Хроматографические методы анализа эфирных масел

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО «Витебский государственный медицинский университет»

Кафедра фармакогнозии с курсом ФПК и ПК

Курсовая работа

Тема: «Хроматографические методы анализа эфирных масел»

Выполнила:

студентка 1 группы 3 курса

фармацевтического факультета

Иванова Елизавета Андреевна

Научный руководитель:

доцент Кузьмичёва Н.А.

Витебск, 2012



Оглавление

Введение

1. История развития хроматографии

2. Основы хроматографии

3. Эфирные масла

4. Хроматографический анализ эфирных масел

5. Лаванды цветки

6. Тимьяна трава

7. Фенхеля горького плоды

8. Мяты перечной листья

9. Багульника болотного побеги

Заключение

Список использованных источников

хроматографии эфир масло лаванда тимьян



Введение

Одна из важных задач современной химии - надежный и точный анализ органических веществ, часто близких по строению и свойствам.

Один из наиболее чувствительных методов - хроматографический анализ, впервые предложенный российским ученым М.С.Цветом в начале XX в. и к концу века превратившийся в мощнейший инструмент, без которого уже не могут обходиться как синтетики, так и химики, работающие в других областях. Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены, количественно и качественно определены более 1000 индивидуальных компонентов, например, в бензиновых фракциях нефти; двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биологических объектах или пептидов в гидролизатах белков. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электрофореза стала возможной расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе "Геном человека". Используя хроматографию, можно определить содержание супертоксикантов, в частности, полихлорированных диоксинов в объектах окружающей среды при крайне низких концентрациях этих веществ (10-10%). ^[1]

Целью настоящей курсовой работы является обобщение литературных сведений о хроматографических методах анализа лекарственного растительного сырья, содержащего эфирные масла.

Будут решены следующие задачи:

· Будет изучена история развития хроматографии;

· Кратко рассмотрены физические свойства эфирных масел;

· Изучены особенности хроматографии различных растений.



1. История развития хроматографии

Впервые термин "хроматография" был использован российским биологом Михаилом Семеновичем Цветом для описания разработанного им метода разделения компонентов хлорофилла на бумаге. Это произошло 21 марта 1903 г, когда Михаил Семенович Цвет, в то время работавший в должности ассистента (официально - в должности внештатного лаборанта) кафедры анатомии и физиологии растений Варшавского университета, прочитал свой знаменательный доклад "О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биологическому анализу". Подробное изложение принципов и возможностей своего хроматографического метода он дал в 1906 г. в двух статьях на немецком языке и в книге 1910 г . "Хромофиллы в растительном и животном мире". По экспертным оценкам, хроматография относится к 20 выдающимся открытиям прошедшего столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а через нее определили уровень развития техники и промышленности, цивилизации в целом. В конце своего 100-летия хроматография представляет собой:

· самый распространенный и совершенный метод разделения смесей атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц;

· уникальный метод качественного и количественного анализа сложных многокомпонентных смесей:

· самостоятельное научное направление и важный физико-химический метод исследования и измерения;

· препаративный и промышленный метод выделения веществ в чистом виде;

· мощную отрасль научного приборостроения.[1]



2. Основы хроматографии

Хроматография [гр. сhrцmatos ? цвет + graphц ? пишу] -- метод разделения, анализа и физико-химических исследований веществ, основанный на перемещении зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке подвижной фазы с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов. При этом разделяемые вещества распределяются между двумя несмешивающимися фазами (в зависимости от их относительной растворимости в каждой фазе): подвижной и неподвижной. [2]

Сущность метода заключается в различной скорости перемещения веществ некоторой анализируемой смеси вдоль слоя сорбента (неподвижной фазы - НФ) в потоке элюента (подвижной фазы - ПФ).

Скорость перемещения веществ связана с различным распределением разделяемых веществ между двумя фазами из-за неодинакового взаимодействия с ними. В результате исходная смесь разделяется на слои, содержащие более или менее чистые вещества, которые могут быть проанализированы.

В зависимости от выполняемых задач хроматография бывает:

· аналитической, когда производится исследование физико-химических характеристик веществ при использовании хроматографической аппаратуры и на основании параметров хроматографических зон;

· препаративной, используемой для выделения небольших количеств чистых компонентов в лабораторных условиях;

· промышленной, применяемой для получения чистых веществ в значительных количествах.

Распространены также комплексные (гибридные) методы.

В настоящее время получили распространение следующие виды хроматографии:

1. Газовая. Производится разделение и анализ газообразных веществ в потоке элюента-газа (водород, гелий, азот).

2. Жидкостная. Разделение веществ производится в потоке жидкого элюента (н-гексан, диметилформамид, ацетонитрил и т.д.).

Более подробная классификация вариантов хроматографического анализа в зависимости от используемых подвижной и неподвижной фаз и характера межмолекулярных взаимодействий дана в таблицах 1-3.

Таблица 1 - Варианты хроматографии по фазовым состояниям

Подвижная фаза	Неподвижная фаза	Название метода
Газ	Твёрдый адсорбент Жидкость	Газоадсорбционная Газожидкостная
Жидкость	Твёрдый адсорбент Жидкость	Жидкостно-адсорбционная Жидкость-жидкостная
Газ или пар в сверхкритическом состоянии	Твёрдый адсорбент Жидкость	Флюидно- адсорбционная Флюидно-жидкостная
Коллоидная система	Сложная композиция твёрдых и жидких компонентов	Полифазная хроматография

Таблица 2 - Варианты хроматографии по характеру взаимодействий

Механизм процесса разделения	Вариант хроматографии
Различная сорбируемость компонентов смеси твёрдым неподвижным адсорбентом	Адсорбционная
Различная растворимость компонентов смеси в жидкой НФ	Распределительная
Различие констант ионного обмена между НФ и компонентами разделяемой смеси	Ионообменная
Разная проницаемость молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель).	Эксклюзионная (молекулярно-ситовая)
Различная способность разделяемых компонентов выпадать в осадок на твёрдой НФ	Осадочная
Образование водородных связей, химическое сродство отдельных компонентов и т.д.	Хемосорбционная
Различная скорость движения заряжённых частиц компонентов под воздействием внешнего напряжения	Электрохроматография

Таблица 3- Варианты хроматографии по способу проведения процесса

Способ проведения	Вариант хроматографии
В цилиндрическом слое сорбента	Колоночная
В слое сорбента на плоской поверхности	Планарная
В пленке жидкости или слое сорбента, размещенном на внутренней стенке трубки	Капиллярная
В полях электрических, магнитных, центробежных и других сил	Хроматография в полях сил

В зависимости от способа перемещения разделяемой смеси вдоль слоя сорбента различают следующие варианты хроматографии: фронтальный, проявительный и вытеснительный.

При фронтальном варианте в слой сорбента непрерывно вводится разделяемая смесь, состоящая из газа-носителя и разделяемых компонентов, например 1, 2, 3, 4, которая сама является подвижной фазой. Через некоторое время после начала процесса наименее сорбируемый компонент (например, 1) опережает остальные и выходит в виде зоны чистого вещества раньше всех, а за ним в порядке сорбируемости последовательно располагаются зоны смесей компонентов: 1 + 2, 1 + 2 + 3, 1 + 2 + 3 + 4.

Проявительный (элюационный) метод заключается в том, что компоненты смеси (сорбаты) переносятся через сорбционный слой потоком вещества (элюента), сорбирующегося хуже любого из сорбатов. В ходе проявительного анализа разделенные компоненты анализируемой смеси выходят из хроматографической колонки в потоке элюента отдельными зонами, между которыми (при достаточно четком разделении) из колонки выходит чистый элюент. Это наиболее употребительный употребительный вариант хроматографии.

Вытеснительный метод заключается в переносе разделяемой смеси потоком вещества (вытеснителя), сорбирующегося сильнее любого из компонентов смеси. В ходе вытеснительного анализа образуются отдельные примыкающие друг к другу зоны компонентов, между которыми окажутся зоны их смеси. Порядок элюирования компонентов характеризует их физико-химические свойства, а ширина полосы (не высота!) пропорциональна концентрации данного компонента. Вытеснительный анализ как метод разделения имеет весьма ограниченное применение и крайне редко используется в количественном анализе.

Существуют два основных метода хроматографического определения состава смесей:

1. метод выходной кривой (применяется в основном, в колоночной и капиллярной хроматографии); основан на непрерывном определении свойства выходящего из колонки потока как функции времени или объема пропущенного вещества;

2. метод слоя, заключающийся в определении изменения свойства смеси по длине сорбционного слоя.

В первом варианте проба, растворённая в подвижной фазе, вводится в верхнюю часть колонки. Затем с использованием подвижной фазы осуществляется элюирование разделяемых веществ до тех пор, пока они не будут детектированы в конце колонки.

Поясним принцип элюирования на примере разделения веществ А и В.

После того как проба введена в колонку, её компоненты распределяются между подвижной и неподвижной фазами. Если подвижная фаза после этого непрерывно поступает в форме элюента, вещества распределяются вдоль колонки между порциями подвижной и новыми частями неподвижной фаз.

Для соединений, удерживающихся сильнее на неподвижной фазе, требуется больше времени для разделения, чем для веществ, взаимодействующих слабее. В идеале вещества разделяются после соответствующего времени элюирования и индивидуально детектируются в конце колонки.

Хроматограммой называется запись сигнала детектора как функции времени элюирования.[3]

3. Эфирные масла

Эфирные масла - пахучие вещества, которые вырабатываются эфирномасличными растениями и обусловливают их запах.

Эфирные масла -- многокомпонентные смеси органических соединений, главным образом терпенов и их кислородных производных -- спиртов, альдегидов, кетонов, эфиров и др. (в ряде случаев преобладает один или нескольких компонентов).

Терпены весьма реакционноспособны:

· легко окисляются на воздухе, особенно на свету, часто превращаясь при этом в кислородсодержащие соединения;

· при нагревании изомеризуются (прежде всего при взаимодействии с кислыми агентами);

· диспропорционируют в присутствии катализаторов (Pd, Pt, Ni);

· по двойным связям легко гидрируются, гидратируются, присоединяют галогены, галогеноводороды, органические кислоты и т.д.

При сильном нагревании без доступа воздуха (400-500 °С) кольца терпенов раскрываются, причем из бициклических терпенов можно получить моноциклические и даже алифатические. При нагревании до 700 °С и выше все терпены разлагаются с образованием сложной смеси продуктов (изопрен ароматические углеводороды и др.).

Терпены выделяют из природного сырья (живица, эфирные масла, скипидар, бальзамы и т.д.) перегонкой с водяным паром, экстракцией летучими растворителями, а также путем анфлеража (извлечение нелетучими растворителями- жирами, маслами); индивидуальные терпены из их смесей получают фракционной перегонкой в вакууме, методами хроматографии, вымораживанием и др.

Многие терпены и их производные получают также синтетически (камфора).[4]

4. Хроматографический анализ эфирных масел

Газовая хроматография - группа хроматографических методов, в которых подвижная фаза газообразна (находится в состоянии газа или пара).

В соответствии с типом используемых неподвижных фаз газохроматографические методы подразделяются на газо-адсорбционный и газо-жидкостный. Разделение компонентов анализируемой смеси в газо-адсорбционном варианте основано на различии разделяемых веществ в величинах адсорбции на поверхности адсорбента, а в случае газожидкостной хроматографии на различии в растворимости компонентов анализируемой смеси в неподвижной жидкой фазе.

Принцип разделения веществ в газовой хроматографии - неодинаковое сродство веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке. После прохождения колонки вещества последовательно выходят из неё и регистрируются детектором. Сигнал детектора записывается в виде хроматограммы автоматическим потенциометром (самописцем) или же регистрируется компьютером. [5]

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) - это эффективный способ разделения и установления количественных отношений в составе эфирных масел.

Для проведения хроматографии с помощью микрошприца в узкую кварцевую капиллярную трубку (внутренний диаметр 0.25 мм) длиной 30 метров испаряют (при температуре 250⁰С) небольшую пробу (0.001 мкл) эфирного масла. Под действием постоянно протекающего через эту трубку газа-носителя (обычно гелий, водород или азот) эфирное масло в виде пара движется по трубке. Одновременно температура колонки повышается от 50⁰С до 220⁰С со скоростью 3-4 градуса/мин. Внутренняя поверхность трубки (которая называется колонка) покрыта тонким слоем (0.25 микрон) нейтральной жидкости полимерной природы (жидкая фаза, имеющая свое кодовое название, например, SE-30 или Carbowax 20M, отражающее хроматографические свойства фазы). Такая хроматография называется газожидкостной.

Компоненты эфирного масла имеют различное адсорбционное сродство к жидкой фазе из-за чего скорость продвижения вдоль колонки веществ, составляющих эфирное масло отличается друг от друга. В результате компоненты выходят из колонки в виде отдельных веществ. Обычное время анализа эфирного масла не более 30-40 мин. В современных методиках отдельное вещество может выходить в течение 3-7 секунд. Таким образом за время анализа можно обнаружить сотни веществ. Эти вещества различными методами детектируются. [6]

Основным методом обнаружения веществ, выходящих из колонки является ионизационно-пламенное детектирование. С этой целью выходной конец колонки вставляется в детектор, представляющий собой тонкое сопло с непрерывно горящим пламенем водорода. Поступающие в пламя вещества ионизируются под действием высокой температуры и обнаруживаются по появлению этих ионов. Количество ионов пропорционально количеству вещества в пламени.

В результате проведения хроматографического анализа получают хроматограмму, то есть графическое изображение состава эфирного масла в виде пиков. Размеры пика указывают на количество вещества в пробе. Количественные соотношения (обычно виде процентного отношения) рассчитываются автоматически с помощью специальных калькуляторов или с помощью компьютера. На рисунке приведена хроматограмма эфирного масла ягод можжевельника:



Рисунок 1 - Хроматограмма эфирного масла ягод можжевельника [7]

Основная проблема хроматографии - идентификация отдельных пиков, то есть расшифровка состава эфирного масла на основании данных, полученных в результате хроматографирования.

Так как время выхода различных компонентов эфирных масел отличается друг от друга, естественным способом их идентификации является использование этого времени, как постоянной для всех веществ. Использование этого метода имеет существенное ограничение, так как время выхода сильно зависит от условий хроматографирования (главным образом, давления газа и температуры) и поэтому используется очень редко в строго постоянных условиях работы хроматографической системы, с эфирными маслами, состав которых известен. Полученные результаты верны обычно только в пределах одной лаборатории и даже прибора.

Более универсальным методом использования времени как хроматографической постоянной являются индексы удерживания Ковача (Kovach's retention index). Эти индексы рассчитываются по данным времени удерживания неизвестных веществ и веществ-стандартов, для которых индексы удерживания приняты постоянными. В качестве таких стандартов выбраны нормальные алканы. Например, индекс удерживания декана (алкана с 10 атомами углерода) принят как 1000, ундекана (11 атомов углерода) - 1100 и так далее. Если теперь взять неизвестное вещество и прохроматографировать в присутствии декана и ундекана, то в случае, если это неизвестное вещество выйдет по времени между этими стандартами, то его индекс удерживания будет располагаться между 1000 и 1100. Для более точных (но упрощенных) расчетов измеряют разность времен удерживания (Д T=T₂-T₁) и разность индексов удерживания двух стандартных алканов (Д RI=RI₂-RI₁), а также время удерживания неизвестного вещества (T) и вычисляют его индекс удерживания (RI) по формуле:

RI=RI₁+ДRI/ДT_*(T-T₁)
Индекс удерживания является характеристикой определенного вещества в условиях хроматографирования на определенной жидкой фазе. Полученные индексы удерживания имеют универсальный характер и не зависят от динамических условий хроматографирования. Если говорить более точно, условия хроматографирования (температурные градиенты в процессе анализа, природа газа-носителя) слегка изменяют значение индексов удерживания. Но эти отклонения составляют не более 0.5 единиц для неполярных фаз и не более 5-8 - для полярных фаз.

Результаты хроматографического анализа представляют в виде таблицы веществ, составляющих эфирное масло с указанием индекса удерживания для каждого вещества и процентного содержания каждого компонента.

Конечно, когда разделяемые вещества имеют близкие индексы удерживания, условия хроматографирования могут привести к наложению пиков, что хорошо заметно при работе на высокоразрешающих капиллярных колонках. Тогда возникает необходимость коррекции условий анализа. Например, на неполярной фазе SE-30 при применении газа-носителя азота происходит неполное разделение пиков пара-цимена, 1,8-цинеола и цис-в-оцимена. Использование водорода дает полное разделение этих веществ. При этом применение азота на неполярной фазе удобно для разделения триплета нерол, нераль и цитронеллол, тогда как применение водорода приводит к почти полному наложению этих пиков. Различные режимы программирования температуры в ходе анализа также влияет на индексы удерживания. Некоторые вещества имеют "плавающие" индексы удерживания.

Это происходит в случае, если проба содержит большое количество растворителя. В зависимости от величины пробы растворитель в большей или меньше степени как бы "притягивает" некоторые вещества, изменяя их индекс удерживания. Например, этилацетат в присутствии большого количества этилового спирта уменьшает свой индекс удерживания (до 10 единиц) и может совмещаться с бутанол-2 (при анализе компонентов коньячного спирта).

Обычная хроматография имеет ограниченные возможности идентификации. Появление масс-спектрометрического детектора сделало возможным проводить идентификацию компонентов эфирного масла автоматически, в ходе выполнения аналитического цикла. Такие хроматографы сочетающие обычный хроматограф (GC) и масс-спектрометрический детектор (MS) получили название хромато-масс-спектрометра (ХМС, GCMS - gas-chromatography-mass-spectrometry). Обычная стоимость хроматографа 10,000-50,000$, стоимость хромато-масс-спектрометрического детектора 150,000-250,000$. При идентификации компонентов методом MS выходящие из колонки вещества не попадают в горящее пламя водорода, а направляются в поток электронов, имеющих стандартную энергию (70 эв). Эти электроны разбивают молекулу вещества на заряженные осколки, состав, заряд и количество которых в стандартных условиях для каждого вещества является постоянным. Эта информация хранится в виде баз данных в компьютерах, обслуживающих работу GCMS. Размер такой библиотеки масс-спектров может составлять более 220000 веществ.

В процессе хроматографического разделения по мере выхода веществ из колонки происходит непрерывная их бомбардировка электронами, получение масс-спектра, сравнение его с базой данных и выдача результатов. Обычно результаты GCMS представляют собой ряд предложений по идентификации в виде альтернативных формул веществ. Задача исследователя - отобрать из них наиболее приемлемый вариант. При этом пользуются законами взаимосвязи компонентов в эфирных маслах. Например, если в эфирном масле идентифицирован линалилацетат и не найден линалоол, то это не является правильным выбором (или надо искать линалоол). Аналогично, если идентифицирован нерол, а отсутствует гераниол (эти два вещества всегда присутствуют вместе), то такая идентификация сомнительна (или надо искать гераниол). Часто тимол сопровождает карвакрол, пара-цимен и гамма-терпинен, пинокамфон - изопинокамфон и т. д. Взаимосвязи компонентов в эфирных маслах обусловлены биогенетическими связями и существующими в растениях достаточно однообразными биохимическими процессами, которые связывают все компоненты эфирных масел в единый биологический цикл. Знание таких процессов позволяет избежать ошибок при идентификации.

Частая ошибка идентификации - ложные пики, образующие как артефакты при выделении эфирных масел (остатки от предыдущей пробы, примеси в растворителях, продукты разложения жидкой фазы в колонках). Такие "находки" следует ждать всегда. По крайней мере надо хорошо представлять возможный химический состав хроматографируемого объекта и упредить появление возможных "фантомов".

Кроме того каждый компонент, идентифицированный с помощью хромато-масс-спектрометра должен быть сверен со своим индексом удерживания и лишь на основании такой всесторонней оценки делается вывод об окончательной идентификации.

Иногда для получения вспомогательной информации (для уточнения идентификации) проводят хромато-ольфактометрию профиля компонентов эфирных масел. Для этого в процессе хроматографического анализа выходной конец хроматографической колонки обнюхивают. Выходящие последовательно компоненты эфирного масла оцениваются экспертами качественно. Наиболее интересные вещества идентифицируются для возможности дальнейшего их синтеза и использования для создания парфюмерных композиций. Этим методом, удается четко и наглядно представить себе вклад отдельных составляющих эфирного масла в его аромат. Так было установлено, что в состав эфирного масла розы входят на уровне миллионных долей органические сульфиды, гнилостный запах которых иногда удается почувствовать в некоторых образцах эфирного масла розы. Не следует думать, что "плохой" запах - это плохо. Среди компонентов эфирных масел многих цветочных растений (жасмин, например) содержатся производные индола, имеющие в чистом виде запах человеческих экскрементов. Но при содержании на уровне 0.001% они имеют запах очень похожий на запах жасмина. [10]

5. Лаванды цветки

Lavender flower

1)Тонкослойная хроматография

Испытуемый раствор. К 0,5 г измельченного сырья (355) прибавляют 5 мл гексана Р, встряхивают в течение 5 мин и фильтруют. Раствор сравнения. 10 мкл линалола Р и 10 мкл линалилацетата Р растворяют в 5 мл гексана Р.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля Р.

Подвижная фаза: этилацетат Р -- толуол Р (5:95, об/об).

Наносимый объем пробы: по 10 мкл в виде полос.

Фронт подвижной фазы: не менее 15 см от линии старта.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку опрыскивают раствором анисового альдегида Р, выдерживают при температуре от 100°С до 105°С в течение 5--10 мин. Просматривают при дневном свете.

Результаты: ниже приведена последовательность зон хроматограмм раствора сравнения и испытуемого раствора. На хроматограмме испытуемого раствора могут обнаруживаться и другие зоны.

Таблица 4 - Последовательность зон хроматограмм раствора сравнения и испытуемого раствора

Верх хроматографической пластинки
Линалилацетат: зона серовато-синего цвета Линалол: зона серовато синего цвета	Зона серовато-синего цвета (линалилацетат) Зона красновато- фиолетового цвета (эпоксидигидрокариофиллен) Зона серовато-синего цвета (линалол)
Раствор сравнения	Испытуемый раствор

2) Просматривают хроматограммы, полученные в испытании «Другие виды и разновидности лаванды». Пять основных пиков на хроматограмме испытуемого раствора по времени удерживания соответствуют пяти основным пикам на хроматограмме раствора сравнения, в том числе пикам с наибольшими площадями (линалол и линалилацетат).

3) Газовая хроматография

Испытуемый раствор. 0,2 мл раствора эфирного масла в ксилоле, полученного при количественном определении эфирного масла, разводят гексаном Р до объема 5 мл, прибавляют 1 г натрия сульфата безводного Р, встряхивают и собирают надосадочную жидкость.

Раствор сравнения. 0,1 г лимонена Р, 0,2 г цинеола Р, 0,05 г камфоры Р, 0,4 г линалола Р, 0,6 г линалилацетата Р и 0,2 г б-терпинеола Р растворяют в 100 мл гексана Р.

Условия хроматографирования:

- колонка кварцевая капиллярная длиной 60 м и внутренним диаметром 0,25 мм, покрытая слоем макрогола 20 000 Р;

- детектор: пламенно-ионизационный;

- газ-носитель: гелий для хроматографии Р;

- скорость газа-носителя: 1,5 мл/мин;

- деление потока: 1:100;

- температура:

Таблица 5 - Температурные условия хроматографирования цветков Лаванды

	Время (мин)	Температура (°С)
Колонка	0--15 15--70	70 70 > 180
Блок ввода проб		220
Детектор		220

Порядок выхода пиков: лимонен, цинеол, камфора, линалол, линалилацетат и б-терпинеол.

Пригодность хроматографической системы:

- количество теоретических тарелок: не менее 30 000 для пика лимонена при температуре 110°С;

- разрешение: не менее 1,5 между пиками лимонена и цинеола.

По временам удерживания компонентов раствора сравнения определяют состав испытуемого раствора. На хроматограмме испытуемого раствора отмечают шесть пиков, соответствующих пикам на хроматограмме раствора сравнения. Пики гексана и ксилола не учитывают.

На хроматограмме испытуемого раствора площадь пика камфоры должна составлять не более 1% от суммы площадей всех пиков.[8]

6. Тимьяна трава

Thymi herba

1)Тонкослойная хроматография

Испытуемый раствор. К 1,0 г измельченного сырья (355) прибавляют 5 мл метиленхлорида Р, встряхивают в течение 3 мин и фильтруют через бумажный фильтр с 2 г натрия сульфата безводного Р. Раствор сравнения. 5 мг тимола Р и 10 мкл карвакрола Р растворяют в 10 мл метиленхлорида Р.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля F 254 Р.

Подвижная фаза: метиленхлорид Р. Наносимый объем пробы: по 20 мкл в виде полос. Фронт подвижной фазы: не менее 15 см от линии старта.

Высушивание: на воздухе.

Проявление А: просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Результаты А: ниже приведена последовательность зон хроматограмм раствора сравнения и испытуемого раствора.

Таблица 6 - Последовательность хроматограмм двух растворов

Верх хроматографической пластинки
-------- -------- Тимол:зона поглощения	-------- -------- Зона поглощения Зона поглощения (тимол) -------- -------- Зоны поглощения
Раствор сравнения	Испытуемый раствор

Проявление В: пластинку опрыскивают раствором анисового альдегида Р, расходуя 10 мл на квадратную пластинку со стороной 200 мм, и нагревают в течение 10 мин при температуре от 100°С до 105°С.

Результаты В: ниже приведена последовательность зон хроматограмм раствора сравнения и испытуемого раствора. На хроматограмме испытуемого раствора в нижней трети могут обнаруживаться и другие зоны.

Таблица 7- Интенсивность зон тимола и карвакрола зависит от вида растения.

Верх хроматографической пластинки
Тимол: зона коричневато-розового цвета Карвакрол: зона бледно-фиолетового цвета	Зона коричневато-розового цвета (тимол) Зона бледно-фиолетового цвета (карвакрол) Зона серовато-розового цвета Зона фиолетового цвета (цинеол и линалол) Зона серовато-коричневого цвета (борнеол) Зона синевато-фиолетового цвета Интенсивная зона фиолетового цвета
Раствор сравнения	Испытуемый раствор

2) Просматривают хроматограммы, полученные в разделе «Количественное определение. Определение содержания тимола и карвакрола». Характерные пики на хроматограмме испытуемого раствора по времени удерживания соответствуют характерным пикам на хроматограмме раствора сравнения.

Определение содержания тимола и карвакрола.

3) Газовая хроматография: определение проводят методом внутренней нормализации.

Испытуемый раствор. Полученное при количественном определении эфирное масло фильтруют через бумажный фильтр с небольшим количеством безводного сульфата натрия Р и доводят гексаном Р до объема 5,0 мл, ополаскивая прибор для определения эфирного масла и фильтр с сульфатом натрия этим же растворителем.

Раствор сравнения. 0,20 г тимола Р и 50 мг карвакрола Р растворяют в гексане Р и доводя до объема 5,0 мл этим же растворителем.

Условия хроматографирования:

- колонка кварцевая капиллярная длиной 30--60 м и диаметром 0,25 мм, покрытая слоем макрогола 20 000 Р (толщина слоя 0,25 мкм);

- детектор: пламенно-ионизационный;

- газ-носитель: азот для хроматографии Р или гелий для хроматографии Р;

- скорость газа-носителя: 1-2 мл/мин;

- деление потока: 1:100;

- объем вводимой пробы: 0,2 мкл;

- температура:



Таблица 8 - Температурные условия хроматографирования

	Время (мин)	Температура (°С)
Колонка	0--45	40 > 220
Блок ввода проб		190
Детектор		210

Порядок выхода пиков: тимол, карвакрол.

Пригодность хроматографической системы: раствор сравнения:

- разрешение: не менее 1,5 между пиками тимола и карвакрола.

По временам удерживания компонентов раствора сравнения определяют состав испытуемого раствора. Рассчитывают содержание каждого из компонентов в процентах (пренебрегают пиком гексана). [9]

7. Фенхеля горького плоды

FoenicuIi amari fructus

1) Тонкослойная хроматография.

Испытуемый раствор. К 0,3 г свежеизмельченного сырья (1400) прибавляют 5,0 мл метиленхлорида Р и встряхивают в течение 15 мин. Фильтруют и осторожно выпаривают фильтрат досуха на водяной бане при температуре 60°С. Остаток после выпаривания растворяют в 0,5 мл толуола.

Раствор сравнения. 50мкл анетола Р и10мкл фенхона Р растворяют в 5,0 мл гексана Р.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля GF 254 Р.

Подвижная фаза: гексан Р -- толуол Р (20:80, об/об).

Наносимый объем пробы: по 10 мкл в виде полос длиной 20 мм и шириной 3 мм.

Фронт подвижной фазы: не менее 10 см от линии старта.

Высушивание: на воздухе.

Проявление А: просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм.

РезультатыА: на хроматограммах в центральной части обнаруживается зона поглощения, соответствующая анетолу.

Проявление В: пластинку опрыскивают кислотой серной Р и нагревают при температуре 140°С в течение 5--10 мин. Просматривают при дневном свете.

Результаты В: на хроматограмме раствора сравнения в нижней трети обнаруживается зона желтого цвета (фенхон) и в центральной части -- зона фиолетового цвета (анетол). На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживаются зоны, соответствующие по расположению и цвету зонам фенхона и анетола на хроматограмме раствора сравнения; в верхней трети -- зона красновато-коричневого цвета (терпены).

Определение содержания анетола и фенхона.

2) Газовая хроматография.

Испытуемый раствор. Смесь эфирного масла и ксилола Р, полученную при определении эфирного масла, разводят ксилолом Р до объема 5,0 мл, ополаскивая прибор для определения эфирного масла этим же растворителем.

Раствор сравнения (а). 5 мг фенхона Р и 5 мг анетола Р растворяют в 0,5 мл ксилола Р.

Раствор сравнения (b). 5 мг эстрагола Р растворяют в 0,5 мл ксилола Р.

Условия хроматографирования:

- колонка капиллярной длиной от 30 м до 60 м и внутренним диаметром 0,3 мм, покрытая слоем макрогола 20 000 Р;

- детектор: пламенно-ионизационный;

- газ-носитель: азот для хроматографии Р;

- скорость газа-носителя: 0,40 мл/мин;

- деление потока: 1:200;

- объем вводимой пробы: 1 мкл;

- температура.



Таблица 9 - Температурные условия хроматографирования

	Время (мин)	Температура (°С)
Колонка	0--4 4--26 26--41	60 60 > 170 170
Блок ввода проб		220
Детектор		270

Порядок выхода пиков: фенхон, анетол.

Содержание анетола и фенхона рассчитывают методом нормализации.[10]

8. Мяты перечной листья

Menthae piperitae folia

1)Тонкослойная хроматография.

Испытуемый раствор. К 0,2 г свежеизмельченного сырья прибавляют 2 мл метиленхлорида Р, встряхивают в течение нескольких минут и фильтруют. Фильтрат выпаривают досуха при температуре около 40°С, остаток растворяют в 0,1 мл толуола Р.

Раствор сравнения. 50 мг ментола Р, 20 мкл цинеола Р, 10 мг тимола Р и 10 мкл ментилацетата Р растворяют в толуоле Р и доводят до объема 10 мл этим же растворителем.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля GF 254 Р.

Подвижная фаза: этилацетат Р -- толуол Р (5:95, об/об).

Наносимый объем пробы: 10 мкл раствора сравнения и 20 мкл испытуемого раствора в виде полос.

Фронт подвижной фазы: не менее 15 см от линии старта.

Высушивание: на воздухе.

Проявление А: просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм.

Результаты А: на хроматограмме испытуемого раствора может обнаруживаться слабая зона поглощения (карвон, пулегон), расположенная немного ниже зоны тимола на хроматограмме раствора сравнения.

Проявление В: пластинку опрыскивают раствором анисового альдегида Р и нагревают при температуре от 100°С до 105°С в течение 5--10 мин. Просматривают при дневном свете. Результаты В: на хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются зоны в порядке увеличения значения Rf: в нижней трети -- зона от темно-синего до фиолетового цвета (ментол); зона от фиолетово-синего до коричневого цвета (цинеол); зона розового цвета (тимол); зона синевато-фиолетового цвета (ментилацетат). На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживаются: зона ментола (наиболее интенсивная); слабая зона цинеола; могут обнаруживаться светло-розовые, или синевато-серые, или серовато-зеленые зоны (карвон, пулегон, изоментон), расположенные между зонами цинеола и тимола на хроматограмме раствора сравнения; в средней части хроматограммы -- зона синевато-фиолетового цвета (ментилацетат) и непосредственно под ней -- зона зеленовато_синего цвета (ментон); зона красновато-фиолетового цвета (углеводороды), расположенная возле фронта подвижной фазы; обнаруживаются и другие менее интенсивно окрашенные зоны.[11]

2) Газовая хроматография. Эфирное масло получают методом перегонки с водяным паром. ГЖХ-анализ образцов эфирных масел выполняется на хроматографе «Цвет-800» с пламенно-ионизационным детектором с использованием стеклянной капиллярной колонки длиной 80 м (SSE-67) при линейном градиенте температуры от 50 до 220єС со скоростью 3є/мин в токе газа-носителя азота. Временем удерживания несорбирующегося газа считают время выхода пика метана. В качестве реперных компонентов для расчета обобщенных индексов удерживания (GI) используют н-алканы С7-С16, индексы удерживания которых принимают равными 100·n (индексы Ковача).[12]



9. Багульника Болотного побеги

Ledi palustris cormus

1)Тонкослойная хроматография.

Испытуемый раствор. К 20 мкл масла, полученного при количественном определении, прибавляют 1 мл толуола Р.

Раствор сравнения. 5 мг тимола Р и 10 мг ментола Р растворяют в 10 мл 96% спирта Р.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля Р.

Подвижная фаза: этилацетат Р -- толуол Р (5:95, об/об).

Наносимый объем пробы: 15 мкл испытуемого раствора и 20 мкл раствора сравнения в виде полос. Фронт подвижной фазы: не менее 13 см от линии старта. Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку опрыскивают раствором анисового альдегида Р, нагревают при температуре от 100°С до 105°С в течение 5--10 мин. Просматривают при дневном свете.

Результаты: на хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются синяя зона (ментол) в нижней части и над ней розовая зона (тимол).

На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживаются зона от фиолетового до красновато-фиолетового цвета немного выше пятна ментола на хроматограмме раствора сравнения (ледол), а также зона от фиолетового до красновато-фиолетового цвета немного выше пятна тимола на хроматограмме раствора сравнения (палюстрол). На хроматограмме испытуемого раствора могут обнаруживаться и другие зоны. [13]

2)Газовая хроматография.

Масло выделяют методом перегонкой с водяным паром. Водяной пар (100°С) пропускают через перегонный куб (12л) с сухим измельчённым сырьём в течение 8-12часов. В качестве приёмника применяют делительную воронку (1,5л), в ней же отделяют масло от флорентийской воды и хранят в темноте при температуре +2-12°С до момента приведения анализа.

Физико-химические характеристики определяют стандартными и общепринятыми методиками.[14]

Химический состав эфирных масел исследовали методом хромато-масс-спектрометрии на газовом хроматографе (Hewlett-Packard 5890/11) с квадрупольным масс-спектрометром (HP MSD 5971) в качестве детектора. Применяли 30-метровую кварцевую колонку HP-5 (сополимер 5%-дифенил-95%-диметилсилоксана) с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной плёнки неподвижной фазы 0,25 мм. Газ-носитель - гелий с постоянным потоком 1мл/мин. В хроматограф вводили 1мкл эфирного раствора. Температура испарителя 280°С. Температура колонки: 50°С (2мин), 50-200°С (4°С/мин), 200-280°С (20°С/мин), 280°С (5 мин). Температура интерфейса между газовым хроматографом и масс-селективным детектором 280°С. Температура источника ионов 173°С. Энергия ионизирующих электронов - 70эВ.

Содержание компонентов вычисляли по площади хроматографических пиков без использования корректирующих коэффициентов. Качественный анализ основан на сравнении времён удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными компонентов эталонных масел и чистых соединений, если они и имелись, и с данными библиотеки масс-спектрометрических данных Wiley 275 (275000 масс-спектров).[15]



Заключение

Впервые термин "хроматография" был использован российским биологом Михаилом Семеновичем Цветом.

Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены, количественно и качественно определены более 1000 индивидуальных компонентов.

Эфирные масла -- многокомпонентные смеси органических соединений, главным образом терпенов и их кислородных производных -- спиртов, альдегидов, кетонов, эфиров и др. (в ряде случаев преобладает один или нескольких компонентов). Терпены весьма реакционноспособны.

В настоящее время получили распространение газовая и жидкостная хроматография.

Принцип разделения веществ в газовой хроматографии - неодинаковое сродство веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке.

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) - это эффективный способ разделения и установления количественных отношений в составе эфирных масел.



Список использованных источников

1. История и определение хроматографического метода [Электронный ресурс] / Теория и практика хроматографии. - Май, 2009. - Режим доступа: http://www.chromatogramma.ru. - Дата доступа: 15.12.2012.

2. Царев, H.И. Практическая газовая хроматография/Н. И. Царев , В.И. Царев , И. Б. Катраков // Учебно-методическое пособие для студентов химического факультета по спецкурсу «Газохроматографические методы анализа».-- 2000. -?C.156.

3. Введение в хроматографический анализ: методические разработки для студентов V курса фармацевтического факультета / Нижегородская государственная медицинская академия. - Нижний Новгород, 2005.

4. Терпены [Электронный ресурс] / Химик» сайт о химии. - год. - Режим доступа: http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2/4392.html. - Дата доступа: 15.12.2012.

5. Жерносек, А.К. Аналитическая химия для будущих провизоров. Часть 1.Учебное пособие / А.К. Жерносек, И.Е. Талуть; Под ред. А.И. Жебентяева. - Витебск, ВГМУ, 2003. - 362 с.

6. Энциклопедия ароматических масел / Джулия Лоулесс. - Москва, 2000.

7. Грудзинская И. А. Семейство аронниковые, или ароидные (Araceae) // Жизнь растений. В 6-ти т. / Гл. ред. А. Л. Тахтаджян. -- М.: Просвещение, 1981. -- Т. 6. Цветковые растения. / Под ред. А. Л. Тахтаджяна. -- С. 466--493. -- 543 с. -- 300 000 экз.

8. Государственная Фармакопея Республики Беларусь. Т. 2: Общие и частные фармакопейные статьи / Центр экспертиз и испытаний в здравоохр.; под общ. ред. Г.В. Годовальникова. - Минск: Минск. гос. ПТК полиграфии, 2007.

9. Государственная Фармакопея Республики Беларусь. Т. 2: Общие и частные фармакопейные статьи / Центр экспертиз и испытаний в здравоохр.; под общ. ред. Г.В. Годовальникова. - Минск: Минск. гос. ПТК полиграфии, 2007. - 426-428 с.

10. Государственная Фармакопея Республики Беларусь. Т. 2: Общие и частные фармакопейные статьи / Центр экспертиз и испытаний в здравоохр.; под общ. ред. Г.В. Годовальникова. - Минск: Минск. гос. ПТК полиграфии, 2007. - 434-435с.

11. Государственная Фармакопея Республики Беларусь. Т. 2: Общие и частные фармакопейные статьи / Центр экспертиз и испытаний в здравоохр.; под общ. ред. Г.В. Годовальникова. - Минск: Минск. гос. ПТК полиграфии, 2007. - 382-383 с.

12. Леонтьев, В.Н. Газохроматографическая идентификация эфирных масел / В.Н. Леонтьев, А.Г. Шутова, Н.А. Коваленко. - Минск.

13. Государственная Фармакопея Республики Беларусь. Т. 2: Общие и частные фармакопейные статьи / Центр экспертиз и испытаний в здравоохр.; под общ. ред. Г.В. Годовальникова. - Минск: Минск. гос. ПТК полиграфии, 2007. - 305-306 с.

14. Государственная Фармакопея XI / Ред. Э.А. Бабаян, М.Д. Машковский, А.Н. Обоймакова и др. - М.: Медицина, 1987. - 335 с.

15. Танасиенко Ф.С. Эфирные масла. Содержание и состав в растениях / Ф.С. Танасиенко. - Киев, 1985. - 286с.

Размещено на Allbest.ru

...