Експресивність лактатдегідрогенази у чорноморської креветки Palaemon elegans

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Експресивність лактатдегідрогенази у чорноморської креветки Palaemon elegans

В.В. Субота, аспірантка,

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова

С.А. Петров, д. 6. н., професор

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова

О.М. Андрієвський, к. 6. н., доцент,

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова

Досліджували активність ферменту лактатдегідрогенази у чорноморської креветки Palaemon elegans. З метою виявлення активності ЛДГ використовували електрофоретичний метод та гістохімічну реакцію утворення її продуктів. Найбільшу експресивність виявлено при приготуванні гомогенату креветки на фосфатному буфері рН 7,4. Виявлено дві форми ферменту. Наведено результати визначення активності досліджуваного ферменту.

Ключові слова: лактатдегідрогеназа, електрофорез, чорноморська креветка Palaemon elegans.

LACTATE DEHYDROGENASE EXPRESSION IN THE BLACK SEA SHRIMP PALAEMON ELEGANS

The activity of lactate dehydrogenase enzyme in the Black Sea shrimp Palaemon ele- gans was studied. In order to detect the activity of LD, the electrophoretic method and the histochemical reaction of the formation of its products were used. The highest expressiveness was found when shrimp homogenate was prepared in a phosphate buffer with a pH of 7.4. Two forms of the enzyme have been identified. The results of determining the activity of the studied enzyme are given.

Keywords:lactate dehydrogenase, electrophoresis, the Black Sea shrimp Palaemon ele- gans.

Ракоподібні відіграють важливу роль в чорноморській екосистемі як складові трофічного ланцюга. Одним із найважливіших показників метаболізму у ракоподібних є активність одного з ферментів енергетичного обміну -- лактатдегідрогенази (К.Ф.: 1.1.1.27), що незмінно приймає участь в адаптаційних процесах.

Креветки є важливим промисловим об'єктом у багатьох країнах. Цінність цього організму визначається наявністю в ньому значної кількості насичених і ненасичених жирних кислот, вітамінів, інших біологічно активних речовин і білків. Значна частина досліджень, проведених на цих ракоподібних, присвячена вивченню вмісту в організмі вищевказаних речовин, методів обробки, способів зберігання і збереження отриманих продуктів [5].

За низьких температур фермент інгібується низькими концентраціями лактату, і навпаки, при більш високих температурах для досягнення інгібування необхідні більш високі концентрації субстрату. Цей механізм, описаний [12], дозволяє креветкам підтримувати високий рівень анаеробного метаболізму при відносно високих температурах.

Дослідження [8, 9] показали, що Palaemon elegans Rathke має більшу толерантність до важкої гіпоксії, ніж P. serratus (Pennant). Толерантність до повністю безкисневих умов у P. elegans була обмежена 4 годинами. Вплив помірної гіпоксії (30 торр) призвів до незначної зміни концентрації L-лактату в крові або в тканинах P. elegans або P. serratus. Однак при екстремальній гіпоксії (10 або 5 торр для P. elegans) спостерігалось прогресуюче збільшення концентрації L-лактату в крові та в тканинах обох видів. Після відновлення нормоксичних умов концентрація L-лактату в крові та тканинах поверталася до нормального рівня спокою швидше у P. elegans, ніжуP. serratus [6].

Раніше було досліджено [7], що показники активності супероксид- дисмутази, глутатіонпероксидази, вміст окисненого глутатіону та каротиноїдів були вищими у чорноморської креветці порівняно з антарктичним крилем Euphasia suberba (Dana, 1850).

За [3], активність лактатдегідрогенази корелюється з інтенсивністю метаболізму в тканинах залежно від температурного режиму.

Метою роботи було визначити експресивність лактатдегідрогенази в тканинах чорноморської креветки.

В задачі дослідження входило: 1) визначити наявність лактатдегідрогенази в тканинах креветки; 2) підібрати умови оптимального екстрагування ферменту; 3) визначити кількісні показники експресивності лактатдегідрогенази чорноморської креветки.

чорноморська креветка фермент лактатдегідрогенази

Матеріал і методика дослідження

Джерелом ферменту лактатдегідрогенази (ЛДГ) слугувала чорноморська креветка Palaemon elegans Rathke (1836) (WoRMS, 2004), вилов якої був здійснений в Одеській затоці 30 березня 2021 р. на Одеському пляжі «Дельфін», широта 46^О28'38'', довгота 30^О43'57'', температура води 14 ^ОС, солоність 14 %о. Відразу після вилову біологічний матеріал був заморожений при -10 ^ОС та в подальшому зберігався до початку дослідження.

Після проведення попередніх досліджень на різних буферах, було обрано фосфатний буферний розчин, так як він показав високу активність ЛДГ. Подальший аналіз проводили для всіх проб саме з використання цього буферного розчину.

Гомогенат готували у співвідношенні 1 : 4 на буферному розчині -- 0,1 М фосфатний (NaH2PO4 * Na2HPO4), рН 7,4. Для цього гомогенат зразка отримували шляхом гомогенізації замороженого матеріалу масою 13,7 г в 54,7 мл буферного розчину протягом 2 хв за допомогою мікро- подрібнювача та подальшого центрифугування при 8 000 g протягом 10 хв.

Далі проводили електрофоретичне дослідження отриманих проб супернатанту в лужних умовах (pH 8,3) з використання апарату OmniPage Tetrad Mini-set (Великобританія), який надає можливість формувати по- ліакриламідно-гелеві блоки розміром 100 мм х 100 мм х 1 мм.

Міграція ферменту проходила в 7,5 % поліакриламідному гелі при силі електричного струму в 100 мА та напруженні 250 V протягом 120 хв. В кожний із слотів заполімеризованого гелю вносили індивідуальні об'єми проб в кількості 20 мкл з попереднім додаванням 10 мкл 60 % розчину сахарози, що містив 0,01 % бромфенолового синього. Як робочий буфер для електрофорезу використовували 0,04 М трис-гліциновий буфер pH 8,3, в якому в подальшому виявляли активність лактатдегідрогенази. Після електрофорезу гелеві блоки інкубували в 25 мл лужного буфера, що містив 12,5 мг лактату літія, 6,5 мг NAD+, 10 мг пара-нітротетра- золієвого синього та 5 мг феназинметасульфату. Інкубація тривала одну годину при +25 °С, що було достатньо для прояву активності ферменту в гелі. Після інкубації гелі промивати дистильованою водою, пакували в поліетиленові файли та сканували з використанням планшетного сканера. Отримані зображення зберігали в форматі ВМР для подальшої комп'ютерної обробки.

Кількісну оцінку отриманих результатів експресивності ферменту проводили в комп'ютерній програмі «АнаИС» після сканування гелевого блока. Це дає можливість отримати цифрові дані щодо експресії молекулярних форм лактатдегідрогенази, їхньої відносної електрофоретичної рухливості, часткового внеску кожної молекулярної форми ферменту в загальну активність та побудувати денситограми та гістограми.

Після отримання необхідних значень оптичної густини ділянок локалізації ферментів і продуктів каталізованих ними реакцій відносну активність (ВА) лактатдегідрогенази розраховували за формулою:

ba=4D°± v-t-k

де D° -- оптична густина, що відображає кількість продукту реакції в окремій фракції в умовних одиницях; V -- об'єм реакційного середовища в області локалізації ферменту гелевому блоці, мл; v -- об'єм аналізованого екстракту, мл; t -- час, за який проходила ферментативна реакція, хв; k -- коефіцієнт переведення відносних одиниць оптичної щільності у молі кінцевого продукту реакції (коефіцієнт розраховується за калібрувальним графіком, що відображає залежність щільності фракцій на денсито- грамі від відомих кількостей продукту реакції).

Питому активність ферменту розраховували за даними відносної активності та концентрації білка в досліджуваній пробі -- ПА = BA / [P], одиниці/мг.

Кількісну оцінку отриманих результатів експресивності ферменту проводили в комп'ютерній програмі «АнаИС» після сканування гелевого блоку.

Рис. 1. Електрофоретичний профіль лактатдегідрогенази чорноморської креветки Palaemon elegans: А -- електрофореграма, В -- денситограма, С -- гістограма оптичної щільності та питомої активності

Статистичну обробку даних, що відображали рівень експресії досліджуваного ферменту, проводили у програмі «Excel». З використанням цієї програми знаходили середні арифметичні величини і їх стандартні відхилення. Відмінності між порівнюваними варіантами вважали достовірними при р<0,05. На основі отриманих даних будували гістограми.

Рис. 2. Електрофоретичний профіль молекулярних форм лактатдегідрогенази чорноморської креветки Palaemon elegans: а -- електрофореграма, b -- денситограма, c -- гістограма оптичної щільності

Результати досліджень та їх обговорення

На рисунку 1 наведені характеристики лактатдегідрогенази чорноморської креветки при приготуванні гомогенату з використанням фосфатного буферу.

Подальші електрофоретичні дослідження проводили саме з використанням екстракту, отриманого на даному буферному розчині (рис. 2).

ТаблицяПоказники ЛДГ чорноморської креветки Palaemon elegans

Приготування екстракту тканини чорноморської креветки (Palaemon elegans) на фосфатному буферному розчині (рН 7,4) забезпечує максимальну екстракцію ферменту лактатдегідрогенази.

Лактатдегідрогеназа у чорноморської креветки (Palaemon elegans), яка здатна перетворювати лактат, представлена двома формами, з різною електрофоретичною рухливістю. Активність першої форми була більш вираженою, з питомою активністю 0,877 одиниць на 1 мг білка.

Відносно висока активність ЛДГ у Palaemon elegans -- 0,877-- 0,877 од./мг білку, порівняно з ЛДГ інших представників креветок, може бути пов'язана з умовами їхнього існування.

Дослідження показали, що чорноморська креветка Palaemon elegans має високу активність ферменту лактатдегідрогенази, що відіграє важливу роль у її метаболічних та адаптаційних процесах. Дослідження активності ЛДГ у чорноморської креветки може мати значення для подальшого вивчення метаболічних процесів та адаптаційних властивостей цього виду, а також для визначення якості креветок як важливого промислового об'єкту.

Список використаної літератури

1. Головина И.В. Особенности активности ферментов энергетического обмена в тканях черноморских моллюсков разной подвижности в норме и при патологии. Мор. биол. журн. 2016. № 1. С.14--23.

2. Duan Y., Wang Y., Zhang J., Xiong D. Elevated temperature disrupts the mucosal structure and induces an immune response in the intestine of white leg shrimp Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) (Decapoda: Dendrobranchiata : Penaeidae). J. Crustacean Biol. 2018. Vol. 38, N 5. P. 635--640.

3. Emeretli I.V. Temperature dependence of the lactate dehydrogenase activity in tissues of the Black Sea flatfishes. Hydrobiol. J. 2002. Vol. 38, N 3.

4. Fregoso-Pe^^ri A.A., Valenzuela-Soto E.M., Figueroa-Soto C.G. et al. White shrimp Litopenaeus vannamei recombinant lactate dehydrogenase: Biochemical and kinetic characterization. Protein Expression and Purification. 2017. Vol. 137. P. 20--25.

5. Kim Min-A, Jung Hae-Rim, Lee Yang-Bong et al. Monthly Variations in the nutritional composition of antarctic krill Euphausia superba. Fisheries and Aquatic Sciences. 2014. Vol. 17, N 4. P. 409--419.

6. Madeira D., Mendon3a V., Vinagre C. & Diniz M.S. Is the stress response affected by season? Clues from an in situ study with a key intertidal shrimp. Mar. Biol. 2016. Vol. 163, N 41.

7. Petrov S.A., Andriyevsky O.M., Budnyak O.K. et al. Antioxidant protection system in the tissues of the Antarctic krill Euphausia superba and of the Black Sea shrimp Palae- mon elegans. Hydrobiol. J. 2022. Vol. 58, N 5. P. 78--84.

8. Taylor A.C., Spicer J.I. Metabolic responses of the prawns Palaemon elegans and P. serratus (Crustacea : Decapoda) to acute hypoxia and anoxia. Mar. Biol. 1987. Vol. 95. P. 521--530.

9. Taylor A.C., Spicer J.I. Functional significance of a partial-emersion response in the intertidal prawn Palaemon elegans (Crustacea : Palaemonidae) during environmental hypoxia. Marine Ecology Progress Series. 1988. Vol. 44, N 2. P. 141--147..

10. Thebault M.T. Lactate content and lactate dehydrogenase activity in Palaemon serratus abdominal muscle during temperature changes. J. Comp. Physiol. B 154. 1984. P. 85--89.

11. Thebault M.T., Bernicard A., Lennon J.F. Lactate dehydrogenase from the caudal muscle of the shrimp Palaemon serratus: purification and characterization. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B: Comparative Biochemistry. 1981. Vol. 68, N 1. P. 65--70.

12. Thebault M.T., Le Gal Y. Short and long-term temperature adaptation of the muscle lactate dehydrogenase in Palaemon serratus in animals and environmental fitness. Physiological and Biochemical Aspects of Adaptation and Ecology. 1980. Vol. 2. P. 23--35.

Размещено на Allbest.ru