Маркеры свободно-радикального повреждения биомолекул и активность антиоксидантных ферментов у больных раком легкого

Размещено на http://www.allbest.ru/

РЕФЕРАТ

на тему: «Маркеры свободно-радикального повреждения биомолекул и активность антиоксидантных ферментов у больных раком легкого»

Белоногов Р.Н., Титова Н.М., Кудряшова Е.В.,

Бородина Н.А., Шандрова Я.Ю.

Известно, что в патогенезе злокачественной трансформации важную роль играет свободно радикальное воздействие на клетки. При этом установлено, что изменения активности антиоксидантной системы (АОС) не только приводят к накоплению высокотоксичных интермедиатов и продуктов свободно радикального окисления (СРО), нарушающих общий гомеостаз организма, но и способствуют скорости деления опухолевых клеток. Повышенная продукция активных кислородных метаболитов макрофагами и нейтрофилами при хроническом воспалении бронхов также может привести к развитию бронхолегочной дисплазии с последующей злокачественной трансформацией. Однако выраженность и направленность изменений антиоксидантной системы и активности свободно радикального окисления при хронических заболеваниях легких с диспластическими изменениями изучены недостаточно. Между тем исследования такого рода необходимы, так как адекватная и эффективная поддержка данной защитной системы на стационарном уровне может быть осуществлена лишь на основе научно обоснованных представлений о состоянии антиоксидантной защиты организма онкологического больного.

В настоящее время окисленные формы белков рассматриваются как один из ранних маркеров оксидативного поражения клеток. Одним из методов оценки степени окислительной модификации белковых молекул является исследование количества входящих в их состав карбонильных групп.

Образование карбонильных производных белков может происходить при фрагментации белков по пути б-амидирования (рис.1) и окислении остатков глутаминовой кислоты (реакция 1), что ведет к образованию пептидов, N-концевая аминокислота в которых блокирована б-кетоацил производным. Прямое окисление остатков лизина, аргинина, пролина и треонина также может приводить к образованию карбонильных производных.

Реакция 1

Рис.1. Расщепление белковой цепи по диамидному (а) и б-амидному (b) путям

Не менее важное значение в образовании карбонильных групп имеют реакции белков с альдегидами (4-гидрокси-2-ноненаль, малоновый диальдегид) - продуктами перекисного окисления липидов (ПОЛ), либо с активными карбонильными производными (кетоамины, кетоальдегиды), возникающими в результате реакций расщепления сахаров или продуктов их окисления с остатками лизина (реакции гликирования и гликооксидации).

В связи с этим целью данной работы явилось определение содержания карбонильных групп белков (КПБ), продуктов ПОЛ - диеновых коньюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) и активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КТ) и глутатионпероксидазы (ГПО) у больных раком легкого. Материалы и методы. На базе торакального отделения Красноярского краевого онкологического диспансера было обследовано 149 больных мужского пола с раком легкого в возрасте 30-55 лет. Образцы здоровой и опухолевой ткани легкого забирались во время оперативного лечения. Ткани легкого гомогенизировались на холоде в стеклянном гомогенизаторе. В качестве среды гомогенизации использовался 0,9%-ный раствор NaCl. Соотношение ткань/физ. раствор - 1:5. Приготовленные гомогенаты использовались для определения содержания белка, карбонильных производных белков, ДК, МДА и активности антиоксидантных ферментов. Определение содержания карбонильных групп белков проводили согласно метода, предложенного Levine [Levine, 1994]. Метод основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенил гидразином (2,4-ДФГ) с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразонов (ДНФ-производные). Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали спектрофотометрически при длине волны 370 нм. Уровень карбонильных групп окисленных белков рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинции, равный 21,0 мМ^-1 х см^-1 для ДНФ-производных. Метод определения МДА основан на взаимодействии с 2-тиобарбитуровой кислотой, в результате которого образуется хроматоген, с максимумом поглощения при длине волны 532 нм [Федорова и др., 1983].

Определение активности супероксиддисмутазы осуществляли с помощью ингибирования реакции автоокисления адреналина в присутствии СОД. Об его автоокислении судили по динамическому нарастанию поглощения при длине волны 347 нм, обусловленному накоплением продукта окисления, не описанного ранее в литературе, и опережающего по времени образование адренохрома [Сирота, 1999]. Метод определения активности каталазы основан на образовании окрашенного в желтый цвет комплекса неразрушенного в ходе каталазной реакции пероксида водорода с молибдатом аммония, интенсивность окраски которого регистрировалась на ФЭКе при длине волны 400 нм [Королюк и др., 1988].

Активность глутатионпероксидазы определяли по скорости окисления глутатиона в присутствии трет-бутилгидропероксида. Метод основан на взаимодействии восстановленного глутатиона с дитионитробензойной кислотой с образованием окрашенного продукта - тионитрофенильного аниона [Beutler, 1977]. Интенсивность окраски определяли спектрофотометрически, при длине волны 412 нм. Для определения содержания белка использовался микробиуретовый метод [Кочетов, 1971]. Предварительно строился калибровочный график по стандартному раствору бычьего сывороточного альбумина.

Результаты и обсуждение. Полученные нами результаты по содержанию КПБ, ДК, МДА и активности антиоксидантных ферментов в общей группе больных раком легкого приведены в таблице 1. Содержание основных маркеров оксидативного поражения клеток - ДК, МДА и КПБ в раковой ткани существенно снижено по сравнению со здоровой тканью. Уровень ДК и МДА в общей группе понижен на 27%, уровень КПБ - на 36%. Так же снижается активность СОД и каталазы. Активность СОД уменьшается на 33%, по сравнению с нормой, активность каталазы - на 41%. Активность ГПО общей группе больных, напротив, возрастает и составляет 178%, относительно активности в здоровой ткани.

белок липид больной антиоксидантный

Таблица 1. Содержание маркеров окислительной модификации белков и липидов и активность антиоксидантных ферментов в здоровой и раковой ткани легкого (общая группа больных)

В зависимости от гистологического строения опухолевой ткани легкого были получены следующие результаты. Содержание карбонильных производных при ПКРЛ снижено на 37%,, при АКЛ - на 42% и при МКРЛ - на 25%, по сравнению с клетками здоровой ткани легкого (рис 2.), наблюдается и в изменении содержания МДА и диеновых коньюгатов (рис 3,

Рис. 2. Содержание карбонильных производных белков в тканях легкого в зависимости от гистологического типа рака легкого

Подобная тенденция при различных гистологических типах рака легкого 4). Концентрация МДА при ПКРЛ снижена на 30%, при АКЛ - на 28% и при МКРЛ - на 18%. Концентрация диеновых коньюгатов снижается на 33%, 26% и 14% соответственно.

Рис. 3. Содержание МДА в тканях легкого в зависимости от гистологического типа рака легкого

Рис. 4. Содержание диеновых коньюгатов в тканях легкого в зависимости от гистологического типа рака легкого

В состоянии ферментативного звена антиоксидантной системы при различных гистологических формах заболевания также были выявлены различия. Наименьшие изменения были найдены при мелкоклеточном раке легкого, характеризующегося наиболее злокачественным течением среди всех остальных типов. Активность СОД при ПКРЛ снижена на 26%, при АКЛ - на 39% и при МКРЛ - на 41%; активность каталазы - на 27%, 39% и 58% соответственно. Активность ГПО во всех случаях выше нормы, так при ПКРЛ она повышена на 84%, при АКЛ - на 49%, и при МКРЛ - на 45%.

Рис. 5. Активность антиоксидантных ферментов в тканях легкого в зависимости от гистологического типа рака легкого

Полученные результаты свидетельствуют о снижении интенсивности окислительных процессов в опухолевой ткани по сравнению со здоровой тканью легкого. Поскольку механизм образования КПБ в некоторой степени связан с процессами ПОЛ, нами было выявлено, что динамика изменения концентрации продуктов ПОЛ - малонового альдегида и диеновых коньюгатов аналогична динамике изменения концентрации КПБ как в общей группе больных, так и при различных гистологических типах рака легкого.

В отличие от этого, различные ферменты антиоксидантной системы ведут себя по-разному. Так, активность каталазы и СОД существенно снижена в пораженной раком ткани, однако активность ГПО, наоборот, в значительной мере превышает нормальные показатели. Поскольку содержание окисленных белков понижено, то, вероятно, уменьшение ферментативной активности каталазы и СОД не связано с их свободно-радикальным повреждением. Каталаза и СОД работают в паре, и каталаза удаляет образующийся в результате супероксиддисмутазной реакции Н₂О_2, который является ингибитором СОД, следовательно, можно сделать предположение о том, что снижение уровня активности каталазы способствует накоплению пероксида водорода, что, соответственно, приводит к инактивации СОД. В этих условиях главную роль в антиоксидантной защите начинает играть глутатионовая система, и мы можем видеть это, на примере повышения активности ГПО. ГПО служит защитой от образования липоперекисей, тем самым снижая и образование продуктов процесса перекисного окисления липидов, таких как диеновые коньюгаты и МДА.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о повышенной резистентности опухолевой ткани по отношению к процессам свободно-радикального повреждения и искусственное усиление антиоксидантной системы, например, путем введения антиоксидантных препаратов, может иметь негативные последствия и способствовать прогрессированию злокачественного заболевания.

Размещено на Allbest.ru