Размещено на http://www.allbest.ru/

2

• Содержание
• Введение
• 1. Обзор литературы
• 1.1 Строение и физико-химические свойства лактоферрина
• 1.1.1 Строение молекулы лактоферри
• 1.1.2 Связывание ионов железа
• 1.1.3 Олигомерные формы лактоферрина
• 1.1.4 Взаимодействие лактоферрина с лигандами и его изоформы
• 2. Экспериментальная часть
• 2.1 Теоретические основы использованных методов и аппаратурное обеспечение
• 2.1.1 Методы рентгеновской и оптической дифракции
• 2.1.2 Абляция
• 2.1.3 Гель-хроматография
• 2.2 Материалы и условия экспериментов
• 2.2.1 Использованные реактивы и материалы
• 2.2.2 Подготовка образцов лактоферрина для анализа
• 2.2.3 Условия проведения гель-хроматографии белков
• 2.2.4 Условия проведения экспериментов по анализу лф методом малоуглового рентгеновского рассеяния (мурр)
• 2.2.5 Измерение индикатрис светорассеяния
• 2.2.6 Условия проведения экспериментов по анализу лф методом абляции
• 3. Результаты
• 3.1 Анализ олигомерных форм лф методом гель-хроматографии
• 3.2 Анализ олигомеров лф методом светорассеяния
• 3.3 Анализ олигомеров лф методом абляции
• 3.4 Обсуждение результатов
• Основные результаты
• Введение

Небольшой по молекулярной массе (76-80 кДа) белок лактоферрин (ЛФ) содержится в высокой концентрации в молозиве и молоке млекопитающих (от 1 до 7 мг/мл), а также является мажорным белком всех известных барьерных жидкостей, таких как слеза, слюна, секреты носовых желез, плазма крови и т.д. [1].

Известно, что ЛФ является белком острой фазы и неспецифической защиты человека от различного рода поражений [3, 4]. Появление очагов поражения приводит к активации синтеза ЛФ и повышению его концентрации в эпителиальных секретах и барьерных жидкостях человека, а также непосредственно в очаге поражения.

Лактоферрин является едва ли не единственным примером белка с исключительно уникальным набором биологических свойств различного характера. Будучи представителем семейства трансферриновых белков, он не только регулирует концентрацию ионов железа в крови и секретах, но и обладает ярко выраженным антимикробным действием вследствие конкуренции с мембранными рецепторами бактерий за атомы железа. Кроме того, он регулирует процессы воспаления. Одним из способов регуляции процессов воспаления считается способность ЛФ связываться с липополисахаридными составляющими стенки бактериальных клеток, которые являются основными медиаторами воспаления при бактериальных инфекциях. Апо-ЛФ, связывая свободные ионы железа в очаге воспаления, ингибирует образование гидроксильных радикалов из перекиси водорода и *О?2 , проявляя свойство антиокислительного агента. ЛФ обладает выраженными антивирусным и антипаразитарным действием.

Благодаря перечисленным выше и ряду других свойств, лактоферрин считается одним из важнейших защитных факторов молока и барьерных жидкостей человека. Он участвует в защитных реакциях организма и регулирует функции иммунокомпетентных клеток, а так же ингибирует продукцию цитокинов. Одно из наиболее интересных свойств лактоферрина - это взаимодействие с полианионами: гепарином, ДНК и РНК. Обнаружена способность белка гидролизовать РНК и ДНК, а также наличие в молекуле белка структурных мотивов, подобных активному центру РНКазы А. Последние исследования показали, что лактоферрин легко проходит через внешнюю и ядерную мембраны клеток, проникает в ядра клеток, связывается со специфическими последовательностями ДНК и активирует процессы транскрипции. Строгая видовая и, в то же время, широкая межорганная специфичность лактоферрина говорят о неоднозначности биологической роли белка в клетке. Благодаря своим разнообразным свойствам, лактоферрин в последнее время является объектом активных исследований.

Одним из возможных объяснений исключительной полифункциональности лактоферрина может быть его способность олигомеризоваться и образовывать комплексы с другими белками, а также ДНК, РНК, АТР и олиго- и полисахаридами, что может вести к изменению и расширению спектра его биологических функций.

Целью данной работы было исследование образования олигомерных форм лактоферрина в нейтральном буфере в присутствии и отсутствии солей, а также влияния природных лигандов белка (АТР, АМР и олигосахарида) на процессы его олигомеризации. Для исследования олигомерных форм лактоферрина в работе использовано четыре метода: гель-хроматография, светорассеяние (CP), малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (МУРР), а так же впервые сделана попытка использования для исследования олигомеров субмиллиметровой лазерной абляции. Такой набор методов позволяет оценить долю олигомеров любого размера, проследить кинетику образования олигомеров, а так же выделять отдельные олигомерные формы.

лактоферрин молоко молекула

1. Обзор Литературы

1.1 Строение и физико-химические свойства лактоферрина

1.1.1 Строение молекулы лактоферрина

Белки семейства трансферринов, которые содержатся в крови, контролируют уровень железа у высших животных путем прочного, но обратимого связывания ионов железа [. Birgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331.]. Лактоферрин (ЛФ) является одним из белков этого семейства, он был впервые открыт в женском молоке в конце 30-х годов. В дальнейшем изучению его строения и физиологической роли было посвящено значительное число исследований, которые показали, что ЛФ содержится в плазме крови, нейтрофильных лейкоцитах и является одним из основных белков практически всех экзокринных секретов млекопитающих [. Birgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331.]. В наибольшей концентрации ЛФ содержится в молозиве человека (до 6 - 7 мг/мл), в процессе лактации этот показатель в молоке уменьшается до 1 мг/мл (Табл. 1) [. Levay, P.F., Viljoen, M. Lactoferrin: a general review. (1995) Haematologica., 80(3), 252-267.

Отт В.Д., Дюкарева С.В., Мельников О.Р. Лактоферрин и перспективы его использования в алиментарной профилактике анемий. (1993) Вопр. Питания, 1, 6-13.].

Таблица 1. Уровень ЛФ в различных жидкостях и тканях человека в норме*.

Жидкости и ткани	Концентрация ЛФ
Молозиво	5 - 7 мг/мл
Промежуточное молоко	3 - 4 мг/мл
Материнское молоко	1 - 3 мг/мл
Околоплодная жидкость	2 - 32 мкг/мл
Децидуальная оболочка матки	9 - 95 мкг/г белка
Амнион	2 - 37 мкг/г белка
Хорион	2 - 26 мкг/г белка
Трофобласт	5 - 35 мкг/г белка
Пуповина	<1 мкг/г белка
Бронхиальная слизь	35 мкг/мл
Слезная жидкость	2 - 3 мг/мл
Слюна	4 - 20 мкг/мл
Вагинальная слизь	4 - 200 мкг/мг белка
Семенная жидкость	0,1 - 0.2 мг/мл
Синовиальная жидкость	35 - 46 мкг/мл
Спинномозговая жидкость	10 - 12 мкг/мл**
Кровь	0,1 - 1,6 мкг/мл
Венозная плазма	0,12 мкг/мл
Капиллярная плазма	0,1 мкг/мл
Плазма при сепсисе	200 мкг/мл
Эмбриональная сыворотка	0,05 мкг/мл
Плазма новорожденного	0,27 мкг/мл
Нейтрофилы крови взрослого человека	1,2 - 15 мкг/106 нейтрофилов
Нейтрофилы крови новорожденного	12 - 30 мкг/107 нейтрофилов

*Концентрация белка в некоторых жидкостях, таких как амнион, слюна, синовиальная жидкость в случае инфекции увеличивается в 2-10 раз [. Weinberg, E.D. Human lactoferrin: a novel therapeutic with broad spectrum potential. (2001) J. Pharm. Pharmacol. 53(10), 1303-10.].

**при бактериальных менингитах, в нормальном состоянии ЛФ не детектируется

ЛФ представляет собой гликопротеид с мол. массой 76 000 - 80 000 дальтон [1-3]. Белок существует в двух формах - железонасыщенной (холо-ЛФ, 80 кДа) и железоненасыщенной (апо-ЛФ, 75 - 76,4 кДа). По аминокислотному составу и мол. массе он сходен с трансферрином (73,8 - 86 и 75 - 76,6 кДа холо- и апо -формы, соответственно). Аминокислотные составы ЛФ и трансферрина имеют 59% и 49% гомологии между двумя соответствующими доменами, входящими в состав этих белков [. Metz-Boutigue, M.H., Jolles, J., Mazurier, J., Schoentgen, F, Legrand, D., Spik, G., Montreuil, J., and Jolles, P. Human lactotransferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins. (1984) Eur. J. Biochem., 145, 659.]. Вторичные и третичные структуры этих двух белков также сходны между собой. ЛФ отличается от трансферрина антигенной структурой, углеводными компонентами, изоэлектрической точкой, растворимостью в воде и расположением железосвязыващих участков и сайтов гликозилирования этих белков.

ЛФ образован одной полипептидной цепью, которая содержит 703 аминокислотных остатка. На основании данных рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.0 A была предложена модель трехмерной структуры ЛФ, согласно которой полипептидная цепь свернута в два гомологичных домена, называемых N- и C-долями, содержащими 1-338 и 339-703 остатки соответственно, а их концы соединены короткой -спиралью (рис. 1). Каждая доля белка состоит из двух доменов: N1, N2 и C1, C2. Третичные структуры железонасыщенного и железоненасыщенного ЛФ различны; для апо-ЛФ характерна “открытая” конформация N-доли и “закрытая” конформация С-доли, а для Fe-ЛФ характерна закрытая конформация обеих долей (рис. 1) [. Jameson, G.B., Anderson, B.F., Norris, G.E., Thomas, D.H., Baker, E.N. Structure of human apolactoferrin at 2.0 A resolution. Refinement and analysis of ligand-induced conformational change (1998) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 54, 1319-1335.]. Между N- и C-долями наблюдается значительная степень гомологии: они имеют 125 одинаковых аминокислотных остатков, что составляет 37% гомологии [5].

Это привело к возникновению теории о копировании генов, когда 500 миллионов лет назад первоначальная молекула массой 40 кДа удвоилась и сформировала два гомологичных домена с молекулярной массой около 80 кДа [3]. Предполагают также, что ЛФ возник в процессе эволюции позже трансферрина.

Рис. 1. Структура апо-лактоферрина (железоненасыщенная форма) и Fe-ЛФ (железонасыщенная форма). Красным цветом показан сайт связывания полианионов - гепарина, липополисахаридов и хондриотинсульфата.

Углеводный компонент молекулы белка состоит из остатков сиаловой кислоты, фукозы, гексозы и N-ацетилглюкозоамина, которые образуют связи с остатками аспарагина 137 и 478 белковой части ЛФ [. Legrand, D., Salmon, V., Coddeville, B., Benaissa, M., Plancke, Y., Spik, G. Structural determination of two N-linked glycans isolated from recombinant human lactoferrin expressed in BHK cells (1995) FEBS Lett., 365(1), 57-60.]. ЛФ содержит два сайта гликозилирования по одному на N2 и C2 доменах, но степень гликозилирования белка может быть различной [. Van Berkel, P.H., van Veen, H.A., Geerts, M.E., de Boer, H.A., Nuijens, J.H. Heterogeneity in utilization of N-glycosylation sites Asn624 and Asn138 in human lactoferrin: a study with glycosylation-site mutants (1996) Biochem. J., 319, 117-122.]. Именно поэтому мол. масса белка варьирует в диапазоне 76-80 кДа. Показано, что первичная структура гликозидных остатков ЛФ плазмы крови идентична углеводному компоненту ЛФ молока, за исключением двух остатков сахаров, связанных с белком N-гликозидной связью. Функция этих углеводных остатков точно не определена, однако их удаление не влияет на такие функции ЛФ, как связывание рецепторов [3]. ЛФ демонстрирует поразительную устойчивость к действию трипсина и трипсин - подобных протеаз, что обеспечивает сохранение целостности молекул белка в желудке. Было показано, что устойчивость ЛФ к деградации протеазами и при низких значениях рН обусловлена высокой степенью гликозилирования белка [3, . Van Berkel, P.H., Geerts, M.E., van Veen, H.A., Kooiman, P.M., Pieper, F.R., de Boer, H.A., Nuijens, J.H. Glycosylated and unglycosylated human lactoferrins both bind iron and show identical affinities towards human lysozyme and bacterial lipopolysaccharide, but differ in their susceptibilities towards tryptic proteolysis (1995) Biochem. J., 312, 107-114.]. Железонасыщенная форма ЛФ более устойчива к протеолизу, чем апо-форма белка [3]. ЛФ относится к щелочным белкам, значение его изоэлектрической точки составляет 8,7 [. Moguilevsky, N., Retequi, L., Masson, P. . Comprasion on human lactoferrins from milk and neutrophilic leucocytes. Relative molecular mass, isoelectric point, iron-binding properties and uptake by the liver. (1985) Biochem. J., 229, 353-359.].

1.1.2 Связывание ионов железа

Каждая молекула белка может обратимо связывать два иона трехвалентного железа или ионы цинка, меди, магния и других металлов [3]. Причем центры связывания в каждой из двух белковых глобул, входящих в молекулу ЛФ, локализованы ближе к междоменной щели. В этих центрах железо координационно связано с двумя остатками тирозина, одним гистидином и одним остатком аспарагиновой кислоты [. Shongwe, M.S., Smith, C.A., Ainscough, E.C., Baker, H.A., Brodie, A.M., Baker, E.N. Anion binding by human lactoferrin: results from crystallographic and physicochemical studies. (1992) Biochem. J., 31, 4451-4458. ]. Показано, что ЛФ участвует не только в транспорте ионов железа, цинка и меди, но и в регуляции их всасывания [. Davidson, L. A., and Lonnerdal, B. Fe-saturation and proteolysis of human lactoferrin: effect on brush-border receptor-mediated uptake of Fe and Mn. 1989 Dec;257(6 Pt 1):G930-4. ]. Наличие непрочно связанных ионов цинка и меди не влияет на железосвязывающую функцию ЛФ, а фактически даже усиливает ее. ЛФ образует с железом комплекс красноватого цвета. Одновременно с фиксацией ионов металла в железосвязывающем центре белка происходит фиксация аниона, в физиологических условиях это карбонат или бикарбонат ион, который с помощью электростатических взаимодействий связан с остатком аргинина. Присутствие аниона необходимо для прочного связывания железа с ЛФ, так как он нейтрализует положительный заряд катиона металла [3].

Сродство ЛФ к железу (Кd ~ 10^-24 M) в ~300 раз выше, чем сродство трансферрина [. Mazurier J., SpikG. Comparative study of the iron-binding properties of human transferring. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin. 1980 Biochim. Biophys. Acta, 629, 399-408.]. Кроме того, показано, что в слабокислой среде сродство ЛФ к железу повышается, что и облегчает переход металла с трансферрина на ЛФ при воспалительных процессах, когда рН тканей снижается за счет накопления молочной и других кислот [. Sousa, M., Brock, J.H., Iron in immunity. Cancer and Inflammation (1989) John Wiley & Sons.]. Степень насыщения железом нативного ЛФ в женском молоке составляет по оценкам разных авторов от 10 до 30% [13, 14].

1.1.3 Олигомерные формы лактоферрина

Как в плазме крови, так и в секреторных жидкостях ЛФ может существовать в виде различных олимерных форм от мономера, до тетрамера. Показано [14], что белок обнаруживает резко выраженную тенденцию к полимеризации in vitro и in vivo, и при высоких концентрациях преобладают олигомерные формы ЛФ. Кроме того, с помощью метода гель-хроматографии рядом авторов было обнаружено, что доминирующей формой ЛФ в физиологических условиях является тетрамер [. Bennett, R.M., Bagby, G.C., Davis, J. (1981) Calcium-dependent polymerization of lactoferrin Biochem. Biophys. Res. Commun., 101(1), 88-95., . Bagby, G.C.Jr., Bennett, R.M. Feedback regulation of granulopoiesis: polymerization of lactoferrin abrogates its ability to inhibit CSA production (1982) Blood, 60(1), 108-112., . Mantel, C., Miyazawa, K., Broxmeyer, H.E. Physical characteristics and polymerization during iron saturation of lactoferrin, a myelopoietic regulatory molecule with suppressor activity (1994) Adv. Exp. Med. Biol., 357, 121-132.]; соотношение мономер: тетрамер при концентрации белка 10^-5 М составляет 1 : 4. Авторы работ [15, 16] также предположили, что олигомерное состояние ЛФ определяется концентрацией данного белка в среде. Кроме того, по их мнению, полимеризация ЛФ строго зависела от присутствия ионов Ca²⁺. В присутствии ионов кальция и при концентрации белка менее 10^-10 - 10^-11 M авторы наблюдали преобладание мономерной формы белка. При концентрациях ЛФ более 10^-9 - 10^-10 M происходил переход в тетрамерную форму. Интересно отметить, что титр ЛФ в крови соответствует величине именно этой “переходной концентрации”, и, таким образом, ЛФ в крови должен быть представлен как в виде мономера, так и тетрамера. Причем авторы не принимали во внимание существование прочих (димерных и тримерных) форм белка. Эти же исследователи обнаружили, что ряд функциональных свойств ЛФ определяется его олигомерным состоянием. Так, ЛФ в виде мономера способен к прочному связыванию с ДНК и регуляции процессов гранулопоэза, а тетрамерная форма не связывает ДНК [15, 16].

Авторами работы [. Rosenmund, A., Kuyas, C., Haeberli, A. Oxidative radioiodination damage to human lactoferrin. (1986) Biochem. J., 240, 239-245.] при определении олигомерного состояния ЛФ методом гель-хроматографии обнаружена только мономерная форма белка при нанесении на колонку 1 мг белка и около 10 % тетрамерной формы при нанесении 4 мг ЛФ. Причем тетрамер присутствовал только при анализе железонасыщенной фракции белка. Кроме того, SDS-электрофорез в восстанавливающих условиях показал, что только 30 % тетрамерной формы переходит в мономер, что, по их мнению, говорит о ковалентных межмолекулярных связях, формирующихся в процессе полимеризации. Тем не менее, природа межсубъединичных связей олигомера ЛФ до настоящего времени не выяснена, а ковалентных связей между мономерами ЛФ не обнаружено.

Следует отметить, что в рассмотренных выше (и ниже) работах для анализа олигомерного состояния ЛФ авторы использовали метод гель-хроматографии и различные сорбенты полисахаридной природы. Интересно, что ЛФ эффективно взаимодействует с такими носителями и эффективность взаимодействия различных олигимерных форм может существенно зависеть как от их олигомерного состояния, так и конформации различных форм ЛФ [19]. В следствие этого, место выхода олигомерных форм ЛФ при гель-хроматографии может не соответствовать их истинным мол. массам. Так, например, в работе [. Semenov, D.V., Kanyshkova, T.G., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Human milk lactoferrin binds ATP and dissociates into monomers. (1999) Biochem. Mol. Biol. Int., 47(2), 177-84.] было показано, что в отсутствии соли в высокой концентрации (1 М) ЛФ может «залипать» на таких носителях как Sephadex и элюироваться с колонки за времена, соответствующие высокоолигомерному состоянию. Добавление АТР к ЛФ привело к смещению пика белка при гель-хроматографии в место выхода между мономерной и димерной формами белка [19]. Было сделано предположение, что взаимодействие ЛФ с АТР приводит к диссоциации его олигомерных форм. Однако, как будет показано ниже, ЛФ связывается не только с АТР, но и различными полисахаридами, включая сорбенты, используемые при гель-хроматографии. Поэтому нельзя исключать, что обнаруженный эффект АТР может быть связан с уменьшением сродства ЛФ к полисахаридным матрицам под действием АТР, что приводит к уменьшению времени выхода ЛФ с сорбента и ошибочным заключениям об его олигомерном состоянии.

Кроме того, большинство исследователей не принимают во внимание олигомерную организацию белка, рассматривая его a priori как мономер с молекулярной массой 76 кДа. Есть все основания полагать, что в организации олигомерного состояния белка участвуют слабые нековалентные взаимодействия - преимущественно гидрофобные и электростатические контакты боковых групп остатков аминокислот молекулы ЛФ и, возможно, гликозидных остатков белка.

1.1.4 Взаимодействие лактоферрина с лигандами и его изоформы

Одним из фундаментальных свойств ЛФ является его способность связывать полианионы типа гепарина, ДНК и РНК. Показано, что взаимодействие ЛФ с гепарином и другими полианионами имеет электростатическую природу [. Van Berkel, P.H., Geerts, M.E., van Veen, H.A., Mericskay, M., de Boier, H., Nuijens, J.H. N-terminal stretch Arg2, Arg3, Arg4 and Arg5 of human lactoferrin is essential for binding to heparin, bacterial lipopolysaccharide, human lysozyme and DNA. (1997) Biochem. J., 328, 145-151)]. Ф. Фурманским и соавторами [. He, J., Furmanski, P. Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA. (1995) Nature, 373, 721-724.] было установлено, что связывание белка с ДНК может иметь специфический характер, они обнаружили три специфические последовательности ДНК, к которым белок проявляет повышенное сродство: GGCACTT(G/A)C, TAGA(A/G)GATCAAA и ACTACAGTCTACA.

Недавние исследования показали, что в случае специфических последовательностей ДНК, ЛФ обладает двумя сайтами связывания [. Kanyshkova, T.G., Semenov, D.V., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with different affinities. (1999) FEBS Lett., 451, 235-237]. Один из них является высокоаффинным (Kd = 8.0·10^-9 М), второй сайт связывает ДНК с гораздо меньшим сродством (Kd ~ 1.0·10^-3 М). Показано, что высокоаффинный сайт локализован в N-концевой части молекулы белка, аналогично полианион-связывающему сайту ЛФ и антибактериальному домену. Взаимодействие ЛФ с гепарином и тРНК ингибировало связывание ДНК с белком. Это свидетельствует о том, что ДНК-связывающий сайт совпадает или частично перекрывается с полианион-связывающим сайтом и антибактериальным доменом ЛФ [22].

В работах [19, . Babina S.E., Nevinsky G.A. Lactoferrin interacts with nucleotides. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. 23(6&7), 1043-1046, . Georgy A. Nevinsky and Svetlana E. Babina. Human lactoferrin and its polyfunctional biological functions. In “Protein Structure. Kaleidoscope of Structural Properties and Functions” (Ed. V. N. Uversky), Research Signpost, 2003, 499-530] было показано, что ЛФ взаимодействует с АТР и другими нуклеотидами. С помощью метода аффинной модификации было установлено, что АТР связывающий центр ЛФ локализован в С-концевой части белковой молекулы [19].

Ф. Фурманским и соавторами [. Furmanski, P., Li, Z.P., Fortuna, M.B., Swamy, C.V., Das, M.R. Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron-binding capacity (1989) J. Exp. Med., 170, 415-429., . Furmanski, P., Li, Z.P. Multiple forms of lactoferrin in normal and leukemic human granulocytes. (1990) Exp. Hematol. 18(8), 932-935.] было показано, что ЛФ как гранулоцитов, так и молока человека представлен тремя изоформами, которые проявляют различное сродство к сорбенту Blue Sepharose и могут быть эффективно разделены с помощью этого сорбента. Причем только одна из изоформ (ЛФ-), в отличие от двух других, способна связывать ионы железа. Все три изоформы белка проявляют сходные физические, химические и антигенные характеристики (молекулярная масса, изоэлектрическая точка, устойчивость к протеолитическому расщеплению). Однако оказалось, что две изоформы, не связывающие ионы железа (ЛФ-в и ЛФ-г), обладают РНК-гидролизующей активностью.

В ряде работ [. Kanyshkova T.G., Babina S.E., Semenov D.V., Isaeva N., Vlassov A.V., Neustroev K.N., Kul'minskaya A.A., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Multiple enzymic activities of human milk lactoferrin. Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 3353-3361., . Бабина С.Е., Канышкова Т.Г., Бунева В.Н., Невинcкий Г.А. Лактоферрин - дезоксирибонуклеаза человеческого молока. Биохимия. 2004. 69(9), 1239-1250., . Бабина С.Е., Семенов Д.И., Бунева В.Н., Невинcкий Г.А. Лактоферрин грудного молока гидролизует рибонуклеозид-5'-трифосфаты. Молекуляр. биол., 2005. 39(3), 513-520.] хроматография ЛФ на Blue Sepharose была использована для анализа возможности наличия у белка каталитически активных изоформ белка с другими каталитическими активностями. При хроматографии ЛФ на Blue Sepharose достигнуто разделение белка на несколько отдельных субфракций с разным сродством к сорбенту, в результате которого происходит отделение от основного пика белка нескольких дополнительных пиков ЛФ. Все пики белка были исследованы в реакции расщепления ряда различных субстратов и показано, что кроме гидролиза РНК различные изоформы ЛФ активны а гидролизе ДНК (ДНКазаная), АТР (АТРазная), олиго- и полисахаридов (амилолитическая), а также отщеплении 5'-концевого фосфотной группы олигонуклеотидов (5'-фосфатазная активность). Положение пиков различных активностей на профиле хроматографии в основном не совпадало, но некоторые пики ЛФ обладали несколькими ферментативными активностями. Субстратная специфичность ЛФ в гидролизе ДНК отличается от таковой для известных ДНКаз человека [28]. В отличие от основной фракции ЛФ с самым высоким сродством к Blue Sepharose, все субфракции ЛФ с ДНКазной активностью оказались цитотоксичными и подавляли рост клеток раковых линий мышей и человека.

Возможные причины различия свойств этих изоформ пока не установлены. Авторы работ [27-29] предположили, что наличие изоформ может быть обусловлено различной степенью гликозилирования белка и/или его фосфорилирования. Тем не менее, эта гипотеза пока не проверена экспериментально.

Как следует из рассмотренных выше данных, в организме человека могут присутствовать изобелковые формы ЛФ [25-29]. Принимая во внимание эти данные, а также возможность существования ЛФ в как минимум четырех различных олигомерных состояниях (мономер - тетрамер) очевидно, что образование различных олигомерных форм белка, состоящих из субъединиц, соответствующих различным избелковым формам, является одним их потенциальных путей модификации свойств лактоферрина.

Дополнительным путем регуляции-изменения биологических свойств ЛФ может быть его взаимодействие с большим числом биологически активных молекул: РНК, ДНК, АТР, белками или лигандами полисахаридной природы.

Молекула ЛФ обладает исключительной конформационной лабильностью и может существовать в самых разных конформационных состояних. Это связано с тем, что в молекуле белка два домена соединены с помощью достаточно гибкого аминокислотного фрагмента. Это создает дополнительные возможности различного рода изменений конформации белка в отсутствии и в присутствии природных лигандов и, как следствие, самым разным изменениям его биологических свойств. Таким образом, следует полагать, что в регуляции свойств ЛФ человека может быть задействовано несколько совершенно различных механизмов, которые включают: а) аллостерическое изменение конформации белка под действием ионов железа и других металлов, а также нуклеиновых кислот, белков, нуклеотидов или полисахаридов, б) изменение олигомерного состояния белка под действием указанных природных лигандов, в) существование мономеров белка в виде большого числа различных изобелковых форм, а также образования олигомерных форм белка, состоящих из различных субъединиц, соответствующих этим формам.

Таким образом, очевидно, что несмотря на более, чем 50-летнюю историю исследования механизмов функционирования ЛФ, изучение этого белка представляется исключительно актуальным и в настоящее время. Современные достижения в области развития новых физико-химических методов исследования белков представляются исключительно перспективными для анализа закономерностей возможности олигомеризации ЛФ под действием различных лигандов.

2. Экспериментальная часть

2.1 Теоретические основы использованных методов и аппаратурное обеспечение

2.1.1 Методы рентгеновской и оптической дифракции

2.1.1.1 Рассеяние плоской волны веществом

Пусть плоская монохроматическая волна A₀exp(ik₀r) падает на рассеивающий центр О, который под действием излучения становится источником сферической волны. Тогда в точке наблюдения L, результирующая волна имеет вид.

(2.1)

Здесь k0 и k -- волновые векторы падающей и рассеянной волн, |k0| = |k|= 2р/л, л - длина волны, А0 и А0b/|r| -- амплитуды этих волн, r - вектор, соединяющий точку L с рассеивающим центром в точке О. Амплитуда рассеянной сферической волны равна произведению амплитуды падающей волны и коэффициента b/|r|, где значение b определяется видом падающего излучения и природой рассеивающего центра, находящегося в точке О. Чем сильнее взаимодействие падающей волны с центром О, тем больше коэффициент b. Он имеет размерность длины и носит название длины рассеяния, или амплитуды рассеяния точечного центра. Рассеяние плоской монохроматической волны на реальных объектах, состоящих из совокупности ядер и электронов, можно рассматривать как точечные рассеивающие центры.

Рассеивающую способность произвольного скопления ядер, электронов при облучении их рентгеновскими лучами или светом можно характеризовать рассеивающей плотностью ц(r) -- скалярным полем, заданным в ограниченной области пространства. Для рентгеновского рассеяния ц(r) -- плотность распределения заряда, в случае света -- это оптическая плотность вещества, зависящая от показателя преломления. Взаимодействие волны (рентгеновского излучения или света) с веществом можно представить себе таким образом, что волна электромагнитного излучения взаимодействует со всеми ядрами, электронами и валентными оболочками, которые становятся источниками сферических волн. Суперпозиция этих волн представляет собой первое приближение к реальному рассеянию.

Рис. 2 Рассеяние плоской волны точечным центром (а) и ограниченной областью, задаваемой потенциалом ц(r') (б).

Можно показать, что функция

(2.2)

является амплитудой упругого рассеяния на скалярном поле ц(r). Это -- так называемое первое борновское приближение, иными словами - приближение однократного рассеяния.

Выражение (2.2) представляет собой интеграл Фурье, т.е. разложение функции f(h) по базисной системе ортогональных функций -- экспоненциальных функций exp(ihr). Решение обратной задачи -- нахождения ц(r) при известной функции f(h)--дается обратным преобразованием

(2.3)

Таким образом, преобразования Фурье лежат в основе расчетов амплитуд рассеяния по заданной системе рассеивающих центров и плотности поля рассеяния по заданной амплитуде рассеяния, если, разумеется, выполнены условия первого борновского приближения. При определении атомной и молекулярной структуры вещества, экспериментаторы стараются всегда так поставить эксперимент, чтобы это приближение (и тем самым взаимные интегральные фурье-преобразования (2.2) и (2.3) для амплитуды и плотности рассеяния) выполнялось. Экспериментально определяется не сама амплитуда рассеяния, а интенсивность I(h), пропорциональная квадрату амплитуды рассеяния:

(2.4)

Щ - телесный угол). Функция I(s) называется интенсивностью рассеяния (название, принятое в рентгеноструктурном анализе и в светорассеянии). Видно, что размерность этой функции -- квадрат длины. Важной характеристикой объекта является полная интенсивность (или полное сечение) рассеяния, которая дается интегрированием (2.4) по всем углам:

 (2.5)

Главной задачей структурного анализа вещества является восстановление распределения рассеивающей плотности ц(r) по измеренной функции I(h).

2.1.1.2 Формула Гинье. Угловое разрешение

С точностью до h⁴ имеем разложение интенсивности I(h) в близи точки h = 0:

(2.6)

Выражение в скобках в правой части (2.6) можно рассматривать как первые два члена разложения в ряд Маклорена функции ехр(--h²R²g/3). Поэтому с точностью до членов, пропорциональных h⁴, для начальной части кривой рассеяния можно записать

(2.7)

Это -- так называемая формула Гинье, выведенная им еще в 1939 г. Для установления связи параметров I(0) и Rg со строением частицы подставим разложение:

sin(hr)/hr = 1 - h²r²/6 + h⁴r⁴/120 - h⁶r⁶/5040 + ...

в формулу Дебая:

 (2.8)

Поместив начало координат в центре массы частицы, можно получить выражение:

(2.9)

Это -- известное выражение для радиуса инерции частицы относительно ее центра массы.

Таким образом, начальная часть кривой рассеяния вне зависимости от конкретного строения частицы описывается с помощью двух параметров: I(0), который характеризует общее количество рассеивающей материи, и Rg, который несет информацию о ее распределении относительно центра массы частицы.

Цель дифракционного эксперимента -- это измерение интенсивности рассеяния I(h) при определенных величинах модуля вектора рассеяния h = 4 ? р ? n • (sin и)/л, где n -- показатель преломления окружающей частицу среды. Для исследования структуры частиц или вообще каких-либо неоднородностей плотности определенного масштаба нужно иметь возможность вести измерения рассеянного излучения в определенном интервале значений шкалы h, А^-1. Для дисперсных систем с более крупными размерами частиц надо использовать меньшие значения h и наоборот. Поэтому измерения рассеянного излучения необходимо проводить при таких углах рассеяния 2и, при которых реально используемые длины волн (л) излучения не могут существенно превышать межплоскостные расстояния: для рентгеновского излучения это 1 ? 2 А.



Рис. 3. Схема формирования первичного и рассеянного излучения при малых углах рассеяния в прямом (а) и обратном (б) пространствах: 1 -- источник излучения; 2, 3, 4 -- круглые отверстия коллиматора; 5 -- образец; 6 -- плоскость приемника излучения.

Формирование весьма узкого пучка первичного излучения, падающего на образец, достигается коллимационной системой первичного монохроматического пучка (рис. 3).

Система двух круговых диафрагм малого размера, разнесенных на большое расстояние (по сравнению с размером отверстий), позволяет приблизиться к условиям плоской волны. Величина проекции первичного пучка в плоскости приемника, а в сочетании с выбранным расстоянием от образца до детектора и тот наименьший угол 2иmin (соответственно hmin), начиная с которого ведутся измерения интенсивности рассеянного излучения, и определяют разрешение конкретной коллимационной системы. Таким образом, верхний предел размеров неоднородностей, которые могут быть исследованы на данных установках (дифрактометрах), определяется углом 2иmin, а нижний предел разрешения всегда соответствует величине 2и = 180^о.

2.1.2 Абляция

Для абляции лиофилизованных препаратов белков и их комплексов использовалось излучение ЛСЭ на длине волны 130 мкм, после чего дисперсный состав анализировался с помощью Диффузионного спектрометра аэрозолей.

2.1.2.1 Лазер на свободных электронах

ЛСЭ Сибирского Центра Фотохимических Исследований является самым мощным в мире источником в диапазоне длин волн 120-200 микрон. Он дает излучение со средней мощностью до 400 Вт.

Принцип действия ЛСЭ основан на том, что движущаяся заряженная частица (ДЗЧ) в знакопеременном магнитном поле приводится в колебательное движение поперек направления своего движения. При этом возникает излучение в малом телесном угле вперед по направлению движения ДЗЧ. Это излучение зависит от продольной скорости ДЗЧ, и шага ондулятора. Основные параметры ЛСЭ приведены в табл. 2.

Таблица 2 Основные параметры ЛСЭ.

Энергия электронного пучка, МэВ	12
Частота ВЧ-системы, МГц	180,4
Частота следования сгустков, МГц	11,75
Средний ток, мА	20
Максимальная средняя выводимая мощность лазерного излучения, Вт	400
Диапазон перестройки длин волн, мкм	120-235
Ширина спектра излучения ?л/л, (минимальная)	3?10-3
Эффективность рекуперации, %	>95
Длина волны основной гармоники	(120 … 235) мкм
Область спектра 2-й и 3-й гармоник	(40 … 117) мкм
Относительная спектральная ширина	(0.3 … 1) %
Диаметр гауссова пучка на выходе beamline	80 мм
Степень поляризации излучения	>99.6 %
Поперечная когерентность	Полная
Временная когерентность	(40 … 100) пс
Максимальная средняя мощность,	0.4 кВт (11.2 МГц)
Длительность импульса	(40 … 100) пс
Частота повторения	(2.8 … 11.2) МГц

2.1.2.2 Диффузионный Спектрометр Аэрозолей

Для определения дисперсного состава продуктов абляции использовался Диффузионный спектрометр аэрозолей, разработанный в ИХКГ СО РАН.

Принцип действия ДСА основывается на зависимости диффузионного коэффициента микрочастиц от их размера. Аэрозоль пропускается через серию сеток, на каждой из которых часть частиц улавливается. Частицы, обладающие меньшими размерами, улавливаются в первую очередь. В случае диффузионной батареи сетчатого типа, зависимость коэффициента прохождения от размера частиц будет иметь следующий вид:

(2.10)

Здесь B - величина зависящая от конструкции сеток, n - номер сетки.

Таким образом, в случае полидисперсного аэрозоля имеющего плотность распределения и концентрацию N₀, на выходе диффузионной батареи, согласно (2.10), будем иметь концентрацию N(n) :



Рис. 4. Схема ДСА. 1 - диффузионная батарея, 2 - КУСТ, 3 - счетчик частиц.

(2.11)

Отсюда видно, что задача об определении дисперсного состава и концентрации аэрозоля с помощью ДСА сводится к измерению N(n) и последующему решению интегрального уравнения (2.11)

Для каждой сетки существует канал, по которому происходит отбор части частиц на конденсационный укрупнитель, откуда они поступают на счетчик частиц для определения их количества. По получаемому распределению количества аэрозольных частиц в зависимости от номера канала оценивается их размер. Основные параметры ДСА приведены в табл. 3.

Таблица 3 Основные параметры ДСА.

Диапазон измеряемого размера частиц	0.003-0.2 мкм
Максимальная измеряемая концентрация частиц	5 ? 105 см -3
Время одного измерения	4 минуты

Точность оценки моментов распределения составляет 10%. Проверка точности на примере йодистого и хлористого серебра показала 10% соответствие результатов ДСА и электронного микроскопа (табл. 4).

Таблица 4 Параметры распределения, найденные электронной микроскопией и с помощью диффузионной батареи.

Электронная микроскопия	Диффузионная батарея
Выборка	d50, нм	g	d50, нм	g
700	24.0	1.51	28.0	1.4
340	33.4	1.56	34.0	1.65
505	17.4	1.52	18.0	1.45
340	20.4	1.73	22.0	1.55
520	50.5	1.67	51.0	1.65
336	41.5	1.64	44.0	1.60

2.1.3 Гель-хроматография

Эксклюзивная (гель-проникающая) хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение веществ происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся в порах сорбента и растворителем, протекающим между его частицами.

Основные параметры хроматографического разделения.

Основными параметрами хроматографического разделения являются удерживаемый объем и время удерживания компонента смеси (рис. 5).

Время удерживания tR - это время, прошедшее от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума соответствующего пика. Умножив время удерживания на объемную скорость элюента F , получим удерживаемый объем VR:

VR = tR ^. F; (2.13)

Исправленное время удерживания - время, прошедшее с момента появления максимума пика несорбируемого компонента до пика соответствующего соединения:

tR' = tR - t0; (2.13)

Приведенный или исправленный объем удерживания - это объем удерживания с поправкой на мертвый объем колонки V0, т. е. на объем удерживания несорбируемого компонента:

VR' = VR - V0; (2.14)

Характеристикой удерживания является также коэффициент емкости k', определяемый как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе: k' = mн / mп. Величину k' легко определить по хроматограмме:

Рис. 5. Характерный вид хроматограммы.

 (2.15)

Важнейшими параметрами хроматографического разделения являются его эффективность и селективность.

Эффективность колонки, измеряемая высотой теоретических тарелок (ВЭТТ) и обратно пропорциональная их числу (N) тем выше, чем уже пик вещества, выходящего при том же времени удерживания. Значение эффективности может быть вычислено по хроматограмме по следующей формуле:

N = 5.54 ^. (tR / )², (2.16)

где tR - время удерживания, - ширина пика на половине высоты

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, длину колонки L и средний диаметр зерна сорбента , легко получить значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), и приведенной высоты (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N ПВЭТТ = ВЭТТ/dc (2.17)

Эти характеристики позволяют сравнивать эффективности колонок различных типов, оценивать качество сорбента и качество заполнения колонок.

Селективность разделения двух веществ определяется по уравнению:

, (2.18)

При рассмотрении разделения смеси двух компонентов важным параметром служит также степень разделения :

; (2.19)

Пики считаются разрешенными, если величина больше или равна 1.5.

Основные хроматографические параметры связывает следующее уравнение для разрешения:

; (2.20)

Факторами, определяющими селективность разделения, являются: 1) химическая природа сорбента; 2) состав растворителя и его модификаторов; 3) химическая структура и свойства компонентов разделяемой смеси; 4) температура колонки.

Аппаратура для жидкостной хроматографии.

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами.



Рис. 6. Блок-схема жидкостного хроматографа.

На рис. 6 представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

Насос (2) предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного (шприцевого), либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом, а вторых - большая сложность конструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа с успехом применяют недорогие перистальтические насосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено препаративными задачами.

Инжектор (3) обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью.

Колонки (4) для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки. Постоянство температуры обеспечивается термостатом (5).

Детекторы (6) для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области).

...