оптическую плотность суспензии в идентичных разведениях сорбента опытного и контрольного ряда пробирок. В случаях, когда высокая концентрация сорбционно-активного материала в МХБ с первой по третью пробирку опытного и контрольного рядов не позволяет пользоваться денсиламетром из-за сформировавшихся больших осадков сорбента на дне пробирки, надседиментационную плотность суспензии в МХБ определяют путем визуального сравнения со стандартом мутности по МакФарланду на белом фоне с черными линиями. Стандарты мутности МакФарланда представляют собой набор пробирок с увеличивающейся концентрацией сульфата бария. Мутность суспензии, образованная белым преципитатом сульфата бария, является величиной, соответствующей определённой концентрации бактериальной суспензии. Набор содержит 5 пробирок (по одной пробирке каждого стандарта МакФарланда: 0.5, 1, 2, 3 и 4 ед.). Перед использованием стандарта мутности энергично встряхивали на «Вортексе». По разности показателей Денсиламетра и стандартов мутности МакФарланда опытных и контрольных пробирок с двукратными разведениями сорбентов судят о способности исследуемых образцов подавлять рост микроорганизмов. Мутность бактериальной суспензии в единицах по МакФарланду ориентировочно будет соответствовать количеству КОЕ жизнеспособных микроорганизмов в единице объема (1 см3), в жидкости (1 мл), в конкретном случае - в 1 мл МХБ.

Установление минимальной бактерицидной концентрации (МБК) исследуемых сорбентов. С целью выявления бактерицидного действия исследуемых сорбентов из содержимого трех последних пробирок опытного ряда, где отсутствовал видимый рост тест-культуры, стерильной пипеткой отбирали 0,1 мл суспензии и производили посевы на МХБ или МПБ с последующим культивированием в течение 16-18 часов в термостате при температуре 37°С. Если после культивирования не отмечалось образование колоний на агаре или в бульоне, то наименьшая концентрация сорбента в пробирке, из которой был произведен посев, проявляет МБК. Определение чувствительности микроорганизмов к исследуемым сорбентам проводили трижды, до получения сопоставимых результатов. Контролем роста тест-культуры в каждом опытном ряду служила десятая пробирка с наличием роста микроорганизмов, а контролем стерильности МХБ - девятая пробирка ряда. Интактный ряд пробирок (8 пробирок без инокулята) являлся контролем стерильно выполненных двукратных разведений сорбента в МХБ.

Результаты собственных исследований и их обсуждение. Определение чувствительности микроорганизмов к сорбционным препаратам на основе силикатов естественного происхождения методом серийных разведений в МХБ требует наличия определенных навыков и знаний для проведения соответствующего уровня исследований. А именно, начиная от приготовления питательных сред, стерильных навесок препарата и инокулюма, завершая учетом результатов и контролем качества роста изучаемого штамма микроорганизма. Внесение даже небольших изменений в общепринятую методику может привести к получению неверных результатов, способных в дальнейшем ввести в заблуждение как микробиологов, так и клиницистов. Учитывая эти факты, надлежит сопоставить методику определения чувствительности бактерий на плотной питательной среде, апробированную в предварительных исследованиях (рис. 1), с идентичной методикой на жидкой среде (рис. 2). На поверхности плотной питательной среды опытной чашки при концентрации модифицированной калиевой формы сорбента 200 мг/мл выросло эшерихий в 2,2 раза меньше, чем в контроле (рис. 1). При этом было установлено, что проведение исследований на плотной питательной среде сопровождается повышенным расходом МХА и увеличением в потребности лабораторной посуды (колб, мерных пипеток, пробирок, чашек Петри), что очень затратно. Трудоемкая работа, связанная с серийными разведениями комплексного препарата в расплавленном МХА, часто сопровождается быстрым застыванием разогретого агара, кроме того, не всегда качественное размешивание исследуемой субстанции может повлечь низкую достоверность и повышенную сложность интерпретации полученных результатов. Из вышесказанного следует заключить: на плотной питательной среде определять чувствительность микроорганизмов к сорбционным препаратам нецелесообразно.

Рис. 1 - Результат опыта по определению чувствительности Escherichia coli ATCC25922 к модифицированной калиевой форме сорбента на МХА

Рис. 2 - Рост Staphylococcus aureus ATCC 25923 в МХБ и седиментация сорбционно-активного материала после 18-ти часовой экспозиции в термостате

Весьма экономичным, простым и наиболее точным в исполнении при определении чувствительности возбудителей инфекционных заболеваний к антибактериальным препаратам на основе силикатов естественного происхождения является метод последовательных серийных разведений лекарственного средства в МХБ.

В качестве примера приводятся данные, установленные опытным путём, о чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к наноструктурным сорбционно-активным материалам, разработанным группой ученых НИУ БелГУ под руководством профессора А. И. Ве- зенцева: магниевой форме монтмориллонита, железосодержащей форме монтмориллонита, гидроксилапотиту, композиционному гидроксилапотиту синтезированному на поверхности частиц монтмориллонита слагающего бентонитовую глину (Mg-ММТ, Fe-ММТ, ГАП и КБГ). Эти препараты получены на основе обогащённых глин, унифицированных ионами Mg2+ , Fe3+ и ГАП.

Высокая концентрация сорбционно-активного материала в МХБ с первой по третью пробирку в каждом опытном ряду разведений не позволяла пользоваться денсиламетром из-за сформировавшихся больших осадков (рис. 2). Тождественное количество сорбционно-активного материала в МХБ с первой по третью пробирку контрольного ряда идентичных разведений («отрицательный» контроль, не подвергавшийся инокуляции исследуемого микроорганизма) создало такую же ситуацию. В этих случаях надседиментационную суспензию в МХБ исследовали путем визуального сравнения со стандартом мутности по МакФарланду.

В оставшихся пробирках каждого ряда разведений, в том числе в пробирках с контролем роста исследуемого штамма бактерий и стерильности МХБ, концентрацию микроорганизмов и оптическую абсорбцию суспензии выявляли с помощью денсиламетра в единицах по МакФарланду.

В таблице 1 приведены показатели денсиламетра и стандартов мутности по МакФарланду опытных и контрольных пробирок с двукратными разведениями сорбентов, свидетельствующие о наличии или отсутствии роста исследуемых микроорганизмов.

Таблица 1 - Результаты наличия или отсутствия роста микроорганизмов в опытных и контрольных пробирках с идентичной концентрацией сорбционно-активного материала без инокулюма

Примечание: 1 по шкале МакФарланда соответствует 3х108 КОЕ/мл

Данные таблицы 1 демонстрируют не всегда, казалось бы, обоснованную закономерность показателей денсиламетра и стандартов мутности по МакФарланду (высокая концентрация сорбента должна соответствовать повышению цифровых значений денсиламетра, стандартов мутности по МакФарланду и наоборот) в контрольных пробирках с двукратными разведениями исследуемых сорбентов в МХБ. Зафиксированные данные, «противоречащие смыслу», ярко проявились при двукратных разведениях Fe-ММТ, ГАП и КБГ. Объяснением выявленной особенности можно считать тот факт, что чем меньше концентрация коллоидной системы, тем более минимальное влияние частицы оказывают друг на друга (не соударяются, не слипаются). За счет этого частицы оседают почти свободно под действием силы тяжести. Чем меньше размер частиц, тем меньше скорость оседания, поэтому такие коллоидные системы являются более устойчивыми и долго сохраняются во взвешенном состоянии. Соответственно, чем больше концентрация частиц, тем быстрее они оседают за счет агрегации, слипания и, как следствие, увеличения массы, что способствует менее агрегативно устойчивому состоянию.

По разности показателей денсиламетра и стандартов мутности по МакФарланду опытных и контрольных пробирок с двукратными разведениями сорбционных препаратов на основе силикатов судили о способности разработанных образцов подавлять рост исследуемых микроорганизмов (табл. 2).

Таблица 2 - Чувствительность микроорганизмов к модифицированным сорбционно-активным монтмориллонит содержащим глинам

Анализ сведений таблицы 2 неоспоримо свидетельствует, что ингибирующее действие даже высоких концентраций (100 - 200 мг/мл МХБ) наноструктурных сорбционно-активных материалов (Mg-ММТ, Fe-ММТ, ГАП и КБГ) на кишечную палочку отсутствует. В то же время при содержании повышенных концентраций Mg-ММТ, Fe-ММТ, ГАП и КБГ в диапазоне до 200 мг/мл МХБ не способствует бурному росту эшерихий, а при уровне комплексных сорбентов в минимальной концентрации 3,125 мг/мл МХБ, количество кишечных палочек возрастает в 1,5 - 12 раз.

Руководствуясь полученными данными, можно вполне определённо сказать: антимикробная активность Mg-ММТ, Fe-ММТ и ГАП в отношении золотистого стафилококка отсутствует. Однако из всех протестированных сорбентов лишь КБГ оказал бактериостатическое действие на стафилококк при концентрации 200 мкг/мл МХБ. При этом бактерицидного действия КБГ

не наблюдалось, поскольку в посевах из пробирки, где отсутствовал рост (первая пробирка опытного ряда), на МХБ регистрировался рост стафилококка.

Механизм данного процесса обусловливается адгезией липополисахаридных и белковых компонентов клеточных стенок Staphylococcus апгвш с кремнийорганической матрицей монтмориллонит содержащей глиной и гидроксилапатитом - Ca10(PO4)6(OH)2, имеющим высокоразвитую пористую биоактивную поверхность. В итоге быстрая адгезия бактерий на комплексных лигандах монтмориллонит содержащей глины и гидроксиапатита сопровождается деструкцией микробной стенки.

Выводы

Таким образом, в подготовленных нами методических указаниях систематизированы современные подходы по определению чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных к сорбционным препаратам. Указания составлены с учетом рекомендаций Европейского комитета по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, а также Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США. Данные рекомендации окажут существенную помощь практикующим врачам и научным сотрудникам, занимающимся лечением, изысканием и разработкой комплексных антибактериальных препаратов на основе силикатов естественного происхождения. Высокий процент терапевтической эффективности будет обусловлен справедливым выбором лекарственного средства, отвечающего достоверно установленным критериям ингибирования роста возбудителя болезни.

Библиография

Аленкина, Т. В. Перспективные сорбционные материалы для конструирования антитоксического холерного энтеросорбента / Т. В. Аленкина и др. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2013. - № 2. - С. 66 - 69.

Ананьева Л. Г. Минералогия. Класс силикатов: учебное пособие / Л.Г. Ананьева; Национальный исследовательский Томский политехнический университет. - Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2011. - 77 с.

Балукова Е. В. Детоксикационная терапия при хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта / Е. В. Балукова // Медицинский совет. - 2018. - №14. - С. 50-55.

Беляков Н. А., Соломенников А. В. Энтеросорбция (введение в проблему) / Н. А. Беляков, А. В. Соломенников. - Л., 1990. - 35 с.

Бородин Ю. И. Сорбционно-аппликационные и лимфотропные методы в комплексном лечении ожогов / Ю. И. Бородин, М. С. Любарский, А. Ю. Летягин и др. Новосибирск: СибВО, 1995. - 142 с.

Бурмистров В. А. Специфические сорбенты для профилактики и лечения различных заболеваний [Электронный ресурс] / В. А. Бурмистров, Л. Н. Рачковская, М. С. Любарский, Ю. И. Бородин, В. И. Коненков ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, ООО НПЦ «Вектор-Вита». - Режим доступа: http: // vector-vita.narod.ru / Documents / papers / 2007_nano_64.htm/ (дата обращения: 10.06.2020).

Дружинин П. В. Основные принципы и методы детоксикации организма [Электронный ресурс] / П. В.

Дружинин, Л. Ф. Новиков, Ю. А. Лысиков. - 2011-06-30.-Режим доступа: http://on-line-

wellness.com/view_post.php?id =116/(дата обращения: 10.06.2020).

Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» / Утверждены: Совещанием рабочей группы по медицинской микробиологии профильной комиссии МЗ РФ по КЛД (Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии (ХУЛ Кашкинские чтения), 9-11 июня 2014,Санкт-Петербург). - Изд-во: Россия, Санкт-Петербург, НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, 2014. - 154 с.

Козлов Р. С. Антимикробные препараты и резистентность микроорганизмов: две стороны медали / Р. С. Козлов // Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. - М., 2007 - № 3 - С. 3032.

Лабораторные исследования в ветеринарии [Текст]: [Справочник] / Сост. П. М. Волкова, Б. И. Антонов, В. Е. Храпова и др.; Под ред. В. Я. Антонова и П. Н. Блинова. - Москва: Колос, 1971. - 648 с.

Лопаткин Н. А., Эфферентные методы в медицине / Н. А. Лопаткин, Ю. М. Лопухин. - М.: Медицина, 1989. - 351 с.

Любарский М. С. Сочетанная лимфотропная и сорбционная терапия гнойных ран / М. С. Любарский, А. Ю. Летягин, В. Х. Габитов. - Бишкек - Новосибирск: «Илим», 1995. - 134 с.

МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» / Утверждены и введены в действие: Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко 4 марта 2004 г. - Методические указания. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.--91 с.

Николаев В. Г. Энтеросорбция: состояние вопроса и перспективы на будущее / В. Г. Николаев, С. В. Михаловский, В. В. Николаева, А. М. Олещук, Н. Е. Лисничук // Вісник проблем біології і медицини. - 2007. - Випуск 4. - С. 7-17.

Панфилова В. Н. Применение энтеросорбентов в клинической практике / В. Н. Панфилова, Т. Е. Тара- нушенко // Педиатрическая фармакология. - 2012. - 9 (6). - С. 34-39.

Решедько Г. К. Определение чувствительности к антибиотикам: методы, результаты, оценка / Г. К. Решедько // Клиническая антимикробная химиотерапия, 1999. - № 3. - С. 113-115.

Семченко Л. Ю. Обоснование местного применения сорбционно-детоксикационной терапии при послеоперационных гнойно-септических осложнениях у больных колоректальным раком / Л. Ю. Семченко, В. Л. Полуэктов, С. С. Степанов и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2002. - № 2. - С. 101-104.

Урсова Н. И., Горелов А. В. Современный взгляд на проблему энтеросорбции Оптимальный подход к выбору препарата / Н. И. Урсова, А. В. Горелов // РМЖ. - 2006. - № 19. - С. 1391.

Фадеенко, Г. Д. «Смекта» - безопасный препарат с поливалентным механизмом действия в лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта / Г. Д. Фадеенко, О. Г. Гапонова // Сучасна гастроентерологія (Современная гастроэнтерология, Contemporary gastroenterology). - 2013. - № 1. - С. 111 - 121.

Чуйко А. А. Медицинская химия и клиническое применение диоксида кремния [Текст] / А. А. Чуйко, В. К. Погорелый, А. А. Пентюк [и др.]; Под ред. А. А. Чуйко; НАН Украины, Ин-т химии поверхности. - Київ: Наукова думка, 2003. - 415 с.

Шульц; M. M. Силикаты в природе и практике человека / М. М. Шульц // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - № 8. - С. 45-51.

Arendrup M. C. Method for the determination of broth dilution of antifungal agents for fermentative yeasts / M. C. Arendrup, M. Cuenca-Estrella, C. Lass-Florl, W. Hope , Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), Cuenca-Estrella M et al.Document E.DEF 7.2; revised March, 2012. - pp 246-247.

References

Alenkina, T. V. Perspektivnye sorption materials for the construction of antitoxic cholera enterosorbent / T. V. Alenkina et al. / / Problems of particularly dangerous infections. - 2013. - No. 2. - pp. 66-69.

Ananyeva L. G. Mineralogy. Class of silicates: textbook / L. G. Ananyeva; National Research Tomsk Polytechnic University. Tomsk: Tomsk Polytechnic University Publishing House, 2011, 77 p.

Balukova E. V. Detoxification therapy in chronic diseases of the gastrointestinal tract / E. V. Balukova // Medical Council. - 2018. - No. 14. - p. 50-55.

Belyakov N. A., Solomennikov A.V. Enterosorption (introduction to the problem) / N. A. Belyakov, A.V. Solo- mennikov. - L., 1990. - 35 p.

Borodin Yu. I. Sorption-application and lymphotropic methods in the complex treatment of burns / Yu. I. Borodin, M. S. Lyubarsky, A. Yu. Letyagin, et al. Novosibirsk: Siberian Military District, 1995. - 142 p.

Burmistrov V. A. Specific sorbents for the prevention and treatment of various diseases [Electronic resource] / V. A. Burmistrov, L. N. Rachkovskaya, M. S. Lyubarsky, Yu. I. Borodin, V. I. Konenkov State Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology SB RAMS, LLC SPC "Vector-Vita". - Access mode: http: / / vector-vita.narod.ru / Documents / papers / 2007_nano_64.htm/ (accessed 10.06.2020).

Druzhinin P. V. Basic principles and methods of detoxification of the body [Electronic resource] / P. V. Dru- zhinin, L. F. Novikov, Yu. A. Lysikov. - 2011-06-30.-Access mode: http://on-line-wellness.com/view_post.php7id = 116/ (accessed 10.06.2020).

Clinical guidelines of "determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial drugs" / Approved: Meeting of the working group on medical Microbiology relevant Committee, Ministry of health of the Russian Federation on KLD (all-Russian scientific-practical conference on medical Microbiology and clinical Mycology (XVII Kashkin readings), 9-11 June 2014,Saint-Petersburg). - Publishing house: Russia, St. Petersburg, Kashkin Research Institute of Medical Mycology, 2014. - 154 p.

Kozlov R. S. Antimicrobial agents and resistance of microorganisms: two sides of the coin / R. S. Kozlov // Bulletin of the scientific centre for expert evaluation of medical products. - M., 2007, No. 3, Pp. 30-32.

Laboratory studies in veterinary medicine [Text]: [Directory] / Sost. P. M. Volkov, B. I. Antonov, V. E. Khrapova, etc.; ed. by V. J. Antonov and P. N. Blinova. - Moscow: Kolos, 1971. - 648 p.

Lopatkin N. A. Efferent methods in medicine / N. A. Lopatkin, M. Lopukhin. - M.: Medicine, 1989. - 351 p.

Lubarsky, M. S. Co-lymphotropic and sorption therapy of purulent wounds / M. S. Lyubarsky, Y. A. Letyagin, V. H. Gabitov. - Bishkek-Novosibirsk: "Ilim", 1995. - 134 p

MUK 4.2.1890-04 "Determination of the sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs" / Approved and put into effect: Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation - First Deputy Minister of Health of the Russian Federation G. G. Onishchenko March 4, 2004. - Methodological guidelines. - M.: Federal Center for State Sanitary and Epidemiological Supervision of the Ministry of Health of Russia, 2004. -91 p.

Nikolaev V. G. Enterosorption: the state of the issue and prospects for the future / V. G. Nikolaev, S. V. Mikhalovsky, V. V. Nikolaeva, A.M. Oleshchuk, N. E. Lisnichuk / / Visnik problemy biologii i meditsinii. - 2007. - Vipusk 4. - p. 7-17.

Panfilova V. N. The use of enterosorbents in clinical practice / V. N. Panfilova, T. E. Taranushenko // Pediatric pharmacology. - 2012. - 9 (6). - S. 34-39.

Reshedko G. K. Determination of sensitivity to antibiotics: methods, results, evaluation / G. K. Reshedko // Clinical antimicrobial chemotherapy, 1999. - No. 3. - P. 113-115.

Semchenko Yuri L. the Rationale for the topical application of sorption detoxification therapy in postoperative septic complications in patients with colorectal cancer / L. Y. Semchenko, V. L. Poluektov, S. S. Stepanov et al. / / Bulletin of the Russian Academy of medical Sciences. - 2002. - No. 2. - P. 101-104.

Ursova N. I., Gorelov A.V. Modern view on the problem of enterosorption Optimal approach to the choice of the drug / N. I. Ursova, A.V. Gorelov / / RMZH. - 2006. - No. 19. - p. 1391.

Fadeenko, G. D. Drug is safe drug with a multivalent mechanism of action in the treatment of diseases of the gastrointestinal tract / G. D. Fadeenko, O. G. Gaponova // Suchasna gastroenterologiya (Modern gastroenterology, gastroenterology Contemporary). - 2013. - No. 1. - p. 111-121.

Chuiko A. A. Medical chemistry and clinical application of silicon dioxide [Text] / A. A. Chuiko, V. K. Po- gorely, A. A. Pentyuk [et al.]; Ed. by A. A. Chuiko; NAS of Ukraine, Institute of Surface Chemistry. - Kiev: Naukova dumka, 2003. - 415 p.

Schultz; M. M. Silicates in nature and human practice / M. M. Schultz // Soros educational journal. - 1997. - No. 8. - P. 45-51.

Arendrup M. C. Method for the determination of broth dilution of antifungal agents for fermentative yeasts / M. C. Arendrup, M. Cuenca-Estrella, C. Lass-Florl, W. Hope , Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), Cuenca-Estrella M et al.Document E.DEF 7.2; revised March, 2012. - pp 246-247.

Размещено на Allbest.ru