Мікросателітний аналіз генетичного різноманіття мідій Північно-Західного регіону Чорного моря

Загалом за результатами мікросателітного аналізу з використанням чотирьох МС-локусів (Mch 5, Mch 8, MT 203, MT 282) було визначено 59 алелів в п'яти досліджуваних вибірках мідій (п = 118). Для локацій А, В і С (п = 63) з північно-західного регіону Чорного моря за досліджуваними локусами визначено 38 алелів, для локації G (п = 37) з Балтійського моря 39 алелів, для локації H (п = 18) з Північного моря -- 35 алелів. Серед визначених алелів МС-локусів, які відрізнялися за частотами, були присутні як спільні алелі для всіх досліджуваних угруповань мідій, так і алелі, характерні тільки для зразків з окремих угруповань мідій (табл. 3).

Таблиця 3

Частоти алелів мікросателітних локусів і розмір вибірки за досліджуваними угрупованнями мідій

Примітка. и -- розмір вибірки (кількість особин); Na -- кількість алелів; жирним шрифтом в таблиці відмічено частоти алелів, які зустрічаються найчастіше в досліджуваних локаціях (A -- Одеська затока (Гідробіологічна станція ОНУ); B -- район Меморіалу 411-ї батареї; C -- о. Зміїний; G -- Балтійське море; H -- Північне море).

За МС-локусом Mch 5 було визначено 13 алелів, розміри алелів варіювали від 229 п.н. до 287 п.н. Найчастіше зустрічалися алелі з розміром фрагментів ампліфікації 241 п.н. у локаціях А, В, С з частотою 0,646; 243 п.н. у локації H -- 0,429; 245 п.н. у локації G -- 0,340. За МС-локусом Mch 8 -- 17 алелів, розміри яких варіювали від 185 п.н. до 245 п.н. Найчастіше зустрічалися алелі -- 213 п.н. з різною частотою у локаціях А (0,385), В (0,600), С (0,792), G (0,188); 215 п.н. -- у локації G з частотою 0,188; 223 п.н. -- у локації H з частотою 0,286. За МС-локусом МТ203 -- 16 алелів, розміри яких варіювали від 175 п.н. до 243 п.н. Найчастіше зустрічалися алелі -- 179 п.н. (0,426) у локації G; 185 п.н. (0,280) у локації А; 187 п.н. (0,375) у локації С; 189 п.н. з різною частотою у локаціях В (0,292) і H (0,324). За МС-локусом МТ 282 -- 13 алелів, розміри яких варіювали від 332 п.н. до 372 п.н. Найчастіше зустрічалися алелі -- 332 п.н. у локації А з частотою 0,295; 334 п.н. з різною частотою у локаціях А (0,273), В (0,531), С (0,192), G (0,371); 336 п.н. і 340 п.н. у локації С -- 0,192; 344 п.н. у локації H-0,294.

Для досліджуваних угруповань молюсків за допомогою ПЛР-аналізу МС-локусів геному мідій було детектовано 11 спільних алелів різних розмірів: 241 п.н. за локусом Mch 5; 209 п.н. -- Mch 8; 179 п.н., 185 п.н., 187 п.н., 189 п.н., 191 п.н. і 215 п.н. -- MT 203; 334 п.н., 338 п.н. і 344 п.н. -- MT 282. Для локацій (А, В і С) Чорного моря було виявлено 15 спільних алелів за досліджуваними МС-локусами: 237 п.н. і 241 п.н. за локусом Mch 5; 209 п.н. і 213 п.н. -- Mch 8; 179 п.н., 185 п.н., 187 п.н., 189 п.н., 191 п.н. і 215 п.н. -- MT203; 332 п.н., 334 п.н., 336 п.н., 338 п.н. і 344 п.н. -- MT 282. Для локацій (G і H) Балтійського і Північного морів виявлено 23 спільних алеля: 241 п.н., 245 п.н., 249 п.н. і 265 п.н. за локусом Mch 5; 209 п.н., 215 п.н., 217 п.н., 223 п.н., 225 п.н. і 229 п.н. -- Mch 8; 179 п.н., 181 п.н., 185 п.н., 187 п.н., 189 п.н., 191 п.н., 195 п.н. і 215 п.н. -- MT 203; 334 п.н., 338 п.н., 340 п.н., 344 п.н. і 354 п.н. -- MT 282. Крім того, в угрупованнях мідій Чорного моря було виявлено 20 алелів, яких не виявлено в угрупованнях Балтійського та Північного морів, а також 20 інших алелів -- спільних для трьох морів. За МС-локусом Mch 5 мідії з локацій А, В і С відрізнялися від мідій з локації G наявністю алелів розміром: 239 п.н., 243 п.н., 257 п.н. та відсутністю алелів -- 245 п.н., 249 п.н., 253 п.н., 261 п.н. і 265 п.н.; від локації H наявністю алелів: 229 п.н., 233 п.н. і 237 п.н. та відсутністю -- 245 п.н., 249 п.н., 265 п.н. і 287 п.н. За локусом Mch 8 локації А, В і С відрізнялися від локацій G і H наявністю алелів: 207 п.н. і 245 п.н., та алеля 213 п.н. характерного для локації H. За локусом Mch 8 локації А, В і С відрізнялися від локацій G відсутністю алелів: 185 п.н., 195 п.н., 197 п.н., 203 п.н., 211 п.н., 223 п.н., 225 п.н. і 227 п.н.; від локації H -- 193 п.н., 223 п.н., 225 п.н. і 237 п.н. За локусом MT203 локації А,ВіС відрізнялися від локацій G і H наявністю алелів: 203 п.н., 229 п.н., 237 п.н. і 243 п.н., та алеля 183 п.н. характерного для локації H. За локусом MT203 локації А, В і С відрізнялися від локацій G і H відсутністю алелів розміром 211 п.н. і 217 п.н., відповідно. За локусом MT 282 локації А, В і С відрізнялися від локації G тільки наявністю алелів: 332 п.н., 348 п.н., 350 п.н. і 364 п.н.; від локації H відрізнялися наявністю алелів: 336 п.н., 342 п.н., 348 п.н. і 364 п.н. та відсутністю -- 368 п.н. і 372 п.н.

Отримані нами алельні характеристики за МС-локусами геному досліджуваних особин мідій виходили за межі розмірів алелів, що вказані розробниками праймерів [13, 27]. Такі розбіжності в зазначених межах алелів за мікросателітними локусами (Mch 5, Mch 8, MT203, MT282) були продемонстровані при дослідженні популяцій або вибірок різних представників р. Mytilus (табл. 4).

Таблиця 4

Алельна характеристика досліджуваних мікросателітних локусів, розроблених для р. Mytilus

Примітка. и -- розмір вибірки (кількість особин); Na -- кількість алелів; Но -- спостережувана гетерозиготність. Скорочене позначення виду: M. galloprovincialis -- Mg; M. trossulus -- Mt; M. edulis -- Me; M. chilensis -- Mch.

Відомо [1], що мікросателіти є однаковими у близьких видів, і це дозволяє використовувати однакові праймери для проведення мікросателітного аналізу.

Слід зазначити, що досліджувані угруповання мідій раніше нами були проаналізовані за допомогою молекулярного маркера Me 15-16 (до неповторювальної області гена адгезивного білка ноги) з метою встановлення видової приналежності. Згідно результатів нашого дослідження [4], всі особини мідій з локацій північно-західного регіону Чорного моря були ідентифіковані як вид M. galloprovincialis (171 особина), серед мідій з Балтійського моря були виявлені представники видів M. trossulus (одна особина), M. edulis (26 особин) та їхні гібриди (11 особин), серед мідій з Північного моря -- M. edulis (18 особин), M. galloprovincialis (одна особина) та їхній гібрид.

Для визначення рівня генетичного різноманіття досліджуваних угруповань мідій, за кількістю ідентифікованих алелів для кожного з МС-локусів і визначених частот алелів було розраховано основні генетичні характеристики (табл. 5).

Таблиця 5

Генетична характеристика угруповань мідій з різних локацій північно-західного регіону Чорного моря (A, B, C), Балтійського (G) і Північного (H) морів за мікросателітними локусами

Примітка, и - розмір вибірки (кільк. особин); Na - кількість алелів; Ne - кількість ефективних алелей; I - інформаційний індекс; Но -спостережувана гетерозиготність; Не - очікувана гетерозиготність; F -індекс фіксації.

За даними, наведеними в таблиці 5, найбільшу кількість детектованих алелів та найвище значення ефективної кількості алелів на локус у досліджуваних угрупованнях мідій спостерігали у локації А за МС-локусом МТ 203 (13 алелів, Ne = 7,062), локації G за МС-локусом Mch 8 (12 алелів, Ne = 6,672). Найменшу кількість детектованих алелів та найменше значення ефективної кількості алелів на локус спостерігали у локації С за МС-локусом Mch 8 (3 алеля, Ne = 1,524).

Найбільш різноманітними угрупованнями мідій за інформаційним індексом є локації А за МС-локусом МТ203 (I = 2,225) та G за МС-локусом Mch 8 (I = 2,137). Найменших значень цей індекс сягає у локації С за МС-локусом Mch 8 (I = 0,616).

Спостережувальна гетерозиготність варіювала в діапазоні від 0,083 (локація С, Mch 8) до 0,538 (локація С, МТ 282). Отримані значення очікуваної гетерозиготності були значно вищими спостережуваної гетерозиготності і варіювали в діапазоні від 0,344 (локація С, Mch 8) до 0,858 (локація А, MT 203).

Індекс фіксації варіював від 0,088 (локація G, MT 282) до 0,818 (локація С, Mch 5) і характеризувався позитивними значеннями, що свідчить про дефіцит гетерозиготних генотипів в досліджуваних угрупованнях мідій. Можемо припустити, що виявлений дефіцит гетерозигот виник внаслідок схрещування близькоспоріднених організмів між собою -- інбридинг.

Хартль Д.Л. і Кларк А.Г. [20] описують, що багато популяцій підрозділяються на групи всередині більших груп, свого роду структуру, яка називається ієрархічною структурою популяції.

У великих популяціях географічний поділ популяції дозволяє виділяти субструктури, а види, які поширені на великій географічній території, поділяти на субпопуляції. Генетичні наслідки субструктури популяції є наслідком того, що частоти алелів можуть відрізнятися від однієї субпопуляції до іншої.

За допомогою генетичного коефіцієнту інбридингу субпопуляції відносно цілої популяції (Fst), який використовується для вимірювання генетичної диференціації гена між популяціями щодо частот алеля, було виявлено генетичну мінливість між угрупованнями мідій з трьох локацій Чорного моря та між угрупованнями з різних морів: Чорного (локації А, В і С), Балтійського (локація G) і Північного (локація H) (табл. 6).

Таблиця 6

Попарна генетична диференціація серед п'яти досліджуваних угруповань мідій з різних локацій, оцінених за мікросателітними локусами

За отриманими даними коефіцієнта Fst, між угрупованням мідій з локацій Чорного моря було встановлено слабку (В і А, Fst = 0,036; С і А, Fst = 0,048) та середню (С і В, Fst = 0,061) попарну генетичну диференціацію. Між угрупованнями мідій Чорного, Балтійського та Північного морів встановлено середню генетичну диференціацію, яка варіювала від 0,054 до 0,127. За матеріалами розрахунків генетичних дистанцій за Неєм, отримані значення варіювали від 0,211 до 1,130 (табл. 7).

Таблиця 7

Генетичні дистанції (верхня діагональ) та генетична подібність (нижня діагональ) між угрупованнями мідій за результатами мікросателітного аналізу

Найбільш генетично віддаленими (D = 1,130) та найменш подібними (I = 0,323) одна від одної виявилися локації C і G. Це свідчить, що локації C і G представлені різними видами мідій і узгоджується з попередніми даними щодо видової приналежності [4]. Найменш генетично віддаленими і в той час найбільш подібними були угруповання мідій з локації північно-західного регіону Чорного моря: АіВф = 0,216; I = 0,806), АіСф = 0,211; I = 0,809), ВіСф = 0,282; I =0,754).

Також потрібно зазначити, що виявлені в нашому дослідженні за допомогою мікросателітного аналізу гетерозиготні дефіцити та низькі рівні генетичної диференціації раніше були описані в літературі для популяцій різних видів мідій: Perna canaliculus (Gmelin, 1791) з Нової Зеландії [35]; M. edulis (диких і вирощених на фермах) з Нью-Гемпшира, США [7], M. galloprovincialis вздовж східного узбережжя Адріатичного моря [18].

Узагальнювальну оцінку генетичної диференціації досліджуваних угруповань мідій з різних локацій за даними мікросателітного аналізу отримано шляхом проведення кластерного і координатного аналізу на основі генетичних відстаней між угрупуваннями мідій з різних локацій за розподілом частот алелів МС-локусів (рис. 1,2).

За результатами кластерного аналізу досліджувані угрупування мідій утворили два кластери: до першого кластеру увійшли угруповання мідій з регіону Чорного моря (локації А, В, С), до другого кластеру -- локації G і H. Отриманий розподіл локацій на дендрограмі свідчить про більшу генетичну подібність угруповань мідій Чорного моря і про їх меншу подібність з мідіями, виловленими в Балтійському і Північному морях.

Аналіз головних координат показав, що угруповання мідій з локації А і В знаходяться на мінімальній відстані одна від одної та на середній відстані від локації С. Локації G і H (зовнішні групи) були максимально віддалені від угруповань мідій з локацій Чорного моря.

Рис. 1. Дендрограма генетичної подібності між угрупованнями мідій з п'яти локацій, побудована на основі генетичних відстаней між ними за розподілом частот алелів МС-локусів (Mch 5, Mch 8, MT 203, MT 282) з використанням методу UPGMA. Тут і на рис. 2 -- досліджувані локації: A -- Одеська затока (Гідробіологічна станція ОНУ); B -- район Меморіалу 411-ї батареї; C -- о. Зміїний; G -- Балтійське море; H -- Північне море

Рис. 2. Графік розподілу угруповань мідій з п'яти досліджуваних локацій на основі генетичних відстаней між ними за розподілом частот алелів МС-локусів (МсН 5, Mch 8, MT 203, MT 282) за допомогою методу PCoA

Розміщення локацій на дендрограмі (метод UPGMA) було подібне до їхнього розміщення на графіку (метод PCoA). Отримані результати узгоджуються з даними літератури щодо еколого-географічного поширення видів мідій р. Mytilus [10, 36].

Висновки

Таким чином, за допомогою мікросателітного аналізу було досліджено генетичне різноманіття та популяційну структуру угруповань мідії з локацій (А, В і С) північно-західного регіону Чорного моря, а також з локацій (G і H) з Балтійського та Північного морів. За чотирма поліморфними МС-локусами (Mch 5, Mch 8, MT 203, MT 282) було ідентифіковано 59 алелів для п'яти досліджуваних угруповань мідій. Найбільшою кількістю детектованих алелів та найбільш різноманітним угрупованням молюсків за індексом різноманіття Шеннона характеризується локація А (13 алелів, I = 2,225) за локусом MT 203, найменшою кількістю алелів та різноманіттям -- локація С (3 алеля, I = 0,616) за локусом Mch 8.

Дані спостережуваної та очікуваної гетерозиготності, а також індекси фіксації свідчили про дефіцит гетерозиготу досліджуваних угрупованнях мідій. За коефіцієнтом Fst між угрупуваннями мідій з Чорного моря встановлено слабку та середню генетичну диференціацію, а між угрупуваннями мідій з Чорного і Балтійського та Північного морів -- середню генетичну диференціацію.

Застосовані МС-маркери в п'яті досліджених вибірках мідій з різних локацій виявили 20 однакових алелів. Одночасно в чорноморських угрупованнях мідій зустрічались 20 алелів, які не спостерігались у досліджених угруповань мідій з Балтійського і Північного морів. Менші генетичні дистанції, тобто більша генетична подібність встановлена між угрупованнями мідій з Чорного моря. Однак, отримані результати генетичної диференціації виявилися достатніми для виділення внутрішньовидових генетичних груп в досліджуваних локаціях північно-західного регіону Чорного моря.

Показано, що за частотами алелів мікросателітних локусів досліджені угруповання Балтійського та Північного морів відрізняються від угруповань мідій з Чорного моря. За результатами кластерного і координатного аналізів, які проведено з урахуванням частот алелів мікросателітних локусів, наглядно доведено більшу спорідненість угруповань мідій Чорного моря, угруповання мідії з Балтійського та Північного морів більшею мірою дистанційовані від чорноморських мідій. Надалі перспективним є дослідження більшої кількості угруповань мідій з різних локацій Чорного моря з використанням додаткових мікросателітних маркерів.

Список використаної літератури

1. Трофименко О.Л., Гиль М.І., Сметана О.Ю. Генетика популяцій: підручник / за ред. професора М.І. Гиль. Миколаїв (МНАУ): Гельветика, 2018. 254 с.

2. Шурова Н.М. Структурно-функциональная организация популяций мидий Mytilus galloprovincialis Черного моря : монографія. Киев : Наук. думка, 2013. 208 с.

3. Brown A.H.D., Weir B.S. Measuring genetic variability in plant populations / Isozymes in Plant Genetics and Breeding, Part A. Ed. by Tanksley S.D., Orton T.J. 1983. P.219--239.

4. Chubyk I., Chebotar G., Bick A., Chebotar S. Species affiliation of the North-Western region of the Black Sea mussels based on the results of molecular-genetic analysis. Hydrobiol. J. 2022. Vol. 58, N 3. P. 68--75.

5. Chubyk I., Kvach Y., Chebotar S. Genetic composition of Mytilus species in mussel settlements from the North Sea. IV. International Agricultural, Biological & Life Science Conf. (Edirne, Turkey, 29--31 August 2022). Edirne. 2022. P. 115--116.

6. Corrochano-Fraile A., Davie A., Carboni S., Bekaert M. Evidence of multiple genome duplication events in Mytilus evolution. BMC Genomics. 2022. Vol. 23, N 1. P. 1--13.

7. Daniels E.Q., Litvaitis M.K. Does peripheral dislodgement contribute to heterozygote deficiencies in blue mussels? Invertebr. Biol. 2017. Vol. 136, N 3. P. 301--308.

8. Despio P.F.M. Evaluacion genetica del chorito Mytilus chilensis (Hupe, 1854), en base a su distribucion batimetrica en los bancos naturales del estuario Reloncavi, region de Los Lagos. PhD thesis, Instituto de Acuicultura, Puerto Montt Chile. 2016. 69 p.

9. Food and Agricultural Organization (FAO) FAO Yearbook of Fishery and Aquaculture Statistics 2019. Aquaculture Production. Rome : FAO, 2021. 110 p.

10. Gaitan-Espitia J.D., Quintero-Galvis J.F., Mesas A., D'Elia G. Mitogenomics of Southern hemisphere blue mussels (Bivalvia: Pteriormphia): Insights into the evolutionary characteristics of the Mytilus edulis complex. Sci. Res. 2016. Vol. 6. P. 1--10.

11. Gallardo-Escarate C., Valenzuela-Munoz V., Nunez-Acuna G. et al. Chromosome-Level Genome Assembly of the Blue Mussel Mytilus chilensis Reveals Molecular Signatures Facing the Marine Environment. Genes. 2023. Vol. 14, N 4. P. 1--27.

12. Gao X.G., Li H.J., Li Y.F. et al. Sixteen polymorphic simplesequence repeat markers from expressed sequence tags of the Chinese Mitten Crab Eriocheir sinensis. Int. J. Mol. Sci. 2010. Vol. 11, N 8. P. 3035--3038.

13. Gardestrom J., Pereyra R.T., Andre C. Characterization of six microsatellite loci in the Baltic blue mussel Mytilus trossulus and cross-species amplification in North Sea Mytilus edulis. Conserv. Genet. 2008. Vol. 9. P. 1003--1005.

14. Geist J., Kuehn R. Genetic diversity and differentiation of central European freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera L.) populations: implications for conservation and management. Mol. Ecol. 2005. Vol. 14, N 2. P. 425--439.

15. Gerdol M., Moreira R., Cruz F. et al. Massive gene presence-absence variation shapes an open pan-genome in the Mediterranean mussel. Genome Biol. 2020. Vol. 21. P. 1--21.

16. Giantsis I., Mucci N., Randi E., Abatzopoulos T., Apostolidis A. Microsatellite variation of mussels (Mytilus galloprovincialis) in central and eastern Mediterranean: Genetic panmixia in the Aegean and the Ionian Seas. J. Mar. Biolog. Assoc. U.K. 2014. Vol. 94, N 4. P. 797--809.

17. Gosling E.M. Systematics and geographic distribution of Mytilus. Dev. Aquac. Fish. Sci. 1992. Vol. 25. P. 1--20.

18. Hamilton J.S., Piria M., Gavrilovic A. et al. Limited population genetic variation but pronounced seascape genetic structuring in populations of the Mediterranean mussel (Mytilus galloprovincialis) from the eastern Adriatic Sea. Ecol. Evol. 2023. Vol. 13, N 1. P. 1--17.

19. Hammer O., Harper D.A.T., Ryan P.D. PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeont. Electr. 2001. Vol. 4. P. 1--9.

20. HartlD.L., Clark A.G. Principles of Population Genetics. 3rd Ed. Sunderland, MA: Sinauer Associates Inc., 1997. 519 p.

21. Hedrick P.W. Genetics of Populations. 2nd Ed. Boston: Jones and Bartlett, 2000. 553 p.

22. Larrain M.A., Diaz N.F., Lamas C. et al. Heterologous microsatellite-based genetic diversity in blue mussel (Mytilus chilensis) and differentiation among localities in southern Chile. LAJAR. 2015. Vol. 43, N 5. P. 998--1010.

23. Larrain M.A., Gonzalez P., Perez C., Araneda C. Comparison between single and multi-locus approaches for specimen identification in Mytilus mussels. Sci. Rep. 2019. Vol. 9, N 1. P. 1--13.

24. Li R., Zhang W., Lu J. et al. The whole-genome sequencing and hybrid assembly of Mytilus coruscus. Front. Genet. 2020. Vol. 11. P. 1--6.

25. Liu Z.J., Cordes J.F. DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics. Aquaculture. 2004. Vol. 238. P. 1--37.

26. Murgarella M., Puiu D., Novoa B. et al. A first insight into the genome of the filter-feeder mussel Mytilus galloprovincialis. PLoS ONE. 2016. Vol. 11, N 3. P. 1--22.

27. Ouagajjou Y., Presa P., Astorga M., Perez M. Microsatellites of Mytilus chilensis: a genomic print of its taxonomic status within Mytilus sp. J. Shellfish Res. 2011. Vol. 30. P. 325--330.

28. Peakall R., Smouse P.E. GenAIEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research -- an update Bioinformatics. 2012. Vol. 28. P. 2537-- 2539.

29. Promega Technical Manual. Gene Print. STR Systems. Printed in USA. Revised. 1999. 52 p.

30. Riginos C., Cunningham C.W. Local adaptation and species segregation in two mussel (Mytilus edulisxMytilus trossulus) hybrid zones. Mol. Ecol. 2004. Vol. 14. P. 381-- 400.

31. Sneath P.H.A., Sokal R.R. Numerical Taxonomy: The Principles and Pratice of Numerical Classification. San Francisco : Freeman, 1973. 573 p.

32. Sun X.W., Zhang X.F., Zhao Y.Y. et al. Development and application of microsatellite markers in aquatic species. JFSC. 2008. Vol. 15, N 4. P. 689--703. (in Chinese).

33. Sureda A., Box A., Tejad S. et al. Biochemical responses of Mytilus galloprovincialis as biomarkers of acute environmental pollution caused by the Don Pedro oil spill (Eivissa Island, Spain). Aquat. Toxicol. 2011. Vol. 101, N 3--4. P. 540--549.

34. Thiriot-Quievreux C. Advances in cytogenetics of a...