Кріоконсервування концентратів тромбоцитів людини в комбінованих кріоконсервантах при помірно низький температурі

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Кріоконсервування концентратів тромбоцитів людини в комбінованих кріоконсервантах при помірно низький температурі (-70--80°С)

Г.В. Коробкова, В.О. Кіреєв, А.М. Компанієць

Харків

Резюме

Представлено результати досліджень збереженості концентратів тромбоцитів, кріоконсервованих в комбінованих кріозахисних середовищах різного складу при -70^-80°С. Найбільш високі показники збереженості тромбоцитів отримані при використанні середовища, що містить комбінацію проникаючого кріопротектору ДМАЦ і непроникаючого ОЕГп=5.

Ключові слова: концентрат тромбоцитів, кріоконсервування, кріопротек- тори, комбіновані кріозахисні середовища, режими заморожування

Резюме

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ КОНЦЕНТРАТОВ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В КОМБИНИРОВАННЫХ КРИОКОНСЕРВАНТАХ ПРИ УМЕРЕННО НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ (-70--80°С)

А.В. Коробкова, В.А. Киреев, А.М. Компаниец

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков

Представлены результаты изучения сохранности концентратов тромбоцитов, крио-консервированных в комбинированных криозащитных средах разного состава при-70--80°С. Наиболее высокие показатели сохранности тромбоцитов получены при использовании среды, содержащей комбинацию проникающего криопротектора ДМАЦ и непроникающего ОЗГп=5.

Ключевые слова: концентрат тромбоцитов, криоконсервирование, комбинированные криозащитные среды, режимы замораживания.

Summary

CRYOPRESERVATION OF HUMAN PLATELET CONCENTRATES IN COMBINED CRYOPRESEVATIVES AT MODERATELY LOW TEMPERATURE (-70--80°C)

V. Korobkova,V.A. Kireev, A.M. Kompaniets

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine ofthe NAS of Ukraine, Kharkov

The research results on studying the preservation of platelets concentrates cryopreserved in combined cryoprotective media of various compositions at -70.-80°C are presented. The highest indices of platelets preservation have been obtained when suing the medium containing the combination of penetrative cryoprotectant DMAC and non-penetrative OEGn=5 one.

Keywords: platelet concentrate, cryopreservation, combined cryoprotective media, freezing regimens.

Вступ

Дослідження, спрямовані на розробку методів кріоконсерву- вання тромбоцитів людини для клінічного застосування, були розпочаті ще наприкінці 50-х років ХХ сторіччя. Проте розроблені і запропоновані протоколи кріоконсервування концентратів тромбоцитів (КТ) із використанням у якості кріопротекторів диметилсульфоксиду (ДМСО), диметилацетамиду (ДМАЦ), гліцерину, 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), тощо, не знайшли широкого застосування у медичній практиці у зв'язку з недостатньою клінічною ефективністю кріоконсервованих тромбоцитів, низькими показниками їх життєздатності і функціональних властивостей [6].

У відділі кріопротекторів ІПКіК НАН України при розробці кріокон- сервантів для заморожування тромбоцитів був використаний принцип поєднання у кріозахисному розчині двох кріопротекторів у різних комбінаціях [2,3]. Встановлено, що поєднання кріопротекторів у складі середовища є ефективним засобом підвищення рівня кріозахисної дії кріоконсер- вантів для заморожування концентратів тромбоцитів (КТ) донорської крові людини у порівнянні з результатами їх кріоконсервування з розчинами окремих кріопротекторів, що входять до складу середовищ. Ефективність комбінованих кріоконсервантів була досліджена як при контрольованому (програмний заморожувач), так і при неконтрольованому (пари азота) заморожуванні КТ з різними швидкостями охолодження і наступному зберіганні у рідкому азоті при температурі -196°С [1, 2]. У теперішній час актуальним є дослідження ефективності низькотемпературного консервування КТ в комбінованих середовищах при помірно низькій температурі морозильної камери (-70^-80°С).

Мета

Порівняльне дослідження збереженості функціональних властивостей тромбоцитів, кріоконсервованих в кріозахисних комбінованих середовищах при помірно низький температурі морозильної камери (-70^- 80°С) в залежності від режиму заморожування КТ.

Матеріали і методи

Матеріалом досліджень були КТ, які отримані зі стандартної дози консервованої донорської крові (500,0 мл) методом диференційованого центрифугування з лейкотромбоцитарного шару. Після виділення і до проведення експериментальних досліджень КТ зберігали протягом 12-16 годин при 22±2°С в режимі постійного перемішування.

У роботі використані кріопротектори: ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ, гліцерин і оксиетильований гліцерин зі ступенем полімерізацн n=5 (ОЕГп=5) очищені та ідентифіковані у відділі кріопротекторів ІПКіК НАН України. Кріозахисні середовища містили комбінації ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/ОЕГп=5, ДМАЦ/глицерин, 10%-а сумарна концентрація кріопротекторів у плазмі. Всі розчини кріопротекторів готували ex tempore. Досліджувані середовища повільно, при постійному перемішуванні додавали до зразків КТ у співвідношенні 1:1, час експозиції до заморожування становив 30 хв. У суміші з кріоконсервантом загальний об'єм суспензії КТ складав 100-120 (110±10) мл. Додатковим контролем кріозахисної ефективності комбінованих середовищ були результати заморожування КТ з 10% ДМСО у плазмі і розчином «Тромбокріодмац».

Заморожування КТ здійснювали в полімерних контейнерах "Компопласт" місткістю 300 мл. Були досліджені два режима заморожування: 1) заморожування і зберігання в морозильній камері при температурі -70-80°С; 2) заморожування в парах рідкого азоту при - 188...-193°С до температури -70...- 75°С з наступним зберіганням при -7(Е-80°С. Заморожування тромбоцитів в парах рідкого азоту проводили у широкогорлому сосуді Д'юара: контейнери з біоматеріалом розміщували горизонтально на пенопластовій, термоізолюю- чій укладці, яку було зафіксовано на експериментально визначеному рівні над дзеркалом рідкого азоту (лабораторна модель заморожувача). Перед заморожуванням контейнери із зразками КТ розміщували в металевих холдерах. Зміну температури реєстрували диференційованою мідь-константановою термопарою (діаметр провідників 0,15 мм), яку було розміщено в центрі зразка - імітатора (модельна кріобіологічна система, що являє собою 5% розчин ДМСО або 5% розчини поєднання кріопротекторів ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/ОЕГп=5 у плазмі). При вимірюваннях еталонний спай термопари знаходився при 0°С.

Контейнери із замороженими зразками КТ зберігали від 1 тижня до 1 місяця. Відігрів здійснювали на водяній бані (37°С) до зникнення твердої фази. Кількість клітин у зразках визначали за допомогою світлового мікроскопу методом [2]. Перед визначенням показників функціональних властивостей тромбоцитів як на етапі експозиції, так і після розморожування зразків видаляли кріопротектори методом [4]. Функціональні властивості тромбоцитів на етапах кріоконсервування оцінювали за показниками агрегації, реакції тромбоцитів на гіпотонічний шок (РГШ) та ретракції згустку. Агрегацію тромбоцитів визначали після введення індукторів АДФ (200х10-6М і 50х10-6М, «Serva») чи колагену (6,7*10-3М, «Технология- СТАНДАРТ») фотометричним методом, РГШ - після додавання /2 об'єму дистильованої води до суспензії тромбоцитів (3±0,5*105 клітин/мкл) шляхом реєстрації зміни оптичної густини на аналізаторі плазми крові. Ретра- кцію визначали після 60 хв. інкубації суспензії тромбоцитів (1*105 клітин/мкл) з 5% СаС12. Вимірювання здійснювали при 37±0,5°С. Отримані показники обчислювали у% по відношенню до контролю. Контролем в усіх експериментах були показники відповідних функціональних властивостей тромбоцитів, виділених з донорської крові людини.

Статистичний аналіз результатів проводили за допомогою програми Microsoft Excel з використанням критерію Манна-Уітні.

Результати та обговорення

За результатами попередніх досліджень [3] найвищий рівень збереженості тромбоцитів визначено при їх кріокон- сервуванні у рідкому азоті (-196°С) з багатокомпонентними середовищами, що містять комбінації ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГп=5 у 10% сумарній концентрації.

Результати порівняльного дослідження збереженості стандартних доз КТ, кріоконсервованих з використанням цих комбінованих кріоконсервантів при помірно низький температурі (-70^-80°С), показали, що у зразках КТ, незалежно від складу кріоконсерванта і режиму охолодження, зберігалося від 92 до 96% тромбоцитів. Збереженість функціональної активності кріоконсерво- ваних тромбоцитів - показників АДФ- і колаген-індукованої агрегації, РГШ, ретракції - залежали як від складу кріоконсерванта, так і від режиму заморожування, швидкості охолодження в різних температурних діапазонах. концентрат тромбоцит кріоконсервований охолодження

Показники АДФ- і колаген-індукованої агрегації кріоконсервованих тромбоцитів є відображенням збереженості їх гемостатичної функції. Аналіз отриманих результатів показав наступне. Кріоконсервування стандартних доз КТ (110±10 мл) за режимом 1 (заморожування безпосереднім розміщенням контейнерів у морозильній кріокамері, зберігання при -70^-80оС) сприяло збереженню агрегаційної' активності кров'яних пластинок. Найбільші середні показники АДФ-індукованої агрегації були визначені для кріоконсерванта ДМАЦ/1,2-ПД, колаген-індукованої агрегації - для ДМАЦ/1,2-ПД і ДМСО. Проте суттєвої різниці між показниками АДФ- і колаген-індукованої агрегації тромбоцитів, кріоконсервованих за режимом 1, для 4-х кріоконсервантів - ДМАЦ/ОЕГп=5, ДМАЦ/1,2-ПД, ДМСО і «Тромбокріодмац» - встановлено не було. Значно нижчими були показники агрегації тромбоцитів, кріоконсервова- них з середовищем ДМАЦ/гліцерин. Що стосується показників РГШ тромбоцитів - параметра, відображаючого здібність кров'яних пластинок до відновлення і циркуляції у судинному руслі після трансфузії, то їх величини практично не відрізнялися для кріоконсервантів ДМАЦ/ОЕГ п=5, ДМАЦ/1,2-ПД і ДМСО - 43,7%, 39,9 і 36,6% відповідно. Для кріоконсерванта ДМАЦ/гліцерин показник РГШ склав 35,1%, а для середовища «Тромбокріодмац» - 34% відповідно. Показники ретракції згустка (параметр житєздатності і гемостатичної функції) були найбільшими при використанні ДМСО, найнижчими - комбінованого кріоконсерванта ДМАЦ/гліцерин.

Заморожування КТ за режимом 2 - охолодження в парах азота при - 188...-193°С з наступним зберіганням в морозильній камері при -70^-80оС відрізняється від режиму 1, перш за все, значним зменшенням тривалості плато кристалізації, збільшенням швидкості охолодження в різних температурних інтервалах, тощо (табл.1 і 2).

Таблиця 1 - Параметри термограм охолодження кріозахисних середовищ в парах азота при температурі -188...-193°С (110±10 мл)

Таблиця 2 - Параметри термограм охолодження кріозахистних середовищ в парах азота при температурі -80 °C (110±10 мл)

Ткр - температура початку кристалізації; ДТ - ступінь переохолодження.

Аналіз отриманих результатів показав, що серед досліджуваних кріо- консервантів найбільший рівень збереження тромбоцитів був отриманий після їх заморожування за режимом 2 з кріозахисним середовищем ДМАЦ/ОЕГп=5: середні показники АДФ-агрегації склали 38,9% (АДФ1) і 44,2 (АДФ3), колаген-агрегації 41,0%, РГШ - 54,0 і ретракції 84,9%.

Для кріоконсерванту «Тромбокріодмац» при використанні 2 режиму також визначено підвищення всіх досліджених показників АДФ- і колаген-індукованої агрегації, РГШ, ретракції. Для кріоконсерванту ДМАЦ/1,2-ПД встановлено незначне зменшення показників АДФ- агрегаціїї, але підвищення величини РГШ, ретракції; для ДМАЦ/гліцерин - незначне підвищення АДФ-агрегації і ретракції (табл. 1).

Ефективність кріоконсервування тромбоцитів залежить від багатьох параметрів, зокрема, від швидкості охолодження в різних температурних інтервалах, величини переохолодження, тривалості плато кристалізації. При заморожуванні КТ з ДМСО перевага надається використанню повільних швидкостей охолодження і додержуванню відповідної тривалості плато кристалізації [5]. Як встановлено попередніми дослідженнями [1], кріоконсервування КТ з комбінованими середовищами потребує використання більш високих швидкостей охолодження, запобігання переохолодження позаклітинного середовища, швидкого проходження плато кристалізації.

Висновки

Результати проведених досліджень свідчать про можливості підвищення ефективності кріоконсервування тромбоцитів при помірно низький температурі (-70^-80°С) за рахунок використання комбінованих кріоконсервантів і підвищенням швидкості охолодження КТ в температурному інтервалі від 20°С до -70...-75°С перед зберіганням в морозильній камері. Такий підхід до заморожування дозволяє також зменшити тривалість плато кристалізації, що є позитивним чинником для підвищення ефективності кріоконсервування КТ у комбінованих середовищах при помірно низьких температурах.

Найбільш високі показники збереженості тромбоцитів отримані при використанні середовища, що містить комбінацію проникаючого кріопро- тектору ДМАЦ і непроникаючого ОЕГп.

Література

1. Криоконсервирование тромбоцитов. 2. Эффективность криоконсервантов на основе комбинаций криопротекторов при различных режимах замораживания / О.А. Богданчикова, B.A. Киреев, А.Т. Ходько, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии. - 2010. - Т. 20, № 4. - С. 343-451.

2. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування / А.М. Компанієць, О.В. Книш, Т.М. Гуріна та ін. // Проблемы криобиологии. - 2006.- Т. 6, № 2. - С. 182-191.

3. Криозащитные среды на основе комбинаций криопротекторов для замораживания биологических объектов / А.М. Компаниец, О.А. Богданчикова, Ю.С. Пахомова и др. // Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины /Под редакцией академика НАН Украины А.Н. Гольцева. - Харьков, 2012. - С. 101-126.

4. Пат. № 15014 Україна, МПК8 A0N 1/02. Спосіб видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів / В.І. Грищенко, А.М. Компанієць, О.В. Книш. Заявлено 18.11.05; Опубл. 15.06.06, Бюл. № 6.

5. Controlled-rate versus uncontrolled-rate freezing as predictors for platelet cryopreservation efficacy / B. Balint, D. Paunovic, D. Vucetic et al. // Transfusion- 2006. - Vol. 46, N2.-P. 230-235.

6. Blood preservation workshop: new and emerging trends in research and clinical practice / J.L. Holovati, J.L. Hannon, M.I. Gyongyossy-Issa, J.P. Acker // Transfusion Medicine Reviews. - 2009.-Vol. 23, N 1. - P. 25-41.

Размещено на Allbest.ru