Кріозахисна дія оксиетильованого гліцерину зі ступенем полімерізації n=25 при заморожуванні еритроцитів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кріозахисна дія оксиетильованого гліцерину зі ступенем полімерізації n=25 при заморожуванні еритроцитів

Ю.С. Пахомова, В.В. Чеканова А.М. Компанієць

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків

Резюме

В роботі досліджено цитотоксичність, фізико-хімічні властивості та кріозахисну дію розчинів полімергомолога оксиетильованого гліцерина зі ступенем полімерізаціїї n=25 (ОЕГ_п=25) на етапах заморожування еритроцитів людини. еритроцит кріоконсервування кріопротектор

Ключові слова: еритроцити, кріоконсервування, кріопротектор, оксиети- льований гліцерин зі ступенем полімеризації n=25.

КРИОЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ОКСИЭТИЛИРОВАННОГО ГЛИЦЕРИНА СО СТЕПЕНЬЮ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ n=25 ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ ЭРИТРОЦИТОВ

Резюме: В работе исследованы цитотоксичность, физико-химические свойства и криозащитное действие растворов полимергомолога оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n=25 (ОЗГп=25) на этапах замораживания эритроцитов человека.

Ключевые слова: эритроциты, криоконсервирование, криопротектор, окси- этилированный глицерин со степеню полимеризации n=25.

CRYOPROTECTIVE EFFECT OF ETHOXYLATED GLYCEROL DERIVATIVES WITH A DEGREE OF POLYMERIZATION n=25 DURING THE FREEZING OF ERYTHROCYTES

Summary: The goal of the thesis was to conduct study of cryoprotective action, cytotoxicity, and physico-chemical properties of ethoxylated glycerol derivatives with a degree ofpolymerization n=25 (EGn=25) during the freezing of erythrocytes.

Keywords: erythrocytes, cryopreservation, cryoprotector, ethoxylated glycerol derivatives with a degree of polymerization n=25.

Вступ

Створення нових ефективних методів і технологій низькотемпературного консервування компонентів крові є одним з важливих напрямів розвитку сучасної кріобіології та трансфузійної медицини [1, 6].

Єучасні технології кріоконсервування еритроцитів людини при низьких (-70^-80°С) і ультранизьких (-150^-196°С) температурах базуються на застосуванні кріозахисних середовищ головним компонентом яких є кріо- протектор гліцерин. Висока вартість цих технологій, технічна складність етапів гліцеринізації і дегліцеринізації еритроцитів обмежує їх практичне використання.

Застосування при заморожуванні еритроцитів непроникаючих кріоп- ротекторів дозволило б виключити трудомісткий етап їх відмивання перед трансфузіями. Але, не зважаючи на велику кількість сполук, досліджених у якості непроникаючих кріопротекторів при заморожуванні еритроцитів (ПВП, ГЕК, ПЕО, декстран) [1, 7], вони не знайшли широкого застосування в клінічній практиці. Це пов'язано, насамперед, з низькою осмотичною стійкістю заморожених з цими сполуками клітин, можливим ризиком внутрішньо судинного гемолізу перелитих кріоконсервованих еритроцитів.

Результати досліджень, які виконуються в ІПКіК НАН України протягом останнього десятиріччя, свідчать про перспективність використання при заморожуванні еритроцитів сполук з екзоцелюлярним механізмом дії, створених у відділі кріопротекторів - оксиетильних похідних гліцерину (ОЕГ) різного ступеня полімеризації [2, 5].

Мета роботи: вивчення кріозахисної дії розчинів на основі оксиети- льованого гліцерину зі ступенем полімеризації n=25 на етапах заморожування еритроцитів донорської крові.

Матеріали і методи

Еритроцити, отримували з донорської крові людини, заготовленої на гемоконсерванті «Глюгіцир» і збереженої після ексфузії не більше двох діб при температурі 4±2°С.

Розчини ОЕГп=25 готували на основі фосфатно-сольового буфера (ФСБ) рН 7,4 і використовували після 24 годин витримки при температурі 20±2°С. Поверхневий натяг розчинів на межі фаз вода-октанол вивчали методом ста- лагмометрії, осмотичний тиск - контролювали кріоскопічним методом.

Збереженість еритроцитів досліджували за такими показниками: концентрація вільного гемоглобіну та загального гемоглобіну, гематокрит, осмотична крихкість, процент гемолізу розраховували за формулою Huggins C.E. [3]. Морфологічний і морфометричний аналіз еритроцитів проводили у «живій краплі» методом оптичної мікроскопії в мікроскопі «LSM 510 META Carl Zeiss» з наступною фотореєстрацією і комп'ютерним аналізом зображень (програмне забезпечення «AxioVision Rel. 4.8»).

При дослідженні цитотоксичної дії ОЕГ_п=₂₅ до еритроцитів по краплях на протязі 5 хв при температурі 20±2°С додавали розчини кріопротекторів (діапазон концентрацій 15-40%) у співвідношенні 1:1 за об'ємом, експозиція складала 60 хв. Кріопротекторну дію ОЕГп=25 досліджували в діапазоні концентрацій 20-40%, тривалість експозиції клітин у розчинах становила 15 хв. Контролем були еритроцити, які додавались у ФСБ в співвідношенні 1:1 за об'ємом. Досліджені зразки заморожували в поліетиленових ампулах шляхом занурення в рідкий азот (-196°С), зберігали при -196°С від 1-3 тижні. Зразки відігрівали на водяній бані при температурі 40-42°С при постійному похитуванні контейнерів.

Збереженість кріоконсервованих еритроцитів при їх гіпотермічному зберіганні у плазмозаміщуючому розчині ЦОЛІПК-8в (модель трансфузії) досліджували після 1, 24 і 48 годин зберігання.

Статистичний аналіз даних проводили за допомогою програми «Statistica 6.0». Дані кількісних показників оцінювали, використовуючи критерій Манна-Уітні, (M±S), а дані якісних ознак клітин - z-критерій, (P±Sp). Кореляційний аналіз проводили за допомогою коефіцієнта рангів Спірмена. Достовірно відмінними вважали результати при р<0,05.

Результати та обговорення

Встановлено, що після 60 хв експозиції еритроцитів у 20 і 30% розчинах ОЕГ_п=₂₅ показники їх гемолізу й осмотичної крихкості істотно не змінювались і вірогідно не відрізнялись від контролю (табл. 1). Експозиція в 40% розчині ОЕГ_п=₂₅ викликала незначне підвищення рівня гемолізу та осмотичної крихкості еритроцитів у 0,6% NaCl, причиною чого може бути перепад осмотичного тиску, який, за даними наших вимірювань, перевищує ізотонію (300 мОсмоль/кг) більш ніж в 2 рази (табл. 2). Показник гематокриту еритроцитів у присутності ОЕГ_п=₂₅ знижувався проти контролю, але у всіх випадках був вище 20% (табл. 1). Можливо, зниження гематокриту пов'язано зі зміною загального об'єму і форми клітин, викликаних їх зневодненням під дією осмотично активного олігомера ОЕГ.

Таблиця 1 - Вплив розчинів ОЕГ_п=25 на збереженість еритроцитів на етапі експозиції перед заморожуванням (M±S, n=5)

Примітки: * - р<0,05 порівняно з контролем; # - р<0,05 порівняно з 20 і 30% концентраціями ОЕГп=25-

Вважають, що існує два види прояви токсичної дії кріопротекторів: хімічна, що переважно визначається такими його властивостями як коефіцієнт розподілу і поверхнева активність, та осмотична, яка пов'язана зі здатністю сполук викликати гіпертонічний стрес клітин. У досліджених кріозахисних розчинах ОЕГ_п=25 варіює концентрація кріопротектору, відповідно до неї змінюються показники фізико-хімічних властивостей, зокрема, осмотичний тиск і поверхнева активність (табл. 2). Встановлена пряма вірогідна кореляція між величиною осмоляльности кріозахисних розчинів і збереженням клітин за показником їх гемолізу (Тф_акт> 1), і зворотна кореляція між поверхневою активністю розчинів і показником гемолізу еритроцитів (Гф_акт.> - 1).

Таблиця 2 - Вплив кріозахисних розчинів на основі ОЕГ_п=25 на еритроцити

На етапі експозиції олігомери ОЕГ по різному впливають на збереженість форми і діаметр еритроцитів. Еритроцити донорської крові людини в аутологічній плазмі (контроль) мали форму дискоцитів (89,6±0,07%) і ехіноцитів (10,8±0,04%). Під дією 20 і 30% розчинів ОЕГп=25 еритроцити- мали форму дискоцитів (відповідно 95,2±0,02% і 90,9±0,02%) та стоматоцитів (відповідно 4,7±0,02 і 8,1±0,08%). Взаємодія еритроцитів з 40% ОЕГп=25 приводила до їх значної деформації та скупченню в агломерати, що свідчить про несприятливу дію даної концентрації сполук на морфологічну збереженість клітин. Після експозиції еритроцитів у розчинах ОЕГ_п=₂₅ відзначено зростання частки еритроцитів зі збільшеним діаметром, але основна кількість клітин, як і в контролі, мала діаметр від 7,1 до 8,0 мкм.

У роботі досліджено гіпертонічний стрес (ГС) еритроцитів як модель крі- оушкоджень клітин під дією гіперконцентрації солей в процесі кріоконсерву- вання. Вважають, що, піддаючи еритроцити ГС, можна виявити не тільки кріозахисну дію сполук, але і підібрати оптимальні умови експозиції клітин в кріозахисних розчинах [4], які забезпечать високе їх збереження при кріокон- сервуванні. Показано, що ОЕГ_п=₂₅ має виражений антигемолітичний ефект відносно еритроцитів людини в умовах дії ГС, а рівень його антигемолітичної дії залежить від концентрації' і умов експозиції (рис. 1). Для зниження рівня ушкоджень еритроцитів в процесі заморожування, викликаних ГС, оптима- льна концентрація ОЕГ_П=25 в кріозахисних середовищах має бути не меншою, ніж 20%, час експозиції - 60 хв, а температура - 0°С.

Після заморожування-відігріву еритроцитів з ОЕГ_п=₂₅ виявлено різний ступень їх збереження (табл. 3). Найбільший рівень гемолізу клітин виявлено після їх кріоконсервування в 20 і 40% розчинах ОЕГп=25. При використанні 30% ОЕГ_п=₂₅ кількість гемолізованих клітин була найменшою. Осмотична крихкість еритроцитів кріоконсервованих у розчинах ОЕГ_п=₂₅ вірогідно підвищувалась у порівнянні з контролем (табл. 3). Найбільш низькі показники осмотичної крихкості були отримані після заморожу- вання-відігріву еритроцитів в 30% ОЕГ_п=₂₅. Заморожування клітин в 20 і 40% розчинах ОЕГ_п=₂₅ приводило до значного зниження їх збереженості за даним показником. Відмічено зниження гематокриту еритроцитів в залежності від концентрації ОЕГ_п=₂₅, але проти контролю, ці відмінності були не вірогідні (табл. 3).

Таблиця 3 - Збереженість еритроцитів після кріоконсервування в кріозахисних розчинах ОЕГ_П=25 (M±S, n=5)

Примітки: 1. * - р<0,05 порівняно з 20% розчином ОЕГп=25.

При вивченні морфології кріоконсервованих еритроцитов виявлено, що при використанні 20% ОЕГ_п=25 більш ніж 40% розморожених клітин мали форму сфероцитів, а незначна доля еритроцитів була представлена сфероехіноцитами і деформованими клітинами (рис. 2, А).

Заморожування еритроцитів в 30% ОЕГ_п=₂₅ сприяло високій збереженості еритроцитів дискоїдної форми (87,5±0,06%, а кількість предгемолі- тичних форм клітин у порівнянні з 20% розчином ОЕГ_п=₂₅ зменшилась більш ніж в 10 разів (рис. 2, Б). Результати морфометричних досліджень показали, що використання 20% кріозахисного розчину ОЕГ_п=₂₅ приводило до зменшення діаметру кріоконсервованих еритроцитів - 6,1-7,0 мкм. Після кріоконсервування клітин в 30% ОЕГ_п=₂₅ діаметр основної кількості еритроцитів, як і в контролі, знаходився в інтервалі 7,1-8,0 мкм.

в кріозахисних розчинах ОЕГп=25..

Латентні пошкодження кріоконсервованих еритроцитів не можна встановити відразу після відігріву, вони проявляються лише при їх наступному гіпотермичному зберіганні в плазмі або плазмозамінюючих розчинах. Нами досліджена збереженість еритроцитів, кріоконсервованих в 30% розчині ОЕГп=25, в процесі їх 48-годинного гіпотермічного зберігання у плазмозаміщуючому розчині ЦОЛІПК-8в і встановлена відсутність значного зниження показників збереженості (гемоліз, гематокрит, осмотична крихкість). Важливим є встановлений факт, що протягом гіпотермічного зберігання в розчині ЦОЛІПК-8в вміст вільного гемоглобіну в суспензії кріоконсервованих клітин відповідав стандартам, встановленим для розморожених еритроцитів, які призначені для трансфузій [3].

Висновки

Встановлено, що заморожування еритроцитів з непроникаючою сполукою

- оксиетильованим гліцерином ОЕГ_п=25 забезпечує високий рівень збереженості кріоконсервованих еритроцитів за комплексом критеріїв in vitro (гемоліз, вміст вільного гемоглобіну, осмотична крихкість, морфологічний стан клітин, діаметр). Показано, що розчини ОЕГп=25 захищають еритроцити від пошкоджуючої дії ГС. Отримані в роботі результати свідчать про доцільність використання ОЕГ_п=₂₅ при розробці методу кріоконсервування еритроцитів, що не потребують відмивання клітин перед трансфузією.

Література

1. Ващенко В.И. История развития и перспективы совершенствования криоконсервирования эритроцитсодержащих компонентов крови / В.И. Ващенко // Гематология и трансфузиология. - 2010. - № 4. - С. 31-36.

2. Криоконсервирование эритроцитов под защитой олигомера оксиэтилиро- ванного глицерина / А.М. Компаниец, А.В. Николенко, В.В. Чеканова и др.// Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 3. - С. 561-565.

3. Пахомова Ю.С. Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГп=25 в комбинации с проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека / Ю.С. Пахомова, В.В. Чеканова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии и криомедицины. - 2013. - Т. 23, № 1. - С. 26-39.

4. Поздняков В.В. Осморезистентность как принцип устойчивости к замораживанию / В.В. Поздняков, Е.Р. Панталер, В.А. Бондаренко // Физико-химические свойства и биологическое действие криопротекторов: сб. науч. трудов / науч. ред.

В.И. Луговой. - Харьков, 1990. - С. 124-130.

5. Синтез, физико-химические свойства оксиэтильных производных глицерина. Криозащитные среды на основе комбинаций криопротекторов для замораживания биологических объектов / А.М. Компаниец, В.В. Чеканова, А.В. Николенко, А.В. Зинченко, Ю.С. Пахомова [и др.] // Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины : [монография / науч. ред. академик НАН Украины А.Н. Гольцев].

- Х.: «Райдер», 2012. - С. 73-126.

6. Rudman S.V. Blood Banking and Transfusion Medicine / S.V. Rudman // United States of America: Elsivier Saunders, 2005. - 686 р.

7. Sputtek A. Elimination of hydroxyethyl starh after autologous retransfusion of cryopreserved erythrocytes / A. Sputtek, K. Gutensohn, R. Hammes // Beitr. Infusionsther. Transfusionsmed. - 1996. - Vol. 33. - P. 215-219.