Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Департамент научно-технологической политики и образования

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

"Костромская государственная сельскохозяйственная академия"

Факультет ветеринарной медицины и зоотехнии

Специальность 36.05.01 «Ветеринария»

Кафедра эпизоотологии, паразитологии и микробиологии

КУРСОВАЯ РАБОТА

По дисциплине «Ветеринарная микробиология и микология»

на тему: Лабораторная диагностика столбняка

Выполнил: студент 532z группы 3 курса

факультета ветеринарной медицины и зоотехнии

Чугунова И.Б.

Руководитель: Парамонова Н. Ю.

Караваево, КГСХА, 2024г.



Содержание

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Возбудитель столбняка: общие теоретические аспекты в ветеринарии

1.2 Статистические данные современных методов исследования столбняка

1.3 Анализ эпидемиологии и способов заражения столбнячной инфекцией

1.4 Особенности морфологии и биохимические свойства C. Tetani

1.5 Сравнение различных методик диагностики столбняка

1.6 Особенности бактериологической диагностики столбняка

2. Собственные исследования

2.1 Цели и задачи лабораторных исследований

2.2 Описание методик, проводимых для диагностики столбнячной инфекции

2.3 Проведение анализа полученных микробиологических результатов

2.4 Сопоставление результатов и обсуждение

2.5 Документы, регламентирующие ход исследований

Заключение

Список литературы

Приложение 1

Приложение 2



Введение

Столбняк известен ещё со времён Гиппократа, который первым сделал подробное описание этого заболевания. В древности столбняк часто встречался в период войн у мужчин. А у женщин -- после родов или абортов. В те времена природа столбняка ещё не была известна. То, что это заболевание вызывает бактерия, было обнаружено только в конце XIX века.

В результате проведения в России плановой иммунизации населения против столбняка заболеваемость этой инфекцией значительно снизилась. Но это не говорит о том, что случаи столбняком не регистрируются. Каждый год в РФ регистрируются случаи в пределах 30-35 случаев. Так, в 2015 году показатель заболеваемости на 100 тысяч населения составил 13,0; в 2016 году -- 8,0. возбудитель столбняка инфекция статистика

Число погибших гораздо уменьшилось по сравнению с до прививочного времени и сократилось с 600 до 12-14 случаев в год. В среднем летальность от общего числа заболевших составляет в пределах 40%. Полностью ликвидирован столбняк новорожденных, который раньше давал 100% смертность, как результат родов на дому.

К столбняку восприимчивы все виды млекопитающих, в большей степени лошади, затем овцы, козы и крупный рогатый скот, свиньи, собаки и кошки. Птицы относительно устойчивы, а холоднокровные вообще не чувствительны к возбудителю. Болеют животные любого возраста, но молодые чаще.

Возбудитель распространён повсеместно, зональное распределение болезни прямо зависит от зонального географического распространения возбудителя в почве, которая, в свою очередь, связана с плотностью поголовья. Чаще C. tetani обнаруживают в удобряемых пашнях, садовой земле, уличной грязи, кормах.

Исследование посвящено анализу современных методов диагностики столбняка с целью выявления наиболее эффективного подхода к выявлению бактерии Clostridium tetani. В работе проведен обзор литературы, сравнение преимуществ и ограничений различных методов диагностики, а также анализ результатов предыдущих исследований. Ожидается, что результаты исследования смогут сыграть важную роль в совершенствовании методов борьбы с возбудителем столбняка и уменьшении смертности от этого заболевания.

Актуальность исследования: в настоящее время столбняк остается серьезной проблемой, особенно в развивающихся странах, где отсутствует эффективная профилактика и лечение этого заболевания. Несмотря на наличие вакцины, остаются случаи заболевания, требующие своевременной диагностики для предотвращения осложнений и летальных исходов. Поэтому исследование диагностики столбняка является актуальным и важным для развития эффективных методов борьбы с этим заболеванием.

Объект исследования: объектом исследования является диагностика столбняка, то есть способы выявления наличия бактерии Clostridium tetani в организме животных.

Предмет исследования: предметом исследования являются современные методы диагностики столбняка, включая культуральное выращивание, ПЦР и иммунологические тесты. Цель исследования - сравнение эффективности различных методов диагностики для выявления бактерии Clostridium tetani и определение их преимуществ и ограничений.

Цель и задачи: целью данного исследования является оценка современных методов диагностики столбняка и выявление наиболее эффективного подхода к диагностике этого заболевания. Для достижения этой цели ставятся следующие задачи:

- Провести обзор литературы по современным методам и исследованиям столбняка.

- Сравнить преимущества и недостатки различных методов диагностики столбняка.

- Сопоставить результаты исследований различных авторов для выделения основных трендов и выводов.

Методы исследования: в рамках этого исследования будут использованы методы анализа научной литературы, систематизации и обобщения данных, сравнение и анализ результатов предыдущих исследований. Кроме того, будут проведены некоторые собственные исследования на базе уже существующих данных и теоретических изысканий.

Ожидаемые результаты: от исследования ожидается получение объективного сравнения различных методов диагностики столбняка, выделение и суждение их преимуществ и недостатков. Ожидается, что исследование поможет определить наиболее эффективный и точный метод диагностики столбняка, который может быть основой для дальнейших исследований и разработки новых подходов к выявлению этого заболевания.



1. Обзор литературы

1.1 Возбудитель столбняка: общие теоретические аспекты в ветеринарии

Столбняк (Tetanus) -- одно из самых тяжелых инфекционных заболеваний, вызываемое Clostridium tetani. Возбудитель столбняка Clostridium tetani -- грамположительные палочки, анаэроб, развивается в инфицированных глубоких ранах в ассоциации с гноеродными микроорганизмами, не проявляет протеолитических свойств [12].

В присутствии кислорода и понижения температуры до -4 °C возбудители переходит в споровую формуистановятся более устойчивы во внешней среде. Так,споры выдерживают нагревание до 90°C до 2-х часов, при кипячении погибают через 3 часа. В высушенном состоянии могут быть жизнеспособны даже при температуре 150°C. В навозе могут сохраняться до 10 лет!Антисептики и дезинфицирующие средства убивают столбнячную палочку в течение 3- 6 часов.

Столбнячная палочка --это постоянный обитатель кишечника животных. Оттуда она попадает во внешнюю среду, в почву. Поэтому наибольшая обсемененность почвы наблюдается в сельскохозяйственных районах с повышенной влажностью. Также ее можно обнаружить при соответствующих исследованиях в почве на дачах, садах-- огородах, на пастбищах, то есть там, где возможно загрязнение почвы фекалиями животных. Заметьте, что самое распространенное удобрение-- это навоз животных.

Возбудитель проявляет свои патогенные свойства и возможность развитьсязаболеваниюпри попадании на поврежденные ткани, лишенные доступа кислорода. При отсутствии кислорода, при нормальной температуре тела человека или животного и влажной среде из споровой формы палочкапереходит в вегетативную форму, которая потом и способствует развитию заболевания. А это как раз оптимальная среда в раневой поверхности [1].

Споры столбнячной палочки могут обитать в любой почве, в обычной пыли, пресной и морской воде. Чаще всего их можно обнаружить во влажной, лесной или хорошо удобренной земле (рисунок 1). Именно настолько широкая распространенность делает столбняк настолько опасным.

Рис. 1 Циркуляция столбнячной палочки в природе

Наибольшую угрозу представляют обширные рваные, глубокие раны, особенно, при наличии карманов, поскольку для развития спорам нужно несколько условий: температуры выше 37 градусов, влажность и отсутствие кислорода.

В некоторых случаях, столбняк может развиваться даже в неглубоких поверхностных ранах, особенно, если они не были обработаны и в них присутствуют другие бактерии. Помимо этого, потенциально опасны обморожения, ожоги, пролежни.

Столбнячная палочка вырабатывает экзотоксин (тетанотоксин), по силе действия уступающий только ботулиническому токсину; летальная доза тетанотоксина для млекопитающего (к примеру, лошади) -- менее 3,5 нг/кг (0,2- 0,3 мг).

Столбняк -- неконтагиозная инфекция.

Механизм заражения раневой -- повреждения покровных тканей, которые загрязняются зараженными почвой или пылью.

После проникновения возбудитель размножается только в зоне инокуляции, но образующийся экзотоксин проникает в кровь, лимфу и периневральные пространства. Экзотоксин содержит три фрагмента:

· тетаноспазмин (наиболее агрессивная фракция токсина),

· тетанолизин

· низкомолекулярную фракцию.

Основные клинические проявления столбняка обусловлены:

· избирательным действием тетаноспазмина на вставочные нейроны центральной нервной системы (ЦНС) животного. Из места инокуляции тетаноспазмин в течение 2-14 суток по осевым цилиндрам двигательных нервов перемещается в нейроны спинного мозга, затем проникает во вставочные (ингибиторные/тормозные) нейроны ЦНС, нарушает высвобождение ингибиторных медиаторов (глицина и гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в синаптическую щель, следствием чего является нарушение координации эфферентных рефлекторных дуг, что обусловливает тоническое напряжение поперечнополосатой мускулатуры.

· Тетаноспазмин поражает также вегетативную нервную систему и ретикулярную формацию [6-10].

· Тетанолизин вызывает гемолиз эритроцитов, может разрушать лейкоциты, обладает кардиотоксическими свойствами.

· Низкомолекулярная фракция тетанотоксина повышает концентрацию ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях и также может вызывать гемолиз эритроцитов [14].

По степени распространенности выделяют генерализованный столбняк и местный столбняк в двух клинических формах:

· локальное поражение в области раны (местный гипертонус и локальные судороги)

· бульбарный столбняк с поражением центров продолговатого мозга, с избирательным поражением мышц шеи, глотки и гортани, сосудодвигательного и дыхательного центров [20].

· Местный столбняк встречается редко и, как правило, без лечения переходит в генерализованную форму.

Дифференциальная диагностика проводится между такими заболеваниями, как гипокальциемическая тетания, эпилепсия, хорея, менингит, энцефалит, субарахноидальное кровоизлияние, отравление стрихнином, бешенство, сепсис, побочные эффекты лекарственных препаратов.

1.2 Статистические данные современных методов исследования столбняка

Статистика по случаям столбняка в мире показывает, что заболевание остается серьезной проблемой, особенно в развивающихся странах. По данным Всемирной организации здравоохранения, около 1,2 миллиона случаев столбняка происходят ежегодно, из которых около 95% заканчиваются летально. В целом, смертность от столбняка оценивается примерно в 10-ти процентах от всех случаев.

Современные методы исследования столбняка включают в себя как лабораторные методы, так и клинические наблюдения. Лабораторная диагностика столбняка осуществляется путем исследования образцов крови или тканей на наличие бактерии Clostridium tetani. Для этого используются различные методы, такие как культуральное выращивание, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и иммунологические тесты.

В большинстве случаев диагноз столбняка основывается не на лабораторных данных, а на клинических. Обнаружение столбнячной палочки в ране далеко не всегда дает основание ставить диагноз «столбняк», так как она обнаруживается примерно у 30 % травмированных животных. У 85-90 % больных животных уже в первый день заболевания появляется тризм, у остальных 10-15 % -- не позже 2-3-го дня. В 1-2-й, реже на 3-й день болезни появляются тонические сокращения длинных мышц спины, межреберных и шейных мышц, мышц живота. У 40-50 % зараженных животных появляются боли в глотке и затруднение при глотании. С большой частотой у крупного рогатого скота отмечается: постоянная мышечная боль, гипергидроз, гиперсаливацию, тахикардию, тахипноэ, тетанические судороги (периодически возникающие на фоне общего гипертонуса), повышенную чувствительность к различным внешним раздражителям (провоцирующим генерализованные судороги), сохранение сознания даже во время судорог.

Основой интенсивной симптоматической терапии столбняка является активная противосудорожная терапия, коррекция гипоксии, нарушений водно-электролитного и кислотно-щелочного баланса.

Наилучшие результаты при лечении гиперактивности скелетной мускулатуры достигаются путем применения бензодиазепинов: мидазолама (в/в инфузия 0,1-0,3 мг/кг/ч), диазепама (в/в 10-40 мг каждые 1-8 часов или до 40 мг/ч). В качестве адьюванта к терапии бензодиазепинами назначается морфин в дозах 20-180 мг/сут. В случаях, когда судорожный синдром не купируется, на фоне сохранения произвольной двигательной активности, показано применение мышечных релаксантов с переводом на искусственную вентиляцию легких (ИВЛ). Допустимым считается применение фенобарбитала, тиопентала натрия, пропофола, аминазина.

Интересны сведения об эффективном применении магния сульфата в ветиринарии. Магнезиальная терапия требует тщательного мониторинга клинических и лабораторных критериев эффективности: адекватности спонтанного дыхания и системной гемодинамики, активности пателлярного рефлекса, поддержания терапевтического уровня ионов магния в плазме крови (2,5-4 ммоль/л).

Встречаются отдельные работы, указывающие на возможность применения ботулотоксина при столбняке в виде инъекций в отдельные группы мышц (m. masseter, m.temporalis и другие)[23].

Нестабильность вегетативной нервной системы рекомендуется купировать назначением препаратов с короткими периодами действия. При выраженной тахикардии предлагается эсмолол. При первых признаках блокад в проводящей системе сердца, для купирования гиперсаливации и гиперсекреции назначается атропин в клинически эффективных дозах. При необходимости -- установка искусственного водителя ритма. При артериальной гипотонии назначается допамин или норадреналин. На основании результатов мониторинга производится коррекция расстройств водно-электролитного и кислотно-щелочного баланса. В случаях тяжелого течения респираторная терапия по показаниям требует:

· раннего наложения трахеостомы

· санации трахеобронхиального дерева

· перевод на ИВЛ с учетом чрезвычайно повышенного газообмена у больных столбняком

· профилактики, своевременного выявления и лечения ателектазов легких.

· тщательный мониторинг вероятности осложнений со стороны опорно-двигательного аппарата, выделительной системы, сердечно-сосудистой системы, органов желудочно-кишечного тракта позволяет своевременно выявить и начать лечение осложнений (переломы позвоночника, почечная недостаточность, тромбоэмболии, миокардит, стрессовые язвы).

Таким образом, современную терапию столбняка в ветеринарии кратко можно представить следующим образом:

1. Специфическая иммунотерапия одним из препаратов: противостолбнячный лошадиный иммуноглобулин, лошадиная противостолбнячная сыворотка [17];

2. Купирование гиперактивности скелетной мускулатуры: диазепам, мидазолам, морфин, баклофен интратекально, дантролен, атракурий, векуроний и другие;

3. Антибактериальная терапия: метронидазол, цефалоспорины, а также возможны клиндамицин, эритромицин, тетрациклин;

4. Коррекция гемодинамики, водно-электролитного и кислотно-щелочного баланса: допамин, норадреналин, магния сульфат, инфузионная терапия, препараты калия, хлора.

1.3 Анализ эпидемиологии и способов заражения столбнячной инфекцией

Столбняк встречается повсеместно. Наибольшее распространение он имеет в странах с жарким и влажным климатом. Естественным резервуаром возбудителя и источником инфекции является почва. Возбудитель столбняка обнаруживается в 20-100% проб почвы.

Кроме того, столбнячная палочка относится к постоянным обитателям кишечника травоядных животных и обнаруживается в кишечнике 5-40% здоровых людей. Попадая с фекалиями в почву, палочка превращается в споровую форму. Споры столбнячной палочки из почвы попадают на растения и овощи, с которыми вновь проникают в кишечник животных и человека. Из внешней среды возбудитель заболевания попадает в организм человека при ранениях, ожогах, обморожениях, при родах и абортах, протекающих в антисанитарных условиях.

Развитию столбняка способствует не только загрязнение ран почвой, но и наличие нежизнеспособных тканей и инородных тел в ране, запоздалая первичная обработка раны, отсутствие у больного иммунитета. Например, до введения в практику специфической профилактики во время Первой мировой войны 1914-1919 гг. столбняк развивался у 2,4-8 человек из 1000 раненых. После введения обязательной иммунизации против столбняка во время Второй мировой войны 1939-1945 гг. заболеваемость столбняком составила 0,1-0,6 человек на 1000 раненых. В глубокой ране, имеющей размозженные ткани и обеспечивающей анаэробные условия, благоприятные для развития возбудителя, споры трансформируются в вегетативные клетки, продуцирующие столбнячный токсин.

Для столбняка характерен контактный механизм передачи возбудителя. Путь передачи - раневой: бытовые и производственные травмы, ранения, ожоги, обморожения, операционные и инъекционные раны.

Основную группу риска составляют работники сельского хозяйства и дорожные рабочие. Больной человек для окружающих не опасен. В летние месяцы заболеваемость столбняком выше. Чаще болеют мужчины. В странах, где отсутствует плановая вакцинация, часто заболевают новорожденные и дети младшего возраста. При этом смертность у новорожденных достигает 95%. Например, во всем мире в 1993 г. от столбняка умерло 515000 новорожденных. Частота заболеваемости в развивающихся странах составляет 10-50 случаев на 100 тысяч населения, а в странах с обязательной иммунопрофилактикой - 0,1-0,6 случая на 100 тысяч населения.

В Российской Федерации в 2000 г. было зарегистрировано 33 случая заболевания столбняком, в 2001 г. - 42 случая, в 2002 г. - 40 случаев (2 случая - 12 дети до 14 лет), в 2003 г. - 25 случаев, в 2004 г. - 35 случаев, в 2005-2012 гг. - по 30-35 случаев ежегодно. Летальность при столбняке достигает 40%, несмотря на применение лечебных препаратов.

За последние годы данных о заболевании столбняком нет (рис.1).

Рис.1 Эпизоотическая ситуация в РФ за 2023г.

1.4 Особенности морфологии и биохимические свойства C. tetani

Вегетативные клетки столбняка представляют собой грамположительные палочки, имеющие закруглённые концы толщиной 0,3-0,8 мкм и длиной 4-8 мкм. Клетки являются подвижными, поскольку содержат большое количество жгутиков (20 и более), расположенных по периферии клетки. В мазках, как правило, могут располагаться одиночно или образовывать цепочки [9].

Возбудитель столбняка может существовать в виде вегетативных клеток или спор. Вегетативная клетка С. tetani представляет собой крупную палочку с закругленными концами размером 4-8х0,3-0,8 мкм (рисунок 2).



Рис.2 - Вегетативные клетки С. tetani, компьютерное изображение.

По Граму вегетативные клетки C. tetani окрашиваются положительно (рисунок 3).

Рис.3 - Вегетативные клетки возбудителя столбняка, окраска по Граму.

При неблагоприятных условиях внешней среды возбудитель столбняка образует споры круглой формы, располагающиеся терминально. Диаметр споры превышает поперечник вегетативной клетки, поэтому клетка со спорой имеет вид барабанной палочки (рисунок 4).

Рис.4 - Споры возбудителя столбняка внутри вегетативной клетки, электронная микроскопия.

Вегетативные клетки C. tetani обладают подвижностью за счет наличия жгутиков. Одна клетка имеет до 20 жгутиков и более (рисунок 5).

Рис.5- Жгутики C. tetani, электронная микрофотография.

Столбнячная палочка капсул не образует.

В сухом состоянии могут переносить нагревание до 150 °C, в морской соленой воде продолжительность жизни составляет до 6 месяцев. В почве, испражнениях, на разных предметах могут сохраняться более 10 лет.

В анаэробных условиях, при температуре 37 °C и достаточной влажности споры прорастают в вегетативную менее устойчивую форму.

Культуральные свойства

Для культивирования на питательных средах необходимо в обязательном порядке обеспечивать соблюдение анаэробных условий. На плотных питательных средах (желатин, МПА) образуются прозрачные мелкие колонии с неправильными краями, которые через некоторое время могут приобретать стеклянный блеск. Растёт в виде серовато-жёлтых или прозрачных гладких (S) и шероховатых (R) колоний (рисунок 6). В жидкой питательной среде растёт медленно, может наблюдаться слабое помутнение и лёгкий слой пылевидного осадка на стенках пробирки.

Рис.6 Рост С. tetani на кровяном агаре

При уколе в толщу плотной питательной среды образует мелкие колонии, которые похожи на кусочки ваты. Разжижает желатин с газообразованием. С. tetani не обладают сахаролитическими ферментами, не образуют каталазу, пероксидазу и цитохромоксидазу, протеолитические свойства выражены слабо.

Антигенные свойства

С. tetani имеют Н и О-антигены. По Н-антигенам дифференцируются на 10 сероваров. Но, что существенно, все они продуцируют идентичные по антигенным свойствам экзотоксины:

· тетанолизин

· тетаноспазмин.

Биохимические свойства

ь Основные продукты метаболизма --масляная, уксусная, пропионовая кислоты и этанол.

ь Большинство штаммов не обладает сахаролитической активностью, но выделено несколько штаммов, которые ферментируют глюкозу.

ь Clostridium tetani проявляет слабые протеолитические свойства; медленно расщепляет пептоны и белки до аминокислот (пептоны разлагаются до угольной кислоты, аммиака, водорода, индола и летучих кислот);

ь для роста необходимы гистидин, аргинин, валин, изолейцин, тирозин, лейцин и триптофан.

ь Бактерии образуют желатиназу и рениноподобный фермент, который опосредует возникновение затемнённых зон вокруг колоний С. tetani на молочном агаре.

Патогенность

К столбняку восприимчивы все виды животных, но наиболее чувствительны лошади. Болеют также собаки, кошки и дикие млекопитающие. Описаны случаи столбняка у кур, гусей и индюков. К столбнячному токсину исключительно восприимчив человек. Холоднокровные - лягушки, змеи, черепахи, крокодилы - невосприимчивы к столбняку при температуре ниже 20єС, но введённый токсин длительное время циркулирует в их организме.

Из лабораторных животных наиболее восприимчивы белые мыши, морские свинки, кролики. Инкубационный период у белых мышей - до 36 ч, у морских свинок - до 48ч, у кроликов - до 3-4сут. Болезнь у них развивается по типу общего или восходящего столбняка. Особенно характерно эта клиническая картина проявляется у белых мышей: ригидность хвоста и инокулированной лапки. Конечность вытянута, ограничена в подвижности, туловище искривлено в сторону инокулированной лапки, постепенно процесс захватывает и вторую половину тела. Положенная на спину мышь не может самостоятельно перевернуться. Погибающие животные принимают характерную позу с искривлением тела и вытянутыми лапками. Гибель их наступает в течение от 12 ч до 5 сут. [8]

Патогенез

Основной патогенетический фактор при столбняке - экзотоксин, и в первую очередь тетаноспазмин, представляющий собой нейротоксинию. Он не поражает кожу и не оказывает цитотоксического действия. Ферменты протеазы и фибринолизин, расплавляя кровяные сгустки и тромбы, способствует распространению токсина за пределы очага размножения микробов. При глубоком ранении споры в условиях анаэробиоза быстро вегетируют, происходит интенсивное размножение бактерий и синтез токсина.

Экзотоксин поражает двигательные нервные центры, спинной и головной мозг, что в конечном итоге обуславливает основной симптомокомплекс столбняка. Под влиянием токсина снижается активность холинэстеразы и соответственно гидролиз ацетилхлорида, неизбежно ведущий к избыточному его образованию, вследствие чего концевая пластинка нервно-мышечного синапса приходит в состояние повышенного автоматического возбуждения. Судороги приводят к расстройству дыхания, развивается ларинготрахеоспазм, наступает гипоксия, респираторный и метаболический ацидоз. Под действием избыточного количества молочной кислоты может развиваться отёк мозга. Животные погибают в результате асфиксии или паралича сердца.

Иммунитет и средства специфической профилактики

У животных некоторых видов отмечается естественная устойчивость к столбняку. Известно, что крупный рогатый скот и свиньи болеют реже, чем другие виды животных. Предполагают, что у них с кормом поступают споры возбудителя столбняка, которые вегетируют в пищеварительном тракте с образованием токсина, который, всасываясь в очень небольших количествах, вызывает иммунитет.

Принято считать, что иммунитет при столбняке в основном антитоксический. Вакцинация животных столбнячным анатоксином сообщает им стойкий и напряжённый иммунитет, продолжающийся несколько лет.

У нас в стране применяют высокоэффективный концентрированный столбнячный анатоксин, представляющий собой преципитат 1% квасцового анатоксина, изготовленный из нативного столбнячного токсина путём обработки его формалином (и выдерживании смеси при повышенной температуре экзотоксин превращается в анатоксин (рис.6), который применяют для специфической профилактики столбняка у человека или для гипериммунизации животных с целью получения антитоксина), теплом, алюмокалиевыми квасцами и фенолом. Применяют его с профилактической целью в местностях, эпизоотически неблагополучных по столбняку, особенно там, где зарегистрированы частые случаи заболевания взрослых животных и молодняка. Иммунитет наступает через 30 суток после прививки и сохраняется у лошадей в течение 3-5 лет, у других видов животных - не менее года.

Рис.6 схема получения столбнячного анатоксина

Для пассивной иммунизации и лечения больных животных предложена антитоксическая противостолбнячная сыворотка гипериммунизированных столбнячным анатоксином лошадей.

1.5 Сравнение различных методик диагностики столбняка

Культуральное выращивание является классическим методом диагностики столбняка, который позволяет выявить наличие бактерии в образце. Однако этот метод требует времени и специальных условий для выращивания и идентификации бактерии, что снижает его эффективность в срочных случаях. Кроме того, существует риск ложно-отрицательных результатов из-за условий транспортировки образцов.

РБН--для обнаружения токсина проводят реакцию биологической нейтрализации на лабораторных животных. Для нейтрализации токсина используют антитоксическую сыворотку.

Для обнаружения токсина разработаны также серологические реакции: реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция латекс-агглютинации и реакция коагглютинации. Обнаружение возбудителя производится путем бактериоскопического и бактериологического исследования материала с места входных ворот инфекции.

· Бактериоскопическое исследование направлено на обнаружение в мазках или мазках-отпечатках микробных клеток в виде “барабанных палочек”.

· Бактериологическое исследование производится путем посева материала на среду Китта-Тароцци с последующим пересевом на плотные среды для выделения чистой культуры и изучения ее свойств.

ПЦР - более современный метод диагностики, который позволяет увеличить чувствительность и специфичность выявления бактерии в образце. С использованием специфических примеров ДНК, этот метод может дать результаты быстрее и точнее, чем культуральное выращивание. Однако ПЦР требует специализированного оборудования и обученного персонала.

Иммунологические тесты, такие как ELISA и иммунодиффузия, могут быть также использованы для диагностики столбняка. Они основаны на обнаружении антител против бактерии в образце крови. Эти тесты имеют хорошую чувствительность, и могут быть проведены быстрее, чем культуральное выращивание.

1.6 Особенности бактериологической диагностики столбняка

Особенности забора материалов

От больных исследуемой группы берется гной, экссудат, раневое содержимое, тампоны из раны, кусочки некротизированных тканей, инородные тела от умерших, кровь, застарелые рубцы, селезёнку. В случаях возникновения столбняка после родов и абортов необходимо проводить исследования выделений и биоптатов из матки и влагалища.

Все биологические материалы незамедлительно направляются в бактериологическую лабораторию в специализированных транспортных средах, защитив их от губительного влияния кислородной среды.

Первичная бактериоскопия

С секционного или патологического материалов готовят несколько препаратов-отпечатков и мазков, после чего их окрашивают по Граму, Ожешко (для выявления спор) и микроскопируют в иммерсионной системе. Присутствие в мазках грамположительных длинных палочек с терминальными круглыми спорами при соответствующей клинической картине позволяет вызвать подозрения на присутствие С. tetani. Но на основании только микроскопических исследований делать определённые выводы и ставить диагноз нельзя, поскольку в материалах могут быть сходные по морфологии непатогенные микроорганизмы (С. tetanomorpham, С. pseudotetanicum).

Биологическое и бактериологическое исследование

Полученный в лаборатории материал необходимо растереть в стерильных ступках с песком, добавляя среду для контроля стерильности до получения 10% суспензии. Жидкую фазу материала необходимо разделить на две равные части, одну из которых прогреть при температуре 80° С в течение 20 минут. Это приведёт к гибели вегетативных клеток бактерий и значительно повысит шансы на выделение С. tetani. Далее нагретый и не гретый материал исследовать необходимо параллельно. Для накопления анаэробных клостридий обе порции необходимо высеять в две пробирки со средой Кита-Тароцци (или тиогликолевым бульоном).

Одновременно для получения изолированных колоний необходимо произвести посев на чашку с безкислородным кровяным агаром следующего состава:

К эритрит-агару необходимо добавить 10% среды 199, 10 мкг / мл метадиону, 10 мкг / мл гемина, 10 мг / мл цистина, 0,1% твина - 80 и 5% дефибринированной крови кролика или барана. При сильном загрязнении проб посторонней микрофлорой до агара можно еще добавить гентамицин, неомицин или налидиксовую кислоту в количестве 40-50 мкг / мл. Посевы необходимо нагреть, соблюдая анаэробные условия при температуре 37 °С в течение 48-72 часов.

Колонии С. tetani на кровяном агаре будут полупрозрачными, плоскими, с неровными краями, очень часто в виде переплетённых нитей, которые внешне напоминают мелких пауков. Вокруг колоний возникает зона гемолиза. Если колоний нет, необходимо делать высев из среды накопления на кровяной агар [9].

При посеве уколом в высокий столбик сахарного агара колонии С. tetani напоминают облака. Выделенную чистую культуру идентифицируют по культуральным, морфологическим признакам и в обязательном порядке определяют токсигенность, являющуюся определяющим тестом при диагностике столбняка. Для выявления токсического действия культуры или первичного анализируемого материала необходимо поставить биологическую пробу нейтрализации токсина столбнячной сывороткой на животных.

Столбнячный токсин можно получить путём выращивания культуры в среде Кита-Тароцци в течение 2-3 суток с последующим центрифугированием бульона или фильтрацией.

Двум белым мышам внутримышечно (у корня хвоста) необходимо ввести по 0,5 мл смеси фильтрата с антитоксической столбнячной сывороткой (200 МЕ). Предварительно смесь необходимо выдержать в термостате в течение 40-60 минут. Наблюдение за мышами необходимо проводить на протяжении 4-5 суток. Если в фильтрате содержался столбнячный экзотоксин, зараженные животные погибнут при явлениях восходящего столбняка. Контрольные животные останутся живыми.

Аналогичным образом биологическую пробу необходимо ставить и с исследуемым материалом (растертые в изотоническом растворе кусочки тканей, экссудат, гной и пр.). Возникнет такая же клиническая картина столбняка, как и после введения токсина, а антисыворотка нейтрализует присутствие токсина.

Для выявления столбнячного токсина в средах накопления, а также для идентификации выделенной чистой культуры С. tetani применяют высокоспецифическую и более экономическую реакцию непрямой гемагглютинации. В ряде лунок полистироловой пластины необходимо развести культуральную жидкость в буферном растворе с кроличьей инактивированной сывороткой от 1:10 до 1:1280. После чего в каждую лунку необходимо внести по 0,1 мл столбнячного антительного эритроцитарного диагностикума (суспензия эритроцитов барана, которые сенсибилизированы столбнячной антитоксической сывороткой). Пластины с лунками необходимо поместить в термостат на 60 минут, после чего оставить при комнатной температуре. Предварительный результат необходимо учитывать через 3 часа, окончательный - через 18 часов.

При наличии столбнячного токсина в некоторых лунках появится феномен гемагглютинации. Для идентификации С. tetani в разных объектах можно применять люминесцентно-серологический метод, используя антимикробную противостолбнячную сыворотку, которую метят изотиоцианатом флуоресцеина, а также методы иммуноферментного анализа.

Специально для выделения чистой культуры возбудителя столбняка Филдсом предложил оригинальный способ: несколько капель прогретого при температуре 60 °С в течение 90 минут исследуемого материала или культуры с жидкой средой накопления сеют в конденсационную жидкость на дне пробирки со скошенным сывороточным или кровяным агаром. Посев необходимо выращивать 18-24 часа в условиях строгого отсутствия кислорода. Возбудитель столбняка благодаря своему ползучему росту, определяющимся наличием жгутиков, будет расти в виде тоненькой пленки по всей поверхности среды. Из верхней части пленки необходимо сделать 3-5 таких пересевов до получения чистой культуры.

Серологический метод диагностики столбняка практически не применяется. Только для контроля эффективности вакцинации столбнячным анатоксином (определение уровня антитоксина в крови) выборочно осуществляют постановку реакции нейтрализации, ИФА, РНГА.



2. Собственные исследования

2.1 Цели и задачи лабораторных исследований

Рассмотрим пример, установления диагноза столбняка на примере падшего животного в одном из хозяйств. В хозяйстве СПК «Гридино» пал теленок в возрасте 10 месяцев. Ветеринарным врачом хозяйства был проведён осмотр животного, проанализирована клиническая картина заболевания, поставлен предварительный диагноз - столбняк.

При этом для микроскопического исследования в лабораторию был отправлен следующий патологический материал: кусочки тканей из глубоких слоёв раневых поражений, выделения из ран, гной, кусочки селезёнки и печени, массой по15, 25 г и 15 мл крови.

При постановке диагноза врач ссылался на то, что ведущей ролью в развитии столбняка являются нервно-рефлекторные механизмы. Сотрудники указали, что животное было ранено об решетку загона. Попавшие в рану столбнячные споры при благоприятных условиях будут прорастать, размножаться и выделять токсин. Столбнячный токсин будет вызывать раздражение нервных окончаний, которые имеются в мышцах и коже, раздражение будет передаваться в центральную нервную систему, где возникают очаги повышенной возбудимости, которые и будут вызывать длительные судорожные сокращения внутренних органов и мускулатуры.

Лабораторные исследования должны проводится в соответствии со стандартной схемой бактериологического исследования патологического материала на столбняк [2].

Лабораторную диагностику проводят в два этапа:

1. обнаружение токсина

2. выделение чистой культуры с последующим анализом на токсичность.



2.2 Описание методик, проводимых для диагностики столбнячной инфекции

В первую очередь проводится биопроба для обнаружения токсина в патологическом материале. Исследуемый патологический материал, в данном случае, кусочки селезёнки и печени массой 25 г, растирается в стерильной ступке с кварцевым песком, добавляется двойной объем физиологического раствора.

Смесь выдерживается 60 минут при комнатной температуре, после чего фильтруется через ватно-марлевый фильтр. Для этой процедуры также можно использовать бумажный фильтр.

Фильтрат вводится внутримышечно в бедро задней лапки двум лабораторным мышам в дозе 0,5…1 мл, иногда для достижения более быстрого результата можно ввести фильтрат в область корня хвоста в смеси с хлористым кальцием. Если возбудитель столбняка имеет место, то характерные признаки будут проявляться уже через 48-96 часов.

Следующий этап - выделение чистой культуры с последующей проверкой её на токсичность. Для этого сначала необходимо выполнить мазок-отпечаток и окрасить его по Граму.

Для микроскопирования берется стерильное стекло, для этого его сначала надо обезжирить над пламенем спиртовки и положить перед собой. После чего необходимо прокалить скальпель и пинцет, отрезать кусочек селезёнки кубической формы размером приблизительно 0,5 см. Захватить этот кусочек пинцетом и с силой провести по стёклышку несколько раз. Далее мазок с обратной стороны стекла необходимо обвести специальным карандашом по стеклу и дать мазку высохнуть на воздухе.

Когда мазок высохнет, его необходимо зафиксировать. Фиксацию необходимо проводить над пламенем спиртовки. Предметное стекло медленно проводят три раза над пламенем горелки. Микроорганизмы прикрепляются к стеклу и погибают, при этом они не смываются при дальнейшей обработке.

Таким образом, мазок будет сделан и зафиксирован, а для его микроскопирования его необходимо окрасить.

Окраска по Грамму:

1) На фиксированный мазок помещается полоска фильтровальной бумаги, которая предварительно пропитывается спиртовым раствором генциан кристаллвиолета, затем наносится на неё несколько капель дистиллированной воды для увлажнения, выдерживается 2 минуты, после чего бумажка удаляется.

2) Препарат, не промывая, обрабатывается раствором Люголя 1-2 минуты, раствор сливается.

3) Наносится 96% этанол 45 секунд,

4) Препарат тщательно промывается водой

5) Окрашиваем фуксином Пфейффера 2 минуты.

6) Вновь промываем водой, подсушиваем фильтровальной бумагой и микроскопируем.

Микрокартина: тонкие палочки, имеющие закруглённые концы, подвижные, встречаются клетки со жгутиками, споры, которые располагаются терминально и имеют вид барабанных палочек, грамположительные.

Микрокартина идеально подходит под описание столбнячной палочки в научных литературных источниках.

Далее необходимо выполнить посев в среды Кита-Тароцци + 0,5% глюкозы, МПБ, МПА. Имеют место некоторые особенности при культивировании анаэробов:

- создание условий безкислородной среды;

- применение специализированной питательной жидкой среды мясо-пептонно-печёночного бульона (среда Кита-Тароцци);

- в мясо-пептонном полужидком агаре - посев осуществляют вглубь среды.

Техника посева:

1. Посевы из проб нативного материала необходимо проводить пастеровской пипеткой, из бактериальной массы - бактериальной петлёй.

2. Посевы необходимо делать над пламенем горелки.

3. На засеваемые пробирки, чашки Петри, колбы пишется номер экспертизы и дата посева.

Техника посева в жидкие питательные среды:

1. Пробирку с анализируемым материалом или бактериальной культурой и пробирки с питательной средой держат в левой руке, как при приготовлении мазка.

2. Бактериальную петлю необходимо прокалить над пламенем горелки, снять пробки от пробирок (в правой руке и пробка, и петля).

3. Над пламенем горелки петлю необходимо внести в пробирку с материалом, берется одна капля и переносится в пробирку с питательной средой.

4. Пробирки необходимо закрыть пробками, обжечь их над пламенем горелки.

Техника посева на плотные питательные среды:

1. Пробирку с агаром и культурой берут в левую руку, держат скошенной поверхностью МПА кверху, пробками в сторону пламени горелки.

2. Петлю необходимо прокалить, снять пробки (в правой руке пробка и петля)

3. Около пламени петлю необходимо внести в пробирку, взять одну каплю, перенести её в пробирку со стерильной средой. Петлю опустить до дна пробирки, опуская в конденсационную жидкость и засеять зигзагом.

4. Закрыть пробкой над пламенем горелки.

5. Петлю необходимо обжечь.

Техника приготовления среды Кита-Тароцци:

для её основы необходимо взять печёночную воду, которую необходимо приготовить путём кипячения в воде мельчайших кусочков говяжьей печени в соотношении 1:1. Печёночную воду необходимо смешать с МПБ, в соотношении 1:2. Далее смесь необходимо прокипятить, установив необходимый уровень рН и разлить её в пробирки по 10 мл. В пробирки необходимо добавить кусочки варёной печени, после чего внести по 2 мл вазелинового масла, автоклавировав раствор при 0,5 атм в течение 20 минут.

Перед употреблением пробирки со средой необходимо произвести кипячение на водяной бане, после чего охладить, и только после этого провести посев по указанной выше технологии, поставив в термостат при 37-38єС. Через 48-72 часа необходимо произвести учёт результатов [14]^.

Учёт полученных результатов

На среде Китта-Тароцци при заданных ранее условиях образуется интенсивная муть с незначительной степенью газообразования. Через 48 часов наступает осветление бульона, а на дне пробирки формируется осадок.

Культура издает своеобразный запах, напоминающий жжёный рог. На МПА видны полупрозрачные колонии с отростками.

Далее необходимо сделать мазок и окрасить его по Грамму.

Техника выполнения представлена ранее.

Микрокартина: тонкие палочки, имеющие закруглённые концы, подвижные, можно встретить клетки со жгутиками, споры, которые располагаются терминально и имеют вид барабанных палочек, граммположительные.

После чего можно сделать предварительное заключение - столбнячная палочка.

Следующим этапом полученную культуру необходимо пересеять на среду Кита-Тароцци и на глюкозо-кровяной агар Цейслера, чтобы получить чистую культуру. Подобную процедуру необходимо осуществить по методу пластического посева.

Сущность метода: каждая колония развивается в результате размножения одной микробной клетки, поэтому посев одной изолированной колонии в пробирку с питательной средой может позволить выделить чистую культуру.

Техника исполнения:

1. Необходимо взять 4-5 стерильных чашек Петри с МПА, чашку Петри делим на четыре-пять ровных участка (карандашом по дну), участки пронумеровываем.

2. Каплю анализируемого материала берем петлей, наносим на поверхность агара (участок 1) и равномерным образом распределяем её, не заходя за пределы участка. Этой же петлёй не обжигая её, засеваем остальные участки.

3. Далее необходимо поместить вверх дном в термостат на 48 часов.

2.3 Проведение анализа полученных микробиологических результатов

В последнем участке чашки на поверхности МПА вырастают изолированные колонии бактерий. На глюкозо-кровяном агаре в безкислородных условиях вырастают беловато-серые нежные колонии с отростками или в виде капельки росы. Колонии окружены слабой зоной гемолиза, при комнатной температуре зона гемолиза увеличивается.

Далее необходимо сделать мазок, окрасив по Грамму (методика описана ранее)

Микрокартина: тонкие палочки, имеющие закруглённые концы, подвижные, встречается множество клеток со жгутиками, споры, которые располагаются терминально, имеющие вид барабанных палочек, Гр+.

Реакция нейтрализации

Обнаружение токсинов является одним из экспрессных способов лабораторной диагностики клостридиозов, ибо для этого не требуется высева материалов и культивирования на питательных средах. Токсины клостридий смертельны, что достоверно можно установить только по летальному эффекту и его нейтрализации на лабораторных животных (обычно белые беспородные мыши) в реакции биологической нейтрализации (РБН) с соответствующими антитоксическими сыворотками.

Экстракт исследуемого материала фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр (тальковый фильтр использовать нельзя, т.к. он адсорбирует на себе токсин). К 1 мл фильтрата или культуральной жидкости добавляют 0,5 мл противостолбнячной сыворотки, содержащей 200АЕ.

Для контроля такое же количество исследуемого материала смешивают с 0,5 мл нормальной сыворотки.

Смеси выдерживают 40 мин при комнатной температуре и в количестве 0,75 мл вводят внутримышечно в бедро задней лапки двум опытным и двум контрольным мышам.

Если исследование проводится на морских свинках, то количество вводимого материала увеличиваться до 1,5-3 мл.

Наблюдение за животными: примерно через 48 часов после заражения у мышей начали появляться некоторые симптомы: взъерошивание шерсти, ригидность хвоста, задних конечностей. Звуковой раздражитель, (например, постукивание по клетке) вызывает напряжение хвоста, в результате чего он поднимается вверх (столбняк I степени).

Затем наступает паралич конечности, в которую вводился материал (столбняк II степени).

Следующими параличу подвергаются конечности и часть мышц тела (III степень).

IV степень столбняка характеризуется параличом всех мышц конечностей, искривлением позвоночника.

У животных, получивших токсин с противостолбнячной сывороткой, симптомы столбняка отсутствуют. Это доказывает, что в исследуемом материале имеется столбнячный токсин. При обнаружении в посеве грамположительных палочек с круглыми терминально расположенными спорами и столбнячного токсина делают заключение о наличии в исследуемом материале возбудителя столбняка.

Для нейтрализации токсина используют антитоксическую сыворотку. Подкожное введение мышам фильтрата исследуемого материала при наличии токсина приводит к спазму мышц и искривлению тела в сторону места введения токсина.

Микробиологические исследования полностью должны подтвердить клинический диагноз.

Результаты микроскопических исследований и постановка биопробы дадут право сделать итоговое заключение и выставить окончательный диагноз.

2.4 Сопоставление результатов и обсуждение

Результаты анализа статистических данных об эпидемиологии столбняка и современных методах исследования этого заболевания согласуются с результатами, полученными Всемирной организацией здравоохранения и другими авторами, такими как Дэвид М. Ливерморе, Франциско Хавьер де ля Вега Гарсиа, Капустин А.В., Лаишевцев А.И., Гулюкин А.И., Шемельков Е.В., Скляров О.Д. [15]

Было установлено, что современные лабораторные и клинические методы исследования имеют важное значение для контроля столбняка, что согласуется с исследованиями Колесникова Ю.Н., Пименов Н.В., и многими другими.

Несмотря на свою длительность и необходимость специального оборудования, культуральное исследование остается ключевым инструментом для определения антибиотикочувствительности бактерий, что соответствует результатам исследований, проведенных Даниэла Яблонко, Мелани Бергман.

Кроме того, сравнение различных методов диагностики столбняка подтвердило их преимущества и ограничения, что согласуется со многими исследованиями, включая работу Александра М. Оверхольта, Майкла Р. Малви и Уильяма Б. Рэя.

2.5 Документы, регламентирующие ход исследований

1. МУ 3.1.2436-09. 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Эпидемиологический надзор за столбняком. Методические указания" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20.01.2009)

2. Лабораторная диагностика столбняка, методические указания МУ4.2.01-02, г. Ростов-на-Дону, 2002г - 9с.

3. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека главный государственный санитарный врач Российской Федерации постановление от 22 октября 2013 г. n 59 об утверждении санитарно-эпидемиологических правил сп 3.1.2.3113-13 "Профилактика столбняка"

4. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 28.01.2021 N 4 (ред. от 25.05.2022) "Об утверждении санитарных правил и норм СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней" (вместе с "СанПиН 3.3686-21. Санитарные правила и нормы...") (Зарегистрировано в Минюсте России 15.02.2021 N 62500)

5. Правила работы и охраны труда в ветеринарных лабораториях. (Утверждены Министерством сельского хозяйства СССР 14 января1975г.Согласованы с ЦК профсоюза рабочих и служащих сельского хозяйства и заготовки 10 января 1975г.)

6. Правила взятия патологического материала, крови, кормов и пересылки их для лабораторного исследования. (Утверждены Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 24 июня 1971г., взамен Правил, утверждённых 4 июля 1958г.)

7. Методические указания по проведению обязательного минимума исследований в ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных. (Утверждены Главным управлением ветеринарии Министерства с/х СССР 24 июня 1971г.)



Заключение

Возбудитель столбняка Clostridium tetani -- грамположительные палочки, анаэроб, развивается в глубоких инфицированных ранах в ассоциации с гноеродными микроорганизмами, не проявляет протеолитических свойств.

Микробиологические исследования полностью подтвердили клинический диагноз, выставленный ветеринарный врачом.

Для бактериологического исследования был взят материал из воспалительных очагов печени и селезенки, а также кровь, в культурах был выявлен столбнячный токсин. Проведен опыт на белых мышах, у которых развивается характерная клиническая картина. Обнаружение столбнячного токсина при наличии грамположительных палочек с круглыми терминальными спорами позволило сделать заключение, что в исследуемом материале присутствует С. tetani.

Столбняк является неконтагиозной инфекцией. Механизм заражения раневой -- повреждения покровных тканей, загрязняемых заражёнными почвой или пылью.

Проведено бактериологическое исследование, состоящее из:

1) выделения чистой культуры возбудителя путем культивирования на питательные среды:

- Кита-Тароцци - интенсивное равномерное помутнение с незначительным газообразованием, затем рыхлый осадок, запах жженого рога;

- ГКА - нежные беловато-серые колонии с отростками и приподнятым центром.

2) изучение ее морфологических свойств по изготовленному из культуры и окрашенного по Грамму мазку:

Микрокартина: тонкие палочки с закруглёнными концами, подвижны, встречаются клетки со жгутиками, споры, располагающиеся терминально - вид барабанной палочки, грамположительные.

3) определения патогенности выделенных культур путем заражения выделенной микробной культурой белых мышей: гибель белых мышей в течение 2 дней.

4) Реакция нейтрализации--обнаружен токсин Clostridium tetani

Вывод: обнаружен возбудитель столбняка.

Диагностика столбняка играет важную роль в своевременном начале лечения и предотвращении осложнений этой опасной инфекционной болезни. Современные методы, такие как ПЦР и иммунологические тесты, обладают высокой чувствительностью и специфичностью, что делает их предпочитаемыми в сравнении с классическим культуральным выращиванием.

...