Вплив температури культивування на активність протеолітичних ензимів бактерій, виділених з глибоководних відкладів Чорного моря

Культури Bacillus subtilis 1, Priestia megaterium 55 і B. licheniformis 249 вирощували у глибинних умовах у колбах Ерленмейєра (750 мл), які містили 100 мл поживного середовища, при перемішуванні 220 об/хв, за різних температур -- 12,28 і 42 °С.

Біомасу відділяли центрифугуванням при 5000 g 45 хв, і в супернатанті культурально!' рідини визначали протеолітичну активність.

Еластазну активність визначали колориметрично за інтенсивністю забарвлення розчину при ензиматичному гідролізі еластину, забарвленого конго червоним [12]. Інтенсивність забарвлення вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 515 нм. За одиницю активності приймали таку кількість ензиму, яка каталізує гідроліз 1 мг еластину за 1 хв. Визначення фібриногенолітичної активності проводили за методом [9], використовуючи як субстрат фібриноген. Утворення продуктів розщеплення фібриногену вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при 275 нм. За одиницю фібриногенолітичної активності приймали таку кількість ензиму, яка підвищує оптичну густину реакційної суміші на 0,01 за 1 хв.

Колагеназну активність визначали за методом [8]. Продукти розщеплення колагену визначали в реакції з нінгідрином на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 600 нм. За одиницю колагеназної активності приймали кількість мкмолей вивільненого лейцину за 1 хв.

Усі досліди проводили в 3--5 повторностях. Для проведення статистичного аналізу використовувався t-критерій Стьюдента. Дані представлені як середнє ± стандартна помилка (M±m) і вважаються значущими при р<0,05. Результати, представлені у вигляді графіків, опрацьовані за допомогою Microsoft Excel 2007.

Результати досліджень

Дослідження впливу температури культивування продуцента показало (рис. 1, а), що еластазна активність Bacillus subtilis 1 змінюється в динаміці росту. Так, на першу добу культивування при 12 °С еластазна активність в супернатанті культуральної рідини не виявлена, при температурі 28 °С культивування продуцента еластазна активність була незначною і складала 4,68 од/мл, а при 42 °С вона була максимальною -- 29,83 од/мл.

Рис. 1 Вплив температури культивування на еластазну активність Bacillus subtilis 1 (а), Priestia megaterium 55 (б) і Bacillus licheniformis 249 (в)

При подальшому культивуванні B. subtilis 1, починаючи з другої доби, спостерігали еластазну активність при всіх температурах культивування, але найвищою вона була на четверту добу при 28 °С (29,0 од/мл), тобто майже на рівні активності при 42 °С. На п'яту добу культивування еластазна активність була незначною, майже однаковою при всіх досліджуваних температурах вирощування. Дослідження впливу температури культивування на фібриногенолітичну активність B. subtilis 1 показало (рис. 2, а), що на першу добу активність не була виявлена за жодної температури вирощування продуцента. Синтез досліджуваного ензиму починається з другої доби культивування продуцента при 28 ^ОС та 42 °С, але не при 12 °С. Максимальну фібриногенолітичну активність спостерігали на четверту добу культивування при 28 °С (16,6 од/ мл).

Вивчення впливу температури культивування на колагеназну активність B. subtilis 1 показало (рис. 3, а), що при 12 °С вона не була виявлена в процесі культивування від першої до п'ятої доби. Максимальну колагеназну активність спостерігали з другої по четверту добу культивування продуцента при 28 °С, рівень її був однаковий і складав 0,42 од/мл. На п'яту добу культивування активність знижувалась майже в 2 рази і складала всього 0,2 од/мл.

Таким чином, показано, що лише еластазна активність B. subtilis 1 при 42 °С була дещо більшою (29,8 од/мл), ніж при 28 °С (29,0 од/мл), в той час як фібриногенолітична і колагеназна активність були максимальними при вирощуванні продуцента при 28 °С.

При вивченні впливу температури культивування на еластазну активність Priestia megaterium 55 показано (рис. 1, б), що її відмічали, починаючи вже з першої доби культивування за всіх досліджуваних температур, причому найбільш сприятливою, незалежно від доби вирощування, була температура 28 °С. Найвищу активність при даній температурі відмічали на другу добу культивування (41,4 од/мл). Дещо нижчою була активність при вирощуванні культури при 42 °С (23 од/мл), а найнижчою (5,5 од/мл) -- при 12 °С.

Максимальна фібриногенолітична активність P. megaterium 55 відмічалась на третю добу культивування при 12 °С (15 од/мл) (рис. 2, б), що значно перевищувало активність при більш високих температурах культивування продуцента.

Так, при 28 °С фібриногенолітична активність була майже в 4 рази нижчою і складала 4 од/мл, а при температурі культивування 42 °С - була в 7,5 раза меншою і становила 2 од/мл.

На відміну від попередньо дослідженого штаму, результати впливу температури культивування на колагеназну активність P. megaterium 55 виявились надзвичайно цікавими (рис. 3, в). Так, на першу і п'яту добу культивування активність не була виявлена за жодної з досліджуваних температур. Максимальна колагеназна активність була виявлена на третю добу культивування при 12 °С і складала 0,25 од/мл. При збільшенні температури культивування активність пропорційно знижувалась. Аналогічні результати відмічали і на другу добу культивування. На четверту добу культивування колагеназна активність була доволі низькою і виявлена лише при 12 і 28 °С (0,05 од/мл).

Еластазну, фібриногенолітичну і колагеназну активність у Bacillus licheniformis 249 відмічали (рис. 1, в, 2, в, 3, в), починаючи з першої по п'яту добу культивування за всіх досліджуваних температур. Найвищою еластазна активність (33,3 од/мл) була на четверту добу культивування продуцента при 28 °С (див. рис. 1, в). Дещо нижчою була активність при вирощуванні культури як при 42, так і при 12 °С.

Рис. 2 Вплив температури культивування на фібриногенолітичну активність Bacillus subtilis 1 (а), Priestia megaterium 55 (б) і Bacillus licheniformis 249 (в)

Рис. 3 Вплив температури культивування на колагеназну активність Bacillus subtilis 1 (а), Priestia megaterium 55 (б) і Bacillus licheniformis 249 (в)

Дослідження впливу температури культивування на фібриногенолітичну активність B. licheniformis 249 показало (див. рис. 2, в), що 28 °С є оптимальними незалежно від доби культивування. Максимальна фібриногенолітична активність була виявлена на четверту добу культивуваня і становила 20 од/мл.

Цікавим виявився той факт, що при культивуванні B. licheniformis 249 при 12 °С фібриногенолітична активність була вищою, ніж при 42 °С, і її максимальний рівень становив 15 од/мл на третю добу вирощування продуцента.

Дещо іншу картину спостерігали при аналізі колагеназної активності B. licheniformis 249 (рис. 3, в). Її максимальна активність відмічалась на третю -- четверту добу культивування при 42 °С і досягала 0,85 од/мл, що значно перевищувало показники колагеназної активності для B. subtilis 1 (0,42 од/мл) та P. megaterium 55 (0,25 од/мл).

При 28 °С вирощування продуцента активність була дещо нижчою і становила 0,62 од/мл на третю добу культивування та 0,25 од/мл -- на четверту добу. Синтез ензима починався з другої доби культивуванні B. licheniformis 249 і лише мінімальні рівні колагеназної активності спостерігали при вирощуванні продуцента при 12 °С.

Таким чином, температура культивування мікроорганізмів відіграє суттєву роль для досягнення максимального синтезу протеолітичних ензимів. Визначення оптимальної температури вирощування дозволяє збільшити активність ензимів з еластазною, фібриногенолітичною і колагеназною дією. Показано, що динаміка синтезу ензимів у різних штамів за різних температур суттєво відрізняється.

Обговорення результатів досліджень

Протягом мільярдів років океан є джерелом життя на Землі, оскільки він містить найбільшу кількість середовищ існування, в яких проживає більшість форм життя. Але, незважаючи на безперечну спільність біологічних, у тому числі і мікробіологічних процесів, що протікають на всій планеті, біоценози Світового океану істотно відрізняються як від прісноводних, так і від наземних. Це обумовлено тим, що вони перебувають під впливом таких екстремальних умов, як глибоководні гідротермальні джерела, надзвичайна солоність, тиск, низькі температури. Конкуренція між мікроорганізмами за простір і поживні речовини в морському середовищі є потужною селективною силою, яка призвела до еволюції, яка підштовхнула морські мікроорганізми до створення різноманітних ферментних систем для адаптації до складного морського середовища [13]. Тому властивості ензимів, які продукуються морськими мікроорганізмами, можуть значно відрізнятися від наземних. Оскільки вивчені штами мікроорганізмів були виділені із глибоководних відкладів Чорного моря, де температура становить - 5 °С, важливо було вивчити, як температура вирощування може вплинути на активність досліджуваних ензимів. Хоча досліджувані культури були виділені майже з однакової глибини: B. subtilis 1 та B. licheniformis 249 -- 1499 м, Priestia megaterium 55 -- 1537 м, супернатанти їхніх культуральних рідин проявляли різну ензиматичну активність як в залежності від температури, так і в динаміці росту. Так, якщо для B. subtilis 1 найбільша еластазна активність була майже однаковою при 42 і 28 °С (перша та четверта доба культивування, 29,83 і 29,0 од/мл, відповідно), фібриногенолітична та колагеназна -- при 28 °С (четверта та з другої по четверту добу, 16,6 та 0,42 од/мл, відповідно), то для P. megaterium 55 лише для еластазної активності оптимальною була температура 28 °С (друга доба, 41,4 од/мл), в той час як для фібриногенолітичної та колагеназної активності оптимальною виявилась температура 12 °С (третя та третя доба культивування, 15,0 та 0,25 од/мл, відповідно). B. licheniformis 249 відрізняється від вищеописаних штамів тим, що для його колагеназної активності оптимальною виявилась температура 42 °С (третя - четверта доба, 0,85 од/мл), в той час як для еластолітичної та фібриногенолітичної активності -- 28 °С (четверта доба, 33,3 од/мл та четверта доба, 20 од/мл, відповідно).

Підвищення активності ензимів, одержаних з культур, що вирощені за низьких температур, можна розглядати як один з механізмів адаптації організму до умов навколишнього середовища. В той час як зниження активності при підвищенні температури культивування пов'язане зі збільшенням швидкості денатурації позаклітинного ензиму вже під час культивування. Разом з тим деякі ензими можуть проявляти активність при культивуванні штаму-продуцента як за високих, так і за низьких температур. Одержані результати свідчать, що особливості досліджених штамів залежать від властивостей ензимів, зокрема їхньої структурної організації.

Роботи, присвячені дослідженням впливу температури культивування на прояв активності протеолітичних ензимів морських мікроорганізмів, на сьогодні в літературі майже відсутні. Разом з тим деякі автори [5] показали, що у східній частині Індійського океану через зміну температури води, солоності і рівня фосфатів спостерігаються зміни в мікробному різноманітті донних осадів. Дев'ять різних культур з морських зразків Індійського океану, здатних рости в присутності 10 % NaCl, були виділені авторами [5]. Оптимальною для їхнього росту була температура 30 °C, pH середовища 7,0--8,0. Жодна з культур не здатна була рости при температурі вище 45 °C і нижче 15 °C. Безклітинний екстракт лише однієї культури, яка належить до роду Marinobacter MBRI 7, проявляв протеолітичну активність. Виявлено, що оптимальна температура та pH для активності становили 40 °C та 7,0 відповідно. Неочищений фермент був стабільним за температури 30--80 °C і pH 5,0--9,0. Він зберігав 60 % активності при витримуванні при 80 °C протягом 4 год та понад 70 % активності -- за 70 °C через 1 год. Цікаво, що фермент зберігав 50 % активності при pH 9,0 протягом 1 год. Порівняння з іншими протеазами з різних мікробних джерел дало можливість авторам припустити, що нейтральна протеаза з галотолерантного морського ізоляту Marinobacter MBRI 7 є новим ферментом з високою термостабільністю.

Також лише в одного з 33 бактеріальних ізолятів, виділених з морських біотопів на о. Кінг-Джордж (Антарктида), була виявлена висока протеолітична активність [13]. Цей ізолят був ідентифікований як Pseudoalteromonas sp. P96-47. Оптимальною температурою його росту було 20 °C, а синтезу протеази -- 15 ^oC. Протеази були очищені з культурального супернатанта Pseudoalteromonas sp. P96-47 і показано, що вони представляють нейтральні металопротеази, оптимум дії яких становив 45 ^oC. їхня стабільність була вищою при нейтральному значенні pH і більше 80% активності зберігалось при pH 6--10 після 3 год інкубації за 4 ^oC. Після 90 хв інкубації при 40 і 50 ^oC частка залишкової активності становила відповідно 78 і 44%.

Таким чином, морські мікробні протеази можуть бути перспективними для подальшого промислового застосування.

Висновки