Вплив стрептозотоциніндукованого діабету на стан клітин Панета мишей і щурів

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Запорізький національний університет, Україна

Кафедра фізіології, імунології і біохімії з курсом цивільного захисту та медицини

Вплив стрептозотоциніндукованого діабету на стан клітин Панета мишей і щурів

Григорова Н.В., к.б.н., доцент

Анотація

У мишей і щурів зі стрептозотоциніндукованим діабетом визначали вміст цинку та секреторного матеріалу в клітинах Панета за допомогою розробленої в умовах нашої лабораторії цитохімічної реакції 8-(п-толуолсульфоніламіно)-хіноліну (8-ТСХ) і модифікованої цитохімічної реакції флоксину. Був встановлений та підтверджений проведеним кореляційним аналізом той факт, що ступінь вираженості дефіциту цинку в панетовських клітинах тварин відповідає ступеню вираженості в них секреторної недостатності. Позитивна кореляція змін вмісту металу та секрету в клітинах Панета діабетичних тварин вказує на наявність між дослідженими компонентами функціонального зв'язку.

Ключові слова: цинк, секреторний матеріал, 8-ТСХ, флоксин, стрептозотоцин, цукровий діабет.

Розвиток цукрової хвороби в експерименті викликають уведенням тваринам діабетогенних комплексоутворюючих сполук, які здібні утворювати в процесі хелації з цинком панкреатичних клітин в 4- або 5-членні кільця. Стрептозотоцин, який не належить до групи типових комплексоутворюючих агентів, представляє інтерес в іншому відношенні - він є антибіотиком. Він також володіє вираженими діабетогенними властивостями [1 -3].

При дослідженні морфології острівцевого апарату в різні періоди після внутрішньовенного введення стрептозотоцину було показано, що перші зміни в в-клітинах з'являються через 1 год. Протягом перших 2 год дегенеративні зміни відсутні або виявляються лише в окремих в-клітинах. У клітинних ядрах спостерігається агломерація хроматину; деякі ядра стають гомогенними, розміри їх збільшуються. Потім (впродовж 18-24 год) настає пікноз ядер з наступним каріорексисом. Ультраструктурні зміни в-клітин через 2-4 год після введення стрептозотоцину полягають у проліферації ергастоплазми, розширенні цистерн гранулярного ендоплазматичного ретикулума, появі інтрамітохондріальних агрегатів. Але після цього починається розпад мембранних структур і загибель клітин. Поширений некроз в-клітин чітко прослідковується вже через 7 год після введення стрептозотоцину. Дегенерації зазнають і a-клітини. Через 10 діб зменшується кількість і розміри острівців, кількість секреторних гранул у в-клітинах. Протягом 1-4 тижнів з'являються ознаки регенерації острівцевої тканини. Зміни, що виявляються в підшлунковій залозі через 6 міс після введення стрептозотоцину, подібні до змін при алоксановому діабеті. До ускладнень стрептозотоциніндукованого діабету належать ураження очей, нирок і нервової системи [4, 5].

Механізм дії стрептозотоцину на клітини в острівців не повністю з'ясований. Відомо, що період напіврозпаду стрептозотоцину в сироватці крові після його внутрішньовенного введення дорівнюється 5 хв. Через 2 год його рівень зазвичай не визначається. Зміни в підшлунковій залозі, що викликані внутрішньовенним введенням стрептозотоцину, протягом перших 2 год зворотні. Пряма дія стрептозотоцину здійснюється швидко. Пусковим ефектом при цьому може бути тимчасова інактивація або деструкція мембрани клітин р. Стрептозотоцин проявляє свій цитотоксичний ефект через порушення обміну піридинових нуклеотидів. Так, стрептозотоцин знижає вміст НАД у печінці мишей і в ізольованих острівцях підшлункової залози. Дані ефекти стрептозотоцину пов'язані з наявністю в його молекулі 1 -метил-1-нітрозосечовини. Є відомості про те, що глюкозна частина стрептозотоцину відіграє роль носія для проникнення через мембрану клітин р. Отримані також відомості про те, що через 90 хв після застосування стрептозотоцину або його структурного фрагмента - метилнітрозосечовини - у сегментах підшлункової залози настає деполяризація (перші гістологічні зміни в клітинах р з'являються не раніше, ніж через 2 год) і що нікотинамід усуває цей ефект. Далі під дією стрептозотоцину спостерігаються зміни ультраструктури клітинної мембрани р - клітини з наступним їх некрозом. Є дані про те, що стрептозотоцин пригнічує вмикання Н-лейцину в проінсулін та інсулін, знижує енергетичний обмін в клітинах р, секрецію інсуліну і викликає в підсумку деструкцію клітин р. Крім того, є підстави вважати, що стрептозотоцин проявляє свій цитотоксичний ефект, діючи як оксидант, викликаючи утворення вільних радикалів у панкреатичних мікросомах [3, 6, 7].

Встановлено, що більша частина цинку, що міститься в панкреатичних острівцях, знаходиться в секреторних гранулах клітин р. Припускають, що конденсовані молекули інсуліну у вигляді гексамерів знаходяться у комплексі з іонами цинку: два іони цього металу зв'язують шість молекул інсуліну [8-11]. Було продемонстровано розвиток дефіциту цинку на тлі інсулінової недостатності в панкреатичних острівцях тварин зі стрептозотоциніндукованим діабетом [1 2].

Іони цинку присутні також у секреторних гранулах клітин Панета [13]. Ймовірно, цей метал не тільки утворює комплекс з секреторним матеріалом клітин тонкого кишечнику, але й бере участь у його депонуванні, подібно панкреатичних острівців. Враховуючи вище викладене, представляють інтерес дослідження вмісту цинку та секреторного матеріалу в панетовських клітинах тварин при моделюванні цукрового діабету, викликаного уведенням стрептозотоцину. Кількість металу та секрету в клітинах Панета раніш не визначалась через брак досконалих методів їх цитохімічного виявлення. Розробка в нашій лабораторії реакцій 8-(п-толуолсульфоніламіно)-хіноліну (8-ТСХ) і модифікації флоксинової реакції дозволила провести такі дослідження. цинк секрет клітина панета діабетичний миша щур

Мета нашої роботи - визначити вміст цинку та секреторного матеріалу в клітинах Панета у мишей і щурів при стрептозотоциніндукованому діабеті.

Матеріалом досліджень слугували зрізи тонкої кишки 26 мишей і 30 щурів. Тваринам стрептозотоцин уводили внутрішньоочеревинно в дозі 200 мг/кг у вигляді 2% водного розчину. Для приготування зрізів у забитих тварин через 5 діб після ін'єкції діабетогенної речовини брали шматочки тонкої кишки. Дослідження з використанням лабораторних тварин проводились згідно з вимогами статті 26 Закону України «Про захист тварин від жорстокого поводження», «Європейської конвенції про захист хребетних тварин» (Страсбург, 1986) та принципів біоетики.

Для цитохімічного визначення цинку шматочки тонкої кишки фіксували в холодному (+4°С) ацетоні. Після цього шматочки органу доводили до парафіну та заливали в нього. Парафінові зрізи 10 мкм завтовшки обробляли двома ксилолами та спиртами. Депарафіновані зрізи забарвлювали 0,01% ацетоновим розчином 8-ТСХ. Після цього промивали дистильованою водою, замикали в гліцерин та розглядали під люмінесцентним мікроскопом (світлофільтри ФС-1, ЖС-18). На препаратах жовто-зелена люмінесценція (показник вмісту цинку в клітинах) визначалась у клітинах Панета.

Для цитохімічного визначення секреторного матеріалу шматочки тонкої кишки фіксували в формаліні протягом 24 год, потім зневоднювали, обробляли ксилолами, сумішшю ксилолу та парафіну, витримували в рідких парафінах та заливали в парафін. Парафінові зрізи 5-10 мкм завтовшки обробляли ксилолами, спиртами, промивали дистильованою водою та забарвлювали 0,5% розчином флоксину. Після забарвлення зрізи промивали дистильованою водою та замикали в гліцерин-желатин. На препаратах у цитоплазмі клітин Панета тонкої кишки визначали червоні гранули. Кількість цих гранул - показник вмісту в клітинах секреторного матеріалу.

За трибальною системою, запропонованою В.В. Соколовським, Ф. Хейхоу та Д. Квагліно, оцінювали інтенсивність цитохімічної реакції флоксину [14, 15]. Інтенсивність цитохімічних реакцій 8-ТСХ визначали за допомогою мікрофлуориметра. Вміст цинку оцінювали в мкг/г. Одержані результати статистично опрацьовані за t-критерієм Стьюдента за допомогою програми Statistica, 6.0. Для оцінки ступеня зв'язку між змінами досліджених показників обчислювали коефіцієнт кореляції Пірсона (r).

У клітинах Панета мишей контрольної групи вміст цинку складав 41±2,9 мкг/г, а секреторного матеріалу - 1,2±0,08 ум.од. При цьому кількість гранул 8-ТСХ дорівнювала 52±2,4, а флоксинофільних гранул - 55±2,6. Показник кореляції змін вмісту цинку та інтенсивності реакції флоксину в клітинах (п) становить +0,48 (Р<0,05), а кількості гранул 8-ТСХ і флоксинофільних гранул (Г2) - +0,91 (Р<0,001).

Після ін'єкції мишам стрептозотоцину у панетовських клітинах спостерігалося зниження вмісту цинку на 39% (25±2,1мкг/г; Р <0,001), а вмісту секреторного матеріалу - на 33% (0,8±0,04 ум.од.; Р<0,001). Скорочення у досліджених клітинах кількості гранул 8-ТСХ дорівнювало 23% (40±2,1; Р <0,001), а флоксинофільних гранул - 17% (43±2,2; Р<0,01). Встановлена позитивна кореляція змін вмісту цинку та секреторного матеріалу в клітинах мишей зі стрептозотоциніндукованим діабетом: п = +0,51 (Р<0,05); Г2 = +0,85 (Р<0,001). Висока достовірність коефіцієнтів кореляції при значній їх щільності вказує на існування певного зв'язку між змінами вмісту внутрішньоклітинних металу та секрету в клітинах тонкої кишки діабетичних тварин.

У клітинах Панета щурів, які складали контрольну групу, вміст цинку дорівнював 92±5,9 мкг/г, а секреторного матеріалу - 1,7±0,12 ум.од. При цьому кількість гранул 8-ТСХ відповідала 55±2,5, а флоксинофільних гранул - 57±3,1. Показник кореляції змін вмісту цинку та інтенсивності реакції флоксину в клітинах (гі) становить +0,47 (Р<0,05), а кількості гранул 8-ТСХ і флоксинофільних гранул (г2) - +0,92 (Р<0,001).

Уведення стрептозотоцину щурам викликало в панетовських клітинах зниження вмісту цинку на 36% (50±3,4 мкг/г; Р<0,001), а вмісту секреторного матеріалу - на 35% (1,1 ±0,08 ум.од.; Р<0,001). Скорочення у досліджених клітинах кількості гранул 8-ТСХ дорівнювало 22% (43±2,0; Р<0,001), а флоксинофільних гранул - 21 % (45±2,4; Р<0,01). Односпрямованість змін вмісту цих компонентів при стрептозотоциніндукованому діабеті підтверджується наявністю позитивних вірогідних коефіцієнтів кореляції: гі = +0,42 (Р<0,05); Г2 = +0,89 (Р<0,001).

Висновки

У мишей і щурів зі стрептозотоциніндукованим діабетом розвивався дефіцит цинку та секреторного матеріалу в клітинах Панета. У всіх випадках встановлена позитивна кореляція змін вмісту цинку та секрету в панетовських клітинах, що свідчить на користь існування функціонального зв'язку між цими компонентами.

Список використаних джерел

1. Rees, D.A. & Alcolado, J.C. (2005). Animal models of diabetes mellitus. Diabet. Med., (14), 359-370.

2. Herrath, M. & Nepom, G.T. (2009). Animal models of human type 1 diabetes. Nat. Immunol., (10), 129-132.

3. Buschard K. (2011). What causes type 1 diabetes? Lessons from animal models. APMIS, (119), 1-9.

4. Mythili, M.D., Vyas, R. & Akila, G. (2004). Effect of streptozotocin on the ultrastucture of rat pancreatic islets. Microsc. Res.Tech., (63), 274-281.

5. Takeola, Y., Fujita, Y. & Honjo, J. (2011). Reduction of both beta cell death and alpha cell proliferation by dipeptidyl peptidase-4 inhibition in a streptozotocin-induced model of diabetes in mice. Diabetologia, (12), 234-237.

6. Sindhu, R.K., Koo, Ja-Ryung & Roberts, C.K. (2004). Dysregulation of hepatic superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxi-dase in diabetes: response to insulin and antioxidant therapies. Clin. And Exp. Hypertens, (26), 43-53.

7. Lenzen S. (2008). The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes. Diabetologia, (51), 216-226.

8. Kristiansen, L.H., Rungby, J. & Sondergaard, L.G. (2001). Autometallography allows ultrastructural monitoring of zinc in the endocrine pancreas. Histochem. Cell Biol., (115), 125-129.

9. Dehghany, J., Hoboth, P. & Ivanova, A. (2015). A spatial model of insuline-granule dynamics in Pancreatic |3-cells. Traffic, (8), 797-813.

10. Yang, Y.Li. (2014). Zinc and insulin in pancreatic beta-cells. Endocrine, (45), 178-189.

11. Chimienti, F. (2013). Zinc pancreatic islet cell function and diabetes: new insights into an old story. Nutr. Res. Rev., (26), 1-11.

12. Григорова, Н.В. (2021). Стан панкреатичних клітин в у щурів при стрептозотоциніндукованому діабеті різного ступеня тяжкості. Grail of science, (8), 126-129.

13. Haase, H., & Maret W. (2010). Cellular and molecular Biology of metals. CRCPress., (10), 181-212.

14. Соколовский, В.В. (1971). Гистохимические исследования в токсикологии. Ленинград: Медицина.

15. Хейхоу, Ф. & Кваглино, Д. (1983). Гематологическая цитохимия. Москва: Медицина.

Размещено на Allbest.Ru