Оцінка ефективності медикаментозної нейропротекції

В експерименті було використано модель хронічної гемічної нітрит-індукованої ПГ, яку відтворювали щоденним внутрішньоочеревинним введенням розчину нітриту натрію вагітним самицям щурів з 16-го по 21-й день вагітності у дозі 50 мг/кг [13]. Контрольні вагітні самиці отримували фізіологічний розчин у тому самому режимі.

При підборі дозування керувалися інструкціями до застосування препаратів та даними наявних у літературі досліджень [8, 12, 14-16]. Було обрано такі лікарські препарати, які мають експериментально доведену здатність модулювати експресію HSP70:

1. Тіотриазолін (морфоліній 3-метил1,2,4-триазоліл-5-тіооцтової кислоти; 2,5%-й розчин для ін'єкцій; (Корпорація «Артеріум», Україна), метаболітотропний кардіопротектор та антиоксидант. Є дані, що препарат збільшує експресію HSP70 в міокарді при ішемії, хронічній серцевій недостатності та алкогольному ураженні серця [14].

2. Тамоксифен ((7)-2-[4-(1,2-дифеніл-1бутеніл) феноксілдіметилетанамін (у вигляді цитрату); таблетки («Orion Corporation», Фінляндія), на їх основі ex temporae на кафедрі технології лікарських засобів ЗГМУ готували інтраназальний гель (із вмістом активної речовини 1 мг/мл); у низьких дозах він є агоністом Р-естрогенових рецепторів, здатний підвищувати концентрацію HSP70 у мітохондріях та цитозолі головного мозку та міокарда при гострій ішемії внаслідок регуляції механізмів, в які залучено активні форми кисню (АФК) та відновлений глутатіон (АФК/GSH-залежні механізми) [15, 16].

3. Ангіолін (2,6-діаміногексанової кислоти 3-метил-1,2,4-триазоліл-5-тіо ацетат; ( НВО «Фарматрон», Україна) протиішемічний та ендотеліопротективний засіб; підвищує експресію HSP70 у мітохондріях та цитозолі головного мозку та міокарда при гострій та хронічній ішемії, алкогольній хворобі тощо. Також у відповідь на ішемію нормалізує експресію гена раннього реагування (c-fos) та васкулоендотеліального фактора росту (VEGF) [8].

4. Глутаредоксин («Sigma Aldrich», США). Цей тіоловий фермент впливає на GSH-залежні механізми експресії HSP70 у мітохондріях та цитозолі головного мозку при гострій церебральній ішемії [8].

5. Цереброкурин (розчин для ін'єкцій; «НІР», Україна). Препарат містить нейропептиди, білки S-100, рилін, NGF (не менше як 2 мг/мл) та амінокислоти. Він проявляє виражену нейропротективну дію, підвищує пластичність нейронів, стимулює експресію транскрипційних факторів, а також захисних білків, у тому числі, HSP1 (heat shock transcription factor 1 білок, який кодується однойменним геном) [12].

Також для оцінки можливого ефекту було застосововано препарати з потенційною нейропротективною дією:

L-аргінін (42%-й розчин для ін'єкцій у флаконі, торгова назва тівортін, («ЮріяФарм», Україна) прекурсор NO, знижує вираженість порушень у нітроксидергічній системі при ішемії, виявляє ендотеліотропну та антиоксидантну дію [17].

Нікомекс (мексидол; 2-етил-6-метил3-гідроксипіриду сукцинат, розчин для ін'єкцій із вмістом активної речовини 50 мг/мл; («Лекхім-Харків», Україна). Це антиоксидантний засіб з нейропротективними властивостями, має здатність впливати на механізми ішемічної нейродеструкції, в яких беруть безпосередню участь АФК (АФК-залежні механізми) [18, 19].

Мілдронат (2-(2-карбоксиетил)-1,1,1-триметилгідразиній; 10%-й розчин для ін'єкцій в ампулах; (АТ «Grindex», Латвія). Препарат нормалізує енергетичний обмін, виявляє мітопротективну дію. В умовах гострої ішемії органів та тканин цей засіб підвищує експресію низки генів, що кодують ферменти ліпідного обміну. Відомо, що мілдронат зможе застосовуватися у комплексній терапії фетоплацентарної недостатності [5, 20].

HSF-1 (рекомбінантний, («Sigma Aldrich», США), основний фактор транскрипції для білків теплового шоку в регуляції відповіді клітин на тепловий шок, а також на дію багатьох інших стресових факторів, таких як гіпоксичні умови та вплив токсичних речовин. HSF1 активує гени багатьох цитопротекторних білків, що беруть участь у реакціях теплового шоку, репарації ДНК, детоксикації [3].

Як референс-препарат було відібрано пірацетам (200 мг/мл, «Фармак», Україна). Пірацетам (2-оксо-1-піролідин ацетамід) ноотропний засіб з вираженою протиішемічною дією [21]. Його вибір як референсного препарату зумовлений тим, що результатами доклінічних досліджень досить повно доведено молекулярно-біохімічний механізм ноотропної, нейропротективної та протиішемічної дії цього лікарського засобу та існує доказова база його клінічної ефективності [22]. Пірацетам включений до протоколів ведення хворих з гострими порушеннями мозкового кровообігу, черепно-мозковими травмами, а також з фетоплацентарною недостатністю та пренатальною енцефалопатією, в Україні, країнах Євросоюзу та США як базовий засіб нейропротекції [23].

Потомство (120 новонароджених щурів) було поділено на рівні за кількістю (по 10 тварин) групи:

1 група здорові тварини від самиць з фізіологічно нормальною вагітністю, яким вводили фізіологічний розчин (5 мкл/г);

2 група (контроль) після ПГ, яким також щодня вводили фізіологічний розчин (5 мкл/г). Тварини з потомства щурів після ПГ увійшли до 3-ї 12-ї груп, залежно від нейропротектора, що застосовували щодня внутрішньоочеревинно з 1-ї по 30-ту добу життя.

Відповідно 3 групу склали тварини, яким вводили тіотриазолін (50 мг/кг);

4 групу тамоксифен (0,1 мг/кг) інтраназально;

5 групу ангіолін (50 мг/кг);

6 групу глутаредоксин (200 мкг/кг);

7 групу цереброкурин (150 мкл/кг);

8 групу L-аргінін (200 мг/кг);

9 групу нікомекс (100 мг/кг);

10 групу мілдронат (50 мг/кг);

11 групу HSF-1 (50 мг/кг);

12 групу пірацетам (500 мг/кг). При підборі дозування керувалися інструкціями до застосування препаратів та даними попередніх досліджень [8, 12, 14-16].

Щурів виводили з експерименту на 30-ту та 60-ту доби життя під тіопенталовим наркозом (40 мг/кг). Для досліджень кров забирали з черевної артерії. Концентрації білка теплового шоку HSP70, нітротирозину та молекулярного маркера ураження центральної нервової системи матриксної металопротеїнази-8 (ММР-8) у плазмі крові визначали методом твердофазного імуноферментного аналізу ELISA із використанням тест-систем ELISA Kit. Для дослідження вмісту HSP70 (нг/мл) використовували тестсистему «AMP'D HSP70 high sensitivity» («Enzo», Швеція), а вміст ММР-8 (нг/мл) тест-системи «Thermo Fisher Scientific» (Catalog#EHMMP8). Вміст нітротирозину (нмоль/мл) із застосуванням тест-системи «Hycult Biotech» (Cat. No HK 501-02).

Статистичну обробку одержаних результатів проведено з використанням пакетів прикладних програм Statistica® для Windows 6.0 (StatSoft Inc., No AXXR712D833214FAN5), а також SPSS 16.0, Microsoft Office Excel 2010. У разі нормального розподілу достовірність міжгрупових відмінностей встановлювали з допомогою параметричного критерію t Стьюдента. Коли ж результати не відповідали законам нормального розподілу, порівняльний аналіз проводили за допомогою непараметричного U-критерію Манна-Вітні. Для порівняння незалежних змінних у більш ніж двох вибірках застосовували дисперсійний аналіз (ANOVA) при нормальному розподілі або критерії Краскела-Уолліса для розподілу, відмінного від нормального. Для всіх видів аналізу статистично значущими вважали відмінності при P < 0,05 (надійність 95%).

Результати та їх обговорення

Слід відмітити стійке зниження експресії білка HSP70 після ПГ у одномісячних щурів у 5,6 рази, а у двомісячних у 3,44 раза (див. табл. 1; 2). Раніше було встановлено, що ПГ призводить до пригнічення експресії мРНК HSP70 у сенсомоторній корі, а також до зниження концентрації HSP70 у цитозолі та мітохондріях головного мозку експериментальних тварин. Автори дійшли висновку, що ПГ викликає внутрішньоутробне програмування гена hsp70, котре супроводжується пригніченням його реакції на тепловий стрес та гальмування ендогенної цитопротекції у більш пізньому віці. Також було встановлено здатність HSP70 посилювати життєздатність нейронів в умовах гіпоксії та факт односпрямованої зміни вмісту HSP та HIF-білків у тканинах головного мозку щурів після ПГ. Зважаючи на ці дані, можна припустити, що HSP70 бере участь у регуляції сигнальних шляхів відповіді клітини на гіпоксичний стрес на рівні регуляції стабільності HIF-білка [8, 24].

Сімейство білків теплового шоку HSPs (heat shock proteins) вважають одним із найбільш вивчених факторів цитопротекції [25]. Вони відіграють роль внутрішньоклітинних шаперонів, що підтримують протеостаз клітин у нормі та у різних стресових умовах (гіпертермія, гіпоксія, оксидативний стрес, радіація тощо). Найбільший інтерес викликає білок HSP70 як важливий компонент системи ендогенної цитота нейропротекції, який забезпечує процеси фолдингу, холдингу та транспорту синтезованих білків, а також їх деградацію як в умовах нормоксії, так й при стресіндукованій денатурації [21]. У відповідь на стрес, ішемію, гіпоксію тощо різко зростає вміст HSP70. При цьому його найбільша концентрація спостерігається у життєво важливих частинах клітин, а саме, ядерному та навколоядерному просторах, у мітохондріях, в ендоплазматичному ретикулумі, що свідчить про важливу роль HSP70 у захисті клітин від загибелі. У процесі відновлення роботи ядерних прерибосом концентрація HSP70 зменшується в ядрі клітин та підвищується в цитоплазмі. Таким чином, вміст цього білка можна розглядати як маркер клітинного та тканинного пошкодження.

Гіперпродукція HSP70 у клітинах пригнічує розвиток аутофагії як альтернативного, більш «радикального» механізму клітинної відповіді на стрес [8, 25]. Літературні дані останніх років доводять пряму цитопротекторну дію HSP70, яка реалізується регулюванням процесів апоптозу та некрозу клітин, причому, він гальмує мітохондріальний та цитоплазматичний шляхи апоптозу. Так, HSP70 пригнічує перехід прокаспази 9 в активну форму каспази 9 й порушує формування апоптосоми у цитоплазмі клітин. На тлі гіперекспресії HSP70 підви щується вміст антиапоптотичного білка Bcl-2, що перешкоджає виходу цитохрому з мітохондрій, та транслокації фактора, який індукує апоптоз (AIF) в ядрі, попереджаючи апоптоз клітин. Білок HSP70 пригнічує TNFa-індукований апоптоз, а також розвиток Fasта TRAIL(TNF related apoptosisinducing ligand)-опосередкований апоптоз у різних типах клітин [25]. Таким чином, однією з терапевтичних стратегій для зменшення ураження ЦНС, що розвивається після ПГ, може бути нормалізація експресії HSP70.

Таблиця 1

Вміст маркерів пошкодження центральної нервової системи у крові тварин після пренатальної гіпоксії (ПІ) та курсового застосування лікарських засобів (30-та доба життя; M ± m, n = 10)

Примітки: тут і в табл. 2 *Р < 0,05 відносно контролю; **Р < 0,05 відносно значень інтактної групи

Таблиця 2

Вміст маркерів пошкодження центральної нервової системи у крові тварин після пренатальної гіпоксії (ПГ) та курсового застосування лікарських засобів (60-та доба життя; M ± m, n = 10)

Слід відмітити стійке та різке - у 57,8 рази - підвищення вмісту ММР-8 у крові в одномісячних щурів після внутрішньоутробної гіпоксії, а у двомісячних - у 7,37 рази (див. табл. 1; 2), причому концентрація ММП-8 корелювала з постнатальним віком. MMP-8 є ферментом з молекулярною масою 75 кДа, який переважно експресується нейтрофілами. Вона є унікальним членом сімейства MMP (MMPs) через її виняткову експресію при нейрозапаленні [26], активується переважно прозапальними цитокінами, але, можливо, і бактеріальними протеазами за допомогою так званого «перемикача цистеїну», а також через утворення вільних радикалів. ПГ викликає аномальне зростання розмірів серця та розумову відсталість у потомства, а зміна активності ММП відіграє вирішальну роль у ремоделюванні тканин як серця, так і мозку [27].

Повідомлялося, що гіпоксія плоду призводить до загальної тенденції збільшення активності ММР-2, ММР-8 і ММР-9 під час фетального та неонатального періодів. ПГ стимулює утворення колагену за допомогою АФК або TGF-b, який може індукувати експресію генів профіброгенів, включаючи ті, що кодують колаген. ММР та ендогенні тканинні інгібітори металопротеїназ (TIMPs) можуть регулюватися на рівні транскрипції за допомогою епігенетичних механізмів (наприклад, метилювання ДНК та модифікація гістонів) у відповідь на гіпоксію. MMP призводять до деструкції молекули колагену і зменшують його відкладення в тканинах. MMP-8 розглядається як перспективна мішень для нейропротекції. Вміст та, відповідно, активність MMPs у незрілому мозку підвищується під дією ПГ або неонатальної гіпоксії'/ішемії, оскільки вони є основними агентами, що беруть участь у руйнуванні гематоенцефалічних бар'єрів після гіпоксичного впливу. Підвищення активності ММП-8 в амніотичній рідині пов'язане з несприятливим неонатальним результатом, зокрема, хронічним захворюванням легень, ураженням головного мозку [5].

Введення досліджуваних препаратів протекторної дії протягом 30 діб після народження експериментальним тваринам, що перенесли ПГ внутрішньоутробно, призводило до зниження різного ступеня та достовірності в плазмі крові концентрації нітротірозину та активності ММР-8 на тлі збільшення концентрації HSP70; ці змі ни утримувалися й в наступні 30 діб (на 60-ту добу життя). Найбільш вираженою активністю протягом 30 і 60 діб життя тварин мали тіотриазолін, ангіолін, цереброкурин, глутаредоксин і HSF-1. Інші препарати виявляли ефект тільки відразу після закінчення прийому, а потім протягом наступних 30 діб їх захисна дія зменшувалася. Так, введення ангіоліну підвищувало вміст HSP70 вдвічі у одномісячних тварин і на 86% у двомісячних (P < 0,05) на тлі зниження вмісту нітротирозину в 2,3 та 2,9 раза (P < 0,05) відповідно, та вмісту ММР-8 у 32,7 та 2,9 раза (P < 0,05) відповідно через місяць та 2 міс після народження тварин, які перенесли ПГ. Ангіолін виявляє властивості скавенджерів АФК і NO та позитивно впливає на експресію генів, що кодують синтез антиоксидантних ферментів супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази, здійснює регуляцію АФК/GSH-залежних механізмів експресії HSP70, сприяє підвищенню біодоступності NO [9]. В умовах гіпоксії він здатний запускати і підтримувати роботу малат-аспартатного механізму внаслідок підвищення синтезу HSP і HIF та збільшувати продукцію АТФ, а також, за рахунок залишку L-лізину, що входить до складу цього препарату, підвищує афінітет ГАМК-рецепторів і знижує ексайтотоксичність [8, 24].

Введення пірацетаму не чинило помітного впливу на вміст HSP70 та нітротирозину в крові, але знижувало концентрацію ММР-8 у крові одномісячних тварин у 21 раз. Пірацетам відіграє особливу роль у регуляції обмінних процесів та кровообігу мозку плоду, що зумовлює можливість його використання для лікування наслідків ПГ у тканинах головного мозку. Препарат за умов гіпоксії підвищує синтез АТФ в анаеробних реакціях [28], але застосування його у дітей віком до року на тлі гіпоксії у ЦНС може спровокувати судомну реакцію та посилити прояви лактат-ацидозу [5]. Описано антиоксидантні властивості препарату, спрямовані на гальмування окисної модифікації білка [23, 24].

L-аргінін демонстрував ефективність (за впливом на досліджувані показники) лише у період курсу введення. Будучи прекурсором NO, він виявляє ендотеліопротективні, вазодилататорні та антиоксидантні властивості, що забезпечують йому певну ефективність при загрозі невиношування, затримці росту плоду та фетоплацентарній недостатності [5, 29]. Однак, як демонструють дані попередніх досліджень, відновлення продукції NO не впливає на експресію HSP70, хоча і є дослідження про NO-регуляцію вмісту HSP70 [3]; можливо, це пов'язано з його низькою біодоступністю при ішемії-гіпоксії та дефіциті відновлених тіольних сполук [8]. Також у L-аргініну нами було виявлено нестійкий самостійний антиоксидантний ефект.

Інтерес викликають результати застосування при ПГ антиоксидантів з цитопротективною дією нікомексу та тіотриазоліну, які мали вплив на досліджувані показники як у період введення, так і через 30 діб після закінчення курсу. Нікомекс здатний гальмувати окиснювальну модифікацію макромолекул, виявляє мембраностабілізуючі властивості, протиішемічний ефект, що пов'язаний з мітопротекцією та впливом на сукцинатоксидазний шунт [18]. Препарат діє на афінітет ГАМК у церебральних судинах і нейронах [8]. У цьому дослідженні було встановлено досить помірні його антиоксидантні властивості, а також відсутність вираженого впливу на експресію HSP70, що підтверджується й даними інших дослідників [19]. Тіотриазолін за рахунок особливості структури своєї молекули є скавенджером NO і АФК, регулює експресію NF-kB, що може забезпечувати як значний антиоксидантний ефект, так й зниження активності ММР-8. Механізм впливу препарату на експресію HSP70 досить добре описаний у низці праць і пов'язаний із SH/SSрегуляцією активності транскрипційних факторів [14]. Тіотриазолін ефективно коригує дискоординовані зміни функціонування циклу Кребса, що виникають в умовах тканинної гіпоксії, За здатністю перетворення лактату в піруват та підвищення вмісту сукцинату, тіотриазолін перевершує референсний препарат пірацетам у 2-3 рази, сприяючи переходу некомпенсованого метаболічного ацидозу в компенсований [8].

Цереброкурин викликав збільшення концентрації HSP70 у крові тварин як у період введення, так і через 30 діб після закінчення курсу (у 2,5 раза і на 89% відповідно). Вміст нітротирозину через 30 діб після курсового введення препарату наближався до значень інтактної групи. Курсове введення цереброкурину призводило до зниження в 20 разів вмісту ММР-8, і через 30 діб після припинення курсу концентрація цього маркера була нижчою від контрольних значень на 80%. Виявлені нами властивості цереброкурину не суперечать даним інших дослідників, якими показана висока антиоксидантна активність препарату, що спрямована на підвищення експресії МпСОД, нейропротективної та протиішемічної активності, що реалізується внаслідок прямої мітопротекції, активації синтезу HSP та HIF-білків й опосередкованої ними в умовах гіпоксії/ішемії активації компенсаторних шунтів енергії [6, 8].

Застосування тамоксифену підвищувало концентрації HSP70 та знижувало нітротирозин та ММЗ-8 як у період введення, так і через 30 діб після закінчення курсу лікування. Нейропротективна активність тамоксифену зумовлена, на нашу думку, активацією Р-естрогенових рецепторів головного мозку та подальшим від'єднанням від останніх HSP70. Механізм цієї взаємодії пояснюється здатністю останнього утворювати комплекси з естрогеновими рецепторами, не пов'язаними з естрогенами, для підтримки їх у неактивному стані [15]. Тамоксифен забезпечує входження HSP70 всередину мітохондрії та мітопротективну дію, посилює експресію HSP70 внаслідок стимулюючого впливу на білковий фактор транскрипції фактор теплового шоку (HSF) [8]. Препарат виявляє самостійну антиоксидантну дію через підвищення вмісту внутрішньо-мітохондріального глутатіону [16].

Введення мілдронату призводило до підвищення концентрації HSP70 та зниження вмісту ММЗ-8 як у період введення, так і через 30 діб після закінчення курсу лікування, не впливаючи при цьому на вміст нітротирозину. Мілдронат є інгібітором біосинтезу, транспорту та реабсорбції L-карнітину, запобігає накопиченню токсичних ацилкарнітинів у ішемізованій тканині та зміщує метаболізм клітин у бік підвищеного споживання глюкози, що є сприятливим при ішемічних станах. Препарат компенсаторно збільшує активність ацил-КоА-синтетази та карнітин-пальмітоїл-трансферази I у мітохондріях, а також пероксисомальне окиснення жирних кислот [20], може збільшувати продукцію NO в ішемізованому міокарді та головному мозку за допомогою модифікації пулів ефірів у-бутиробетаїну [30], але ці механізми не забезпечують мілдронату вплив на експресію HSP70 та антиоксидантну дію.

Глутаредоксин, також відомий як тіолтрансфераза, є одним з найбільш значущих ферментів у процесах відновлення дисульфідів та деглутатіонілювання. В умовах окиснювального стресу він бере участь у процесі S-глутатіонілювання, водночас при зниженні вираженості оксидативного стресу каталізує реакцію деглутатіонілювання [6]. Глутаредоксин здійснює GSH-залежний протекторний вплив від подальшого окиснення сульфенової кислоти (Cys-SOH), що утворилася в результаті окиснення залишків цистеїну, в сульфінову (Cys-SO 2 H) та її відновлення, а також відновлення в білках внутрішньота міжмолекулярних дисульфідних зв'язків (-S-S-), підтримуючи редокс-активний стан ТДС. Дефіцит глутаредоксину призводить до порушення рівноваги SH/SS та режиму глутатіонілювання специфічних регуляторних білків, що спричинює зниження адаптаційних спроможностей клітини та ініціювання апоптозу [8]. Білки, що містять тіоли, є досить поширеними в клітинах; до них належать ферменти енергетичного обміну, ферменти сигнальних каскадів, чинники транскрипції (NF-kB, HIF1a, API). Введення глутаредоксину тваринам після ПГ призводило до підвищення концентрації HSP70 у плазмі крові на 95% в одномісячних та на 82% - у двомісячних тварин. Вміст нітротирозину на 30-ту та 60-ту добу був у 2,67 раза нижчим за показники контрольної групи. Також відзначалося стійке зниження концентрації ММР-8 - у 22,7 раза в одномісячних та на 79% - у двомісячних тварин. Відомо, що нейропротективна активність глутаредоксину в умовах гострої експериментальної ішемії головного мозку спрямована на активацію GSH-залежних ланок ендогенної нейропротекції. В наших попередніх працях показано, що цей ферментний засіб підвищує експресію мРНК HSP70, HIF-la і HIF-3a за умов гострої експериментальної ішемії головного мозку[8, l6].

HSF-1 є головним регулятором системи HSP, крім того, він бере участь в експресії багатьох генів у нормальних умовах життєдіяльності клітини та регулює процеси метаболізму вуглеводів, сплайсингу РНК, апоптозу, убік вітинилювання й деградації білків, детоксикації, транспорту малих молекул і внутрішньоклітинного сигналінгу [21]. Виявлена його здатність захищати нейрони через HSP-незалежні механізми, при цьому HSF-1 не потребує попередньої тримеризації для виконання нейропротекторної функції [8]. Курсове введення HSF-1 збільшує концентрацію HSP70 у крові тварин після ПГ у 2,4 раза через місяць та на 61% через 2 міс життя при зниженні вмісту нітротирозину у 2,3 та 3,2 раза відповідно. Концентрація ММР-8 після застосування HSF-1 є нижчою за контроль у 30,8 раза у одномісячних тварин, а у 48 разів - у двомісячних, що є найменшим значенням вмісту цього ферменту серед результатів усіх груп спостереження. Відомо, що HSF-1 реалізує нейропротективну дію внаслідок активації ланок ендогенної нейропротекції підсилення експресії мРНК HSP70, мРНК HIF-la, мРНК HIF-3a, підвищення вмісту HSP70, що призводить до пригнічення оксидативного і нітрозативного стресів, до TNFa-індукованого апоптозу, а також розвиток Fasі TRAIL-опосередкованого апоптозу. HSF-1 також усуває мітохондріальну дисфункцію внаслідок HSP70/GSH-залежних механізмів при церебральній ішемії [6, 8, 25].