Перспективи використання гібридів Pelargonium Sidoides

Размещено на http://www.allbest.ru/

Перспективи використання гібридів Pelargonium Sidoides

Н. В. Нужина, Л. М. БАЦМАНОВА, |А. М. КОСЯН|, В. М. МАЛЯРЕНКО, М. М. ГАЙДАРЖИ

Мета. Вид Pelargonium sidoides DC. є цінною лікарською рослиною, нераціональне використання якої в природі може привести до отримання цим видом статусу рідкісності найближчим часом. Отримання гібридів P. sidoides з вищим вмістом фенольних сполук дозволить розширити спектр рослин, які використовуються у фармацевтичній галузі та зменшити навантаження на природні ресурси. Метою було вдосконалити методи вирощування в тепличних умовах P. sidoides та отримані гібриди цього виду та дослідити їх на вміст різних фенольних сполук у вегетативних органах. Методи. Світлова мікроскопія, спектрофотометрія (визначення загального вмісту фенолів та флавоноїдів, вмісту фенольних антиоксидантів та фенолкарбонових кислот). Результати. Анатомічна будова листків та коренів гібридів та виду була подібною. Встановлено, що вирощування P. sidoides та його гібридів в умовах теплиці з високими літніми температурами підвищує синтез та накопичення речовин фенольної природи в усіх вегетативних органах. Важливо, що листки показали також високі результати за вмістом флавоноїдів та фенолкарбонових кислот, тому доцільно використовувати їх також як сировину для фармакологічної промисловості. Висновки. Було вдосконалено методи вирощування досліджуваних рослин, Встановлено, що використання гібридних рослин для фармакологічної промисловості з метою отримання флавоноїдів більш ефективне, порівняно з P. sidoides, але менш ефективне при отриманні інших фенольних сполук. Виявлена відмінність у локалізації та кількості вторинних метаболітів вказує на необхідність детального вивчення інших речовин фенольної природи у листках та коренях цих пеларгоній.

Ключові слова: феноли, флавоноїди, анатомічна будова, Pelargonium sidoides * reniforme.

THE PERSPECTIVES OF USING PELARGONIUM SIDOIDES HYBRIDS

N. V. Nuzhyna, L. M. Batsmanova, А. М. Kosian, V. M. Maliarenko, M. M. Gaidarzhy флавоноїд анатомічна будова pelargonium sidoides

Taras Shevchenko Kyiv National University Ukraine

Purpose. The Pelargonium sidoides DC. is a valuable medicinal plant, and its irrational use in nature may lead to the species receiving rare status in the future. Obtaining P. sidoides hybrids with a higher content of phenolic compounds will expand the range of plants used in the pharmaceutical industry and reduce the pressure on natural resources. The purpose was to improve methods of growing P. sidoides in greenhouse conditions, obtain hybrids of this species, and research them for the content of various phenolic compounds in vegetative organs. Methods. Light microscopy, spectrophotometry (determination of the total content of phenols and flavonoids, the content of phenolic antioxidants and phenolic acids). Results. The anatomical structure of the leaves and roots of the obtained hybrids did not differ significantly from those of the pure species. It has been found that growing P. sidoides and its hybrids in greenhouse conditions with high summer temperatures increase the synthesis and accumulation of phenolic substances in all vegetative organs. It is important to emphasize that high levels of flavonoids and phenol carboxylic acid have been detected in the leaves, so it is advisable to use them as raw materials for the pharmaceutical industry also. Conclusion. The cultivation methods of the studied plants have been improved. The use of hybrid plants for obtaining flavonoids is more effective for the pharmaceutical industry but less practical in getting other phenolic compounds compared to P. si- doides have been found. The revealed difference in the localization and amount of secondary metabolites indicates the need for a detailed study of other substances of a phenolic nature in the leaves and roots of these pelargoniums.

Keywords: phenols, flavonoids, anatomical structure, Pelargonium sidoides x reniforme.

Вступ

Вид Pelargonium sidoides DC. належить до роду Pelargonium, родини Geraniaceae Juss. є багаторічним геофітом, що переважно зустрічається у Східно- Капській провінції Південної Африки та нагір'ї Лесото. Рослина адаптована до широкого діапазону висот, від рівня моря до високогір'я. Лікарські властивості виду цінуються на місцевому та міжнародному рівнях, рослина є сировиною для отримання ефірної геранієвої олії. (Maree, Viljoen, 2012; Moyo, Van Staden, 2014; Kayser et al., 1998). У традиційній ветеринарії відвари кореня P. sidoides використовують для лікування шлунково-кишкових розладів, а відваром з листя обробляють рани (Moyo, Van Staden, 2014). Також коріння використовується для лікування захворювань дихальних шляхів: гострого бронхіту, астми, синуситу і тонзилофарингіту (Moyo, Van Staden, 2014; Kamin et al., 2010а; Kamin et al., 2010b; Kamin et al., 2012).

Екстракт, отриманий з коріння P. sidoides, складається в основному з оліго- і полімерних проантоціанідинів, які базуються на галокатехінових та епігалокатехінових фрагментах (Theisen, Muller, 2012). Фармакологічна ефективність P. sidoides частково пояснюється біологічною активністю кумаринів (7-гідрокси-5, 6-ди-метоксикумарин; 6,8-дигідрокси-5,7 диметоксикумарин, 5,6,7-триметоксикумарин) (Iacovelli et al., 2022), похідних галової кислоти, флавоноїдів (Kolodziej, 2007). Також ключовими метаболітами, які вважаються активними в екстракті кореня рослини, є гідролізовані таніни, катехіни, метилгалат, включаючи деякі незвичайні О-галоїл-С-глюкозил флавони, скополетин.

Експериментально підтверджено противірусну дію спиртового екстракту, який перешкоджає in vitro реплікації різних респіраторних вірусів, включаючи коронавіруси людини (lacovelli et al., 2022).

Фенолокислоти в екстракті P. sidoides представлені галовою кислотою і її метиловим ефіром. Також є дані, що галова кислота може запобігти утворенню аденокарциноми(Maidannyk, 2016).

Завдяки успішним результатам клінічних випробувань фітопрепарату, отриманого з кореня P. sidoides, зріс попит на ці рослини, що супроводжується незаконним вилученням у великих кількостях дикорослих рослин з природних місцезростань (Lewu et al., 2006, 2007; Wynberg et al., 2012). Така ситуація негативно впливає на відтворюваність виду, а отже і на формування ресурсу сировини.

З огляду на інтенсивне вилучення виду з природних умов, сформувалась гостра необхідність збереження виду P. sidoides, який за чотири роки перейшов до категорії «найменшого занепокоєння» і має високі шанси переходу у вищі категорії (Gaidarzhy et al., 2019).

У себе на батьківщині P. sidoides вже вирощується промисловим способом. Але, щоб задовольнити постійно зростаючий попит у міжнародній торгівлі на рослинну сировину, постає необхідність культивувати P. sidoides у промислових масштабах в інших районах світу (Bryda, Stadnytska, 2021; Moyo, Van Staden, 2014) та продовжувати досліджувати інші види на вміст сполук, які мають подібні фармакологічні властивості. В одних із останніх досліджень було показано високу відтворювальну здатність рослин P. sidoides у тепличних умовах (Gaidarzhy et al., 2019). Такий підхід дозволить розширити спектр рослин, які використовуються у фармацевтичній і інших галузях і зменшити навантаження на природні ресурси. Метою даної роботи було дослідити батьківський вид P. sidoides та отримані гібриди цього виду на вміст різних фенольних сполук у вегетативних органах.

Матеріали і методи

Рослини Pelargonium sidoides DC. та Pelargonium reniforme Curt., які відносяться до секції Reniformia та поширені в ПАР та Лесото. P. sidoides має широкий ареал, в той час як ареал P. reniforme обмежений тільки провінцією Східний Кап (ПАР) (Dreyer, Marais, 2000). За морфологічними ознаками обидва види також дуже схожі і легко гібридизуються між собою. Рослини обох видів мають багатолисткову розетку сизо-зелених, овально-серцеподібних з численними трихомами листків, на довгих черешках. Розміри листків P. sidoides в умовах культури коливаються від 5,5 до 7,5 см, а P. reniforme -- 2,5-4,5 см завширшки. Квітки на довгому квітконосі зібрані у сплощений зонтик, зигоморфні, у P. sidoides -- пелюстки вузькі, темно-бордового кольору, у P. reniforme -- більш широкі, рожевого кольору, з маловираже- ним малюнком на двох верхніх пелюстках. Останній вид з віком утворює невеличке стебло.

Гібридні рослини за зовнішніми морфологічними ознаками ближче до P. reniforme, але форма, розмір пелюсток та колір квітки варіює від світло-бордового до рожево-червоного (Maree, Viljoen, 2012) (рис. 1). В роботі були використані як рослини P. sidoides, так і гібрид, отриманий від схрещування обох видів, з квітками світло-бордового кольору (Pelargonium hybridum = P. sidoides х P. reniforme).

Рис. 1. Рослини Pelargonium sidoides (зліва) та отриманий Pelargonium hybridum (справа).

Рослини вирощували в двох теплицях із різними температурними умовами: перша теплиця з температурою 15 °С взимку та 25 °С влітку, друга теплиця з температурою 15 °С взимку та 37 °С влітку.

Для анатомічних досліджень брали середню частину листкової пластинки та кореня півторарічних рослин P. sidoides та отриманого з нього гібриду, які вирощували в захищеному ґрунті. Зразки фіксували фіксатором ФАА (формальдегід, ацетат, альдегід). Заливали в желатин за стандартною методикою (Romeis, 1948) та за допомогою заморожуючого мікротома виготовляли поперечні зрізи товщиною 1520 мкм. Зрізи фарбували сафраніном. Мікроскопічні виміри проводили за допомогою мікроскопа XSP-146TR та програми Image J.

Для біохімічного аналізу використовували листки, стебла та корені батьківських рослин P. sidoides та отриманих гібридів.

Фенольні сполуки вилучали 96 %-ним етанолом із замороженого рідким азотом та подрібненого рослинного матеріалу протягом 45 хв за +45 °С (Zagoskina et al., 2005). Гомогенати центрифугували (13000 об/хв, 10 хв) і надоса- дову рідину використовували для спектрофотометричного визначення різних класів фенольних сполук.

Загальний уміст фенольних сполук у листках, стеблі, корені визначали спектрофотометричним методом за допомогою реактиву Фолі- на-Чекольтеу (Sibhatullina et al., 2011). Оптичну густину реакційної суміші визначали за довжини хвилі 720 нм. Калібрувальний графік будували за галовою кислотою.

Загальний вміст флавоноїдів у перерахунку на рутин та абсолютну масу сухої речовини визначали за методом Тринєєвої та співавторів (Trineeva et al., 2014) за Л = 410 нм і виражали у відсотках.

Вміст фенолкарбонових кислот у рослинній сировині визначали спектрофотометрично за довжини хвилі 327 нм (Abramova et al., 2011). Кількість суми фенолкарбонових кислот (Х) у перерахунку на галову кислоту розраховували за формулою:

Х = D * V1 * V3/(m-E-V2);

D -- оптична густина дослідного розчину;

V1 -- загальний об'єм дослідного розчину (А) (мл);

V2 -- аліквота розчину А (мл);

V3 -- об'єм дослідного розчину (Б), взятий для спектрофотометрії (мл);

m -- наважка рослинної сировини (г);

E = 531 питомий показник поглинання галової кислоти за Л = 327 нм.

Концентрацію фенольних антиоксидантів в екстрактах визначали спектрофотометрично із

Результати та обговорення

Проведене анатомічне порівняння

P. sidoides та P. hybridum показало, що будова кореня та листка P. sidoides та його гібрида подібна (будова P. sidoides була детально описана нами раніше (Gaidarzhy et al., 2019)). Півторарічні корені вкриті потужною малосуберині- зованою перидермою (рис. 2А), в коровій та серцевинній паренхімі спостерігається велике скупчення крохмалю та ідіобластів. Провідна система колатеральна пучкового типу зі скле- ренхіматизованою первинною флоемою.

Рис. 2. Анатомічна будова 1,5 річного Pelargonium hybridum, bar = 100 мкм: А) корова частина кореня: 1 -- перидерма, 2 -- склеренхіма; Б) поперечний переріз листкової пластинки: 1 -- залозисті трихоми, 2 -- незалозисті трихоми, 3 -- адаксіальна епідерма, 4 -- стовпчастий мезофіл, 5 -- абаксіальна епідерма, 6 -- губчастий мезофіл.

Листки батьківського виду та отриманого гібриду мали теж подібну анатомічну будову: амфістоматичний, дорсовентральний тип та анізоцитні продихи. Одношаровий епідерміс з обох боків вкритий невеликими залозками з двоклітинною ніжкою і одноклітинною голівкою та незалозистими простими багатоклітинними гачкуватими трихомами (рис. 2Б). Ефірні олії присутні не лише в залозистих трихомах, а і в мезофілі у вигляді включень. Провідна система представлена колатеральними провідними пучками. Разом з цим, спостерігаються певні мор- фометричні відмінності. Зокрема, у гібрида тонша листкова пластинка 118,4 ± 4,3 мкм проти 168,1 ± 5,2 мкм у P. sidoides. Відповідно товщина стовпчастого та губчастого мезофілів, а також епідермісу також менша у гібрида. Наприклад, товщина адаксіального епідермісу гібрида становить 17,2 ± 0,68 мкм, абаксіального --6,46 ± 0,39 мкм, порівняно з відповідними значеннями у P. sidoides (19,49 ± 0,58 мкм і 8,00 ± 0,37 мкм). Більш тонкий епідерміс компенсується густішим розміщенням трихом на поверхні листка гібрида. Довжина трихом у гібрида також більша: на верхній поверхні листка гібрида наявні трихоми довжиною до 145 мкм, на нижній -- до 390 мкм, порівняно з відповідними значеннями у вида -- до 100 мкм та до 300 мкм. Отже, наявне густе опушення листків дозволяє розглянутим рослинам витримувати жаркі умови вирощування. Якісних відмінностей між P. sidoides та P. hybridum у включеннях та залозистих трихомах нами виявлено не було.

Відомо, що умови вирощування рослин значно впливають на синтезуючу здатність рослин. Тому, з метою підбору ефективніших умов вирощування дорослі (3,5 роки) рослини P. sidoides вирощували у двох теплицях із різними температурними умовами: перша теплиця з температурою 15 °С взимку та 25 °С влітку, друга теплиця з температурою 15 °С взимку та 37 °С влітку. Вирощування з високими літніми температурами супроводжувалося більш потужним утворенням запасливого коріння, що потенційно збільшує отримання корисних речовин з коренів даної рослини. Також було визначено загальну кількість флавоноїдів (речовин, які виявляють різноманітну фітотерапевтичну дію) у перерахунку на рутин у листках 3,5 річних батьківських рослин, що в умовах холоднішої теплиці становила 1,4 ± 0,53 %, тоді як в умовах теплішої теплиці кількість флавоноїдів у листках становила 2,31 ± 0,52 %. Таким чином, було встановлено, що за вирощування в тепліших умовах кількість флавоноїдів в листках зростає майже вдвічі, а також рослина активніше запасає речовини в корінні. З метою перевірки впливу температури, частину отриманих гібридних рослин також вирощували в теплиці з вищою температурою і частину у відносно холоднішій теплиці, після чого перевіряли загальний вміст флавоноїдів в листках та коренях цих рослин (табл. 1).

Таблиця 1. Сумарний вміст флавоноїдів у рослин роду Pelargonium віком 1,3 роки, % у перерахунку на рутин та масу сухої речовини