Ферментативная деструкция природных полисахаридов

Целлюлазный комплекс состоит, как правило, из ферментов четырех типов: эндо-1,4-в-глюканазы, экзо-1,4-в-глюканазы (экзоцеллобиогидролазы), экзо-1,4-в-глюкозидазы и целлобиазы (в-глюкозидаза).

Глубокий гидролиз целлюлозы осуществляется в результате согласованного действия полиферментной системы (полиферментного целлюлазного комплекса), состоя-щей из эндо- и экзодеполимераз и в-глюкозидаз [3].

Методы предобработки целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) по характеру воздействия можно разделить на четыре типа: физические, механические, химические и биологические.

К физическим методам относятся обработка г-лучами или потоком электронов, обработка микроволновым излучением (от 2400 до 2500 МГц), нагревание на воздухе или в атмосфере СО2 (100°С), в воде или в керосине, охлаждение, обработка при повышенном или пониженном давлении, действие ультразвука. Облучение высокой энергии приводит к деполимеризации целлюлозы, и накоплению микродефектов в ее трехмерной структуре, что в конечном счете приводит к увеличению реакционную способность ЦСС от 2 до 5 раз.

Механические методы предобработки целлюлозосодержащего сырья заключаются в их измельчении на различных видах мельниц (шаровые, коллоидные или вибромельницы), дезинтеграторах и дробилках, диспергировании на вальцах и т.д. Измельчают целлюлозосодержащее сырье как в сухом, так и во влажном виде. Использование механических методов приводит к разрушению кристаллической структуры целлюлозы, увеличению поверхности, доступной целлюлолитическим ферментам и, как следствие, к значительному возрастанию реакционной способности целлюлозосодержащего сырья (в 10 и более раз).

Химические методы предобработки основаны на способности тех или иных химических соединений растворять лигнин или целлюлозу, либо приводить к набуханию или разрушению е? структуры. Комплексные соединения Cd, Ni, Zn с этилендиамином, со щелочью и биуретом, концентрированные минеральные кислоты (фосфорная, серная, соляная) могут растворять целлюлозу. При разбавлении таких растворов водой, ацетоном или спиртом происходит осаждение (регенерация) целлюлозы. Регенерированная целлюлоза является практически аморфной. Аморфную целлюлозу так же получают обработкой параформом в диметилсульфоксиде. Растворение или набухание целлюлозы происходит в результате воздействия четвертичных аммониевых оснований (тетраметил-, триметилэтил-, триметилбензил-), первичных моно-, ди- и триаминов жирного ряда. Такая обработка с последующим вытеснением химических реагентов органическими растворителями сопровождается значительной аморфизацией целлюлозы.

Набухание, растворение и аморфизация целлюлозы происходит также в растворах неорганических солей.

Делигнификация целлюлозосодержащего сырья осуществляется разбавленными растворами щелочи (от 1 % до 2 %), как правило, NaOH или аммиаком (водным или газообразным) при кипячении или автоклавировании. К делигнификации приводит широко применяемый в целлюлознобумажной промышленности процесс сульфатной или сульфитной варки.

В качестве химических методов предобработки целлюлозосодержащего сырья используют также методы, основанные на действии окислителей.

Следует отметить получившую большое развитие так называемую взрывную дефибрацию целлюлозосодержащего сырья по декомпрессионному принципу (или паровой взрыв). Целлюлозосодержащее сырье подвергают кратковременному воздействию перегретого пара под давлением, далее давление сбрасывают, что вызывает паровой взрыв целлюлозосодержащего сырья. При таких условиях лигнин плавится, частично разрушается и выходит из структуры целлюлозы, кроме того, под действием парового взрыва происходит частичная дезинтеграция целлюлозы, а также гидролиз гемицеллюлоз.

Химические методы предобработки, основанные на аморфизации или набухании целлюлозы, приводят от 10 до 15 кратному увеличению ее реакционной способности; делигиификация, паровой взрыв и другие методы увеличивают реакционную способность от 5 до 10 раз.

Биологические методы предобработки основаны на использовании лигнолитических микроорганизмов, способных избирательно по отношению к целлюлозе утилизировать лигнин в качестве источника углерода. Эти методы требуют достаточно большого времени и относительно эффективны.

Каждый из приведенных выше методов предобработки имеет достоинства и недостатки. Основным их плюсом является значительное увеличение реакционной способности целлюлозосодержашего сырья. Основным минусом - достаточно высокая стоимость.

Анализ данных по влиянию совмещения разных методов предобработки на реакционную способность целлюлозосодержащего сырья показывает, что в случае одновременного применения двух эффективных методов, каждый из которых приводит к существенному увеличению реакционной способности (таких, как делигнификация, измельчение, обработка концентрированными Н3РО4 или NaOH, кадоксеном) не происходит прямого суммирования их индивидуального действия, а наблюдается лишь определенная аддитивность, а в ряде случаев и элиминирование действия друг друга. Напротив, совмещение слабо и сильно действующих методов (например, обработка линта 1% NaOH и его измельчение) приводит к суммированию воздействия. Повидимому, индивидуальное действие каждого эффективного метода предобработки уже приводит к возникновению таких качественных изменений в структуре целлюлозосодержащего сырья, что исключает возможность существенных дополнительных изменений при применении другого эффективного метода предобработки.



2.2 Целлюлолитические ферменты

Целлюлоза является одним из наиболее трудно гидролизуемых природных полимеров. В организме высших животных и человека не синтезируются ферменты, гидролизующие целлюлозу. Биодеградацию целлюлозы осуществляют ферменты микроорганизмов. Микрофлора толстого кишечника человека ферментирует целлюлозу овощей и фруктов полностью. Более грубая целлюлоза, например, входящая в препараты пищевых волокон, расщепляется на 0-70%.

В гидролизе целлюлозы участвуют три основных вида ферментов. Эндо-в-1,4-глюканазы катализируют неупорядоченное расщепление целлюлозных молекул на крупные фрагменты. При действии экзо-в-1,4-глюканазы, или целлюлобиогидролазы от нередуцирующего конца целлюлозных молекул или их ферментов отщепляется целлобиоза. Целлобиозы, или в-глюкозидазы катализируют гидролиз целлобиозы и, с меньшей скоростью, небольших целлоолигосахаридов, с образованием глюкозы. Некоторые микроорганизмы синтезирую экзо-в-1,4-глюкозидазу, под действием которой от нередуцирующего конца целлюлозных субстратов отщепляется глюкоза.

Индивидуальные эндо- и экзоглюканазы способны расщеплять нативную целлюлозу, однако в природе этот процесс происходит обычно под действием комплекса ферментов.

Целлюлазные комплексы микроорганизмов и высших базидиальных грибов включают до 20 ферментных белков, среди которых, как правило есть и эндо-, и экзо-ферменты.

Гидролиз целлюлозы ассоциированными бактериальными целлюлазами имеет место в рубце жвачных животных. В рубцовой жидкости лишь около 5% целлюлаз находится в свободном состоянии, остальная часть представлена ассоциатами. В гидролизе целлюлозы участвуют различные бактерии, населяющие рубец. За 6-8 ч пребывания в этом отделе желудка целлюлоза расщепляется на 40-50%.

Полнота гидролиза целлюлозы зависит от ряда факторов, в числе которых следующие: степень кристалличности субстрата, величина его удельной поверхности, состав ферментативного комплекса, используемого для гидролиза, и свойства его компонентов.

Нативная целлюлоза имеет очень прочную структуру и трудно гидролизуется. При исследовании гидролиза образцов целлюлозы различной степени кристалличности найдена обратная зависимость скорости гидролиза от процента кристалличности. Для увеличения доступности целлюлозы действию ферментов ее подвергают измельчению. При этом снижается размер частиц, увеличивается удельная поверхность субстрата и доля аморфной части. При сильном механическом воздействии может быть даже снижена степень полимеризации целлюлозы. Скорость гидролиза целлюлозы прямо пропорциональна величине удельной поверхности, она увеличивается по мере снижения размера частиц и степени полимеризации целлюлозы.

Микроорганизмы синтезируют целлюлазные комплексы, различающиеся по способности гидролизовать целлюлозу с высокой степенью кристалличности. Так называемые «неполноценные» комплексы хорошо гидролизуют аморфную целлюлозу, а в кристаллической целлюлозе расщепляют лишь ее аморфную фракцию (2-5%). Резкое снижение активности «неполноценных» комплексов по отношению к «полноценным» наблюдается при возрастании степени кристалличности субстрата до 60-70%.

Полноценные целлюлазные комплексы обязательно содержат эндоглюканазы, способные прочно сорбироваться на субстрате.

Чем выше коэффициент распределения, тем выше реальная концентрация фермента на поверхности субстрата и скорость гидролиза. Наблюдается прямая пропорциональная зависимость скорости гидролиза кристаллического субстрата от количества эндоглюканазы, сорбированной на его поверхности

Синергизм действия может наблюдаться в различных комбинациях эндо- и экзо-ферментов (эндо-эндо, эндо-экзо, экзо-экзо), но в любом случае одна из целлюлаз значительно отличается от другой по способности адсорбироваться на субстрате. Ферменты, близкие по сорбционной способности, при соединении не проявляют синергизма. Синергический эффект целлюлаз значителен: степень расщепления субстрата увеличивается в 2,5-2,8 раза.

Для гидролиза целлюлозы используются комплексные ферментные препараты, выделяемые из культур микроскопических грибов и актиномицетов и обладающие эндоглюканазной, целлобиогидролазной и целлобиазной активностью. Отдельные компоненты целлюлазных комплексов грибов и актиномицетов проявляют наибольшую активность при рН от 3,7 до 5,5, а комплексы в целом - при рН 4,5-5,5. Оптимальная температура действия отдельных компонентов - от 45 до 80°С, комплексов - 50-60° С. Некоторые высшие базидиомицеты синтезируют целлюлазы с оптимумом при рН З.

Многие целлюлазы являются углеводсодержащими белками, углеводная часть может составлять до 90% молекулярной массы. Углеводная часть выполняет якорную функцию, способствуя сорбции фермента на субстрате. Сорбция по сродству необходима, поскольку в рН-зоне активности целлюлазы имеет незначительный заряд (рН-оптимумы близки к ИЭТ). Возможно, углеводная часть обеспечивает скольжение фермента в фибриллярных структурах целлюлозы. Это существенно, поскольку целлюлазы осуществляют сотни и тысячи каталитических актов, не покидая поверхности одной целлюлозной молекулы.

Углеводная часть целлюлаз защищает белок от действия денатурирующих агентов и от протеолиза.

Конверсия целлюлозы в природных биоценозах сопряжена с деструкцией гемицеллюлозы и лигнина. При культивировании грибов на древесных субстратах в первую очередь разлагается гемицеллюлоза, после удаления ксилана увеличивается скорость гидролиза целлюлозы. Ксилазы и целлюлазы проявляют синергизм, что объясняется последовательностью их действия при гидролизе смешанного субстрата, где целлюлоза экранирована гемицеллюлозой.

Применение целлюлолитических ферментов представляет большой интерес, т.к. ферментативный гидролиз целлюлозосодержащих материалов (древесина, торф, сельскохозяйственные и городские отходы) может обеспечить получение различных биотехнологических продуктов (глюкозы, этанола, ацетона, микробной биомассы).



3. Микробиологический синтез

Микробиологический синтез - синтез структурных элементов или продуктов обмена веществ микроорганизмов за счёт присущих микробной клетке ферментных систем. При микробиологическом синтезе, как и любом органическом синтезе, сложные вещества образуются из более простых соединений. М. с. следует отличать от брожения (См. Брожение), в результате которого тоже получаются различные продукты микробного обмена (например, спирты, органические кислоты), но преимущественно за счёт распада органического вещества. Значительная часть продуктов, образующихся в ходе М. с., обладает физиологической активностью и представляет практическую ценность для народного хозяйства.

Микробиологический синтез осуществляется внутри клетки при активации низкомолекулярных компонентов (например, коферментом А)) и участии нуклеотид фосфатов, чаще всего адениловых производных. Затем многие метаболиты выводятся из клетки в среду. Характерная особенность микроорганизмов -- их способность к сверхсинтезу, т. е. избыточному образованию некоторых продуктов обмена веществ (многих аминокислот, нуклеотидов, витаминов), превышающему потребность микробной клетки. Способность к сверхсинтезу того или иного соединения свойственна определённым видам микроорганизмов, которыми, как правило, и пользуются в качестве продуцентов при производстве соответстветствующих метаболитов путём микробиологического синтеза.

3.1 Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты

В природе имеются так называемые целлюлолитические микроорганизмы, содержащие набор ферментов -- целлюлаз, способных к расщеплению не только аморфной, но и кристаллической целлюлозы до глюкозы. Попадая на поверхность целлюлозосодержащего материала и прикрепляясь к ней, микроорганизм выделяет целлюлазы, под действием которых субстрат целлюлаза в непосредственной близости от грибка-паразита расщепляется до конечного продукта -- глюкозы. Микроорганизм поглощает глюкозу в качестве основного продукта питания, размножается, растет, захватывая все большие участки поверхности, выбрасывает все новые и новые порции ферментов, пока не истощится доступная целлюлоза.

Однако эти процессы протекают весьма медленно. Для того чтобы пень в лесу полностью сгнил, нужны годы. Если же отделить от микроорганизма ферменты целлюлазы, сконцентрировать их и добавить к целлюлозе, процесс значительно ускорится. При этом образующаяся глюкоза не потребляется грибками, а накапливается в реакционной смеси. Кроме того, если в качестве субстрата использовать не чистую целлюлозу, а целлюлозосодержащие отходы промышленности или сельского хозяйства, то можно решить и еще одну важную проблему -- утилизацию отходов. Полученная глюкоза в зависимости от ее чистоты и экономической эффективности процесса может найти применение в медицине, пищевой промышленности, тонкой химической технологии или технической микробиологии. Глюкозу, как известно, можно сбраживать в этанол и затем употреблять как «жидкое топливо» в качестве заменителя части нефтепродуктов. Наконец, дегидратация энатола дает этилен -- основу современной «большой химии».

3.2 Биоконверсия трудноразлагаемых веществ

Плесневые грибы в качестве источника углерода могут использовать такие трудноразлагаемые вещества, как целлюлоза, крахмал, лигнин, пектиновые вещества, нефть, пестициды.

Разложение целлюлозы. Основными источниками целлюлозы для грибов в природных условиях служат древесина и различные растительные остатки. Среди микроскопических грибов, разлагающих целлюлозу известны представители следующих родов: Aspergillus, Coriolus, Eupenicillium, Fusarium, Penicillium, Sporotrichum, Trichoderma, Verticillium. Но только некоторые из них продуцируют полные внеклеточные целлюлолитические системы (эндо- и экзоглюканазы ?-глюкозидазу). Среди них Trichoderma viride, T. reesei, T. koningii, Penicillium funiculosum, Fusarium solani. Для культуральной жидкости большинства других грибов этой группы характерно отсутствие экзоглюканазы, то есть эти грибы могут деградировать более аморфные формы целлюлозы.

Деградация высокоупорядоченной формы целлюлозы осуществляется благодаря синергическому действию комплекса целлюлолитических ферментов. При любой комбинации экзо- и эндоглюканаз Trichoderma koningii, Fusarium solani, Penicillium и Funiculosum отмечается выраженный синергизм. Однако синергизм между экзоглюканазами этих грибов и эндоглюканазами грибов, не продуцирующих экзоглюканазу (Myrothecium verrucaria), не выявлен. Нет также синергизма между экзоглюканазами грибов и эндоглюканазами рубцовых бактерий. Последнее указывает на существенные различия целлюлолитических систем грибов и бактерий (Марьиновская, 2006).

Целлюлоза является линейным полимером d-глюкозы. Остатки глюкозы в молекуле клетчатки, как и в молекуле целлобиозы связаны ?-гликозидной связью. Поэтому клетчатку можно рассматривать как полимер целлобиозы. Нормэн и Фуллер (1942) считают, что большинство грибов способно усваивать клетчатку. Несмотря на то, что использование клетчатки грибами имеет большое значение в круговороте веществ в природе, процесс этот изучен далеко не полно.

Обычно считают, что первым этапом использования целлюлозы грибами является ее гидролиз. Гидролиз целлюлозы можно схематически представить следующим образом: целлюлоза > целлодекстрины > целлотетроза > целлобиоза > d-глюкоза.

Целлюлоза на нашей планете -- самое «крупнотоннажное» из всех возобновляемых видов сырья. Ежегодный естественный прирост целлюлозы составляет около 100 млрд. т. Использование человеком части этого сырья приводит к накоплению значительного количества целлюлозосодержащих отходов. Если даже малую долю этих отходов превращать ферментативным путем в полезные продукты, это даст ощутимый (и возобновляемый!) источник пищевых углеводов и заменителей нефти. Поэтому данной проблемой в последние годы столь упорно занимаются и исследователи, и технологи всего мира.



4. Методическая часть

4.1 Определение холоцеллюлозы надуксусной кислотой

Навеску воздушно-сухих обессмоленных этиловым эфиром опилок 1 г помещаем в коническую колбу на 100 мл и добавляем мерным цилиндром 50 мл 10%-го раствора надуксусной кислоты (НУК) при комнатной температуре. Колбу покрываем часовым стеклом и помещаем в водяную баню на 90 мин. Затем содержимое колбы разбавляем дистиллированной водой (250 мл) температуры 50⁰С, отфильтровываем холоцеллюлозу и промываем нагретой дистиллированной водой до отрицательной реакции на пероксид. Фильтр с холоцеллюлозой высушиваем на воздухе до постоянной массы.

Массовую долю холоцеллюлозы, % к абсолютно сухой исходной (обессмоленной) древесине, рассчитываем по формуле:

где m1 - масса фильтра с холоцеллюлозой, г;

m - масса пустого фильтра, г;

g - масса абсолютно сухой навески обессмоленной древесины, г;

Kэ - коэффициент экстрагирования органическим растворителем.

Приготовление НУК:

К 20 мл предварительно охлаждённого до 0…2⁰С 30%-го раствора H₂O₂ (в конической колбе, помещённой в баню со льдом) добавляем осторожно при перемешивании 40 мл уксусной кислоты и 1 мл H₂SO₄.

Анализ раствора НУК:

Отбираем пипеткой 1 мл раствора НУК и в мерной колбе разбавляем дистиллированной водой до 100 мл. Отбираем пипеткой 15 мл разбавленного раствора, добавляем 10 мл 1%-го раствора серной кислоты и титруем пероксид водорода раствором KMnO₄ концентрацией 0,1 моль/дм³ до слабо-розового окрашивания.

5H₂O₂ + 2 KMnO₄ + 3H₂SO₄ = 2MnSO₄ + K₂SO₄ + 5O₂ + 8H₂O

Затем к этой же пробе добавляем 15 мл 2%-го раствора KI и титруем выделившийся йод раствором тиосульфата Na₂S₂O₃ концентрацией 0,1 моль/дм³ до слабо-жёлтой окраски раствора. Добавляем крахмал и продолжаем титровать до перехода раствора из тёмно-синего в бесцветный.

CH₃COOOH + 2KI + H₂SO₄ = I₂ + K₂SO₄ + H₂O + CH₃COOH

I₂ + 2Na₂S₂O₃ = 2NaI + Na₂S₄O₆

Массовые доли в растворе пероксида водорода и НУК, %, рассчитываем по формулам:

где v1 - расход раствора перманганата калия, мл;

0,0017 - масса пероксида водорода, соответствующая 1 мл раствора перманганата калия, концентрацией 0,1 моль/дм³, г;

v2 - расход раствора тиосульфата натрия концентрацией 0,1 моль/дм³, мл;

0,0038 - масса CH₃COOOH, соответствующая 1 мл раствора тиосульфата натрия концентрацией 0,1 моль/дм³, г. [13]



4.2 Определение массовой доли РВ в гидролизатах эбулиостатическим методом

Проводят титрование медно-щелочного раствора с известным титром исследуемым раствором сахара (гидролизатом) без доступа воздуха в токе водяного пара. Титр медно-щелочного раствора устанавливают по глюкозе. Прибор для титрования (рис. 2.1, а) состоит из внешнего сосуда -- конической колбы 1 и внутреннего сосуда -- эбулиостата 2 с впаянной в его боковую стенку трубкой, доходящей почти до дна сосуда. Суженный конец эбулиостата вставлен в колбу 1 на резиновой пробке и имеет отверстие для выхода пара 3. В резиновую пробку вставлена стеклянная трубка 4 для отвода избытка пара из колбы. Струю пара регулируют винтовым зажимом на резиновой трубке, надетой на конец стеклянной трубки. Во время титрования верхний конец эбулиостата закрывают резиновой пробкой, в которую вставлен конец бюретки 5 для раствора сахара. Реагирующая жидкость в эбулиостате обогревается паровой рубашкой и пропусканием пара через жидкость.

а б

Рис. 2.1. Прибор для определения РВ эбулиостатическим методом (а) и дозаторы растворов (б)

Индикатором при титровании служит метиленовый голубой, который в окислительной среде имеет синий цвет, а в восстановительной бесцветен. Для предотвращения выпадения осадка оксида меди (I) в медно-щелочной раствор добавляют желтую кровяную соль (тригидрат гексацианоферрата (II) калия) К₄[Fе(СN)₆] * ЗН₂0, которая образует с Cu₂O растворимое комплексное соединение.

Для проведения анализа приготовляют два раствора:

А -- 10 г CuSO₄*5H₂O и 0,04 г метиленового голубого растворяют в воде в мерной колбе на 1 дм³ доведением до метки;

Б -- 50 г сегнетовой соли растворяют в воде, отдельно растворяют в воде 4 г желтой кровяной соли, переносят оба раствора в мерную колбу на 1 дм³, добавляют 75 г NaОН в виде 50%-ного водного раствора и доводят водой до метки.

Для отмеривания этих растворов используют дозаторы (рис. 2.1, б). Дозатор для отмеривания раствора А представляет собой два сообщающихся сосуда. Сосуд вместимостью около 100 см3 служит для хранения раствора А и сосуд- пипетка для его отмеривания. На верхнем и нижнем отводах сосуда-пипетки нанесены метки, соответствующие объему 5 см3. Для отмеривания раствора А открывают кран 1 и заполняют сосуд-пипетку до верхней метки. Затем кран закрывают. При отмеривании раствора А и заливании его в эбулиостат открывают кран 2 и спускают раствор до нижней метки. Второй дозатор для отмеривания раствора Б представляет собой пипетку вместимостью 5 см³, к верхнему концу которой припаян трехходовой кран. На верхний отвод тройника надета резиновая груша. Раствор Б хранят в колбе вместимостью 100 см³, откуда в набирают в пипетку, а из пипетки спускают в эбулиостат.

В зависимости от массовой доли РВ (редуцирующие вещества) в растворе и интенсивности его окраски применяют два варианта титрования: для светлых растворов, содержащих 0,13...0,05% РВ, используют прямое титрование раствором сахара; для темных растворов или растворов, содержащих меньше 0,05% РВ, применяют дотитровывание раствором глюкозы.

Методика анализа по первому варианту

В колбу прибора наливают воду и ставят прибор на электрическую плитку. Для равномерного образования пара на дно колбы помешают кусочки пористого стекла или шамота. Когда вода закипит наливают в эбулиостат из пипеток сначала 5 см³ раствора А, а затем 5 см³ раствора Б. Осторожно перемешивают растворы в эбулиостате и медленно вставляют эбулиостат вместе с пробкой в колбу.

Затем верхнее отверстие эбулиостата закрывают пробкой с бюреткой, в которую наливают исследуемый раствор сахара (гидролизат). Регулируют выход пара через отводную трубку таким образом, чтобы жидкость в эбулиостате нагрелась до температуры кипения воды примерно за 0,5 мин. Как только пар начнет проходить через медно-щелочной раствор, начинают титрование раствором сахара.

Сначала проводят ориентировочное определение. Раствор сахара из бюретки добавляют по каплям со скоростью одна капля за 1...2 с до перехода окраски раствора из синей в желтую и замечают объем раствора сахара, израсходованного на титрование. Затем проводят окончательное определение. В эбулиостат заливают новую порцию медно-щелочного раствора (5 см3 раствора А и 5 см3 раствора Б) и начинают титрование. Вначале сразу прибавляют 80...90% объема раствора сахара, израсходованного при ориентировочном определении, и через 2 мин (по секундомеру или по песочным часам) с начала пробулькивания пара через жидкость в эбулиостате дотитровывают, прибавляя раствор сахара со скоростью одна капля за 6...7 с, до перехода синей окраски в желтую от одной капли сахарного раствора.

В конце титровании важно соблюдать одинаковую скорость добавления раствора сахара, так как реакция окисления редуцирующих веществ медно-щелочным раствором идет не мгновенно и сопровождается самовосстановлением медно-щелочного раствора.

По бюретке определяют объем раствора сахара, израсходованного на титрование 10 см³ медно-щелочного раствора.

Массовую долю РВ, %, в гидролизате легкогидролизуемых полисахаридов или в разбавленном нейтрализованном гидролизате трудногидролизуемых полисахаридов по формуле:

где T1 -- титр медно-щелочного раствора по глюкозе для первого варианта, мг;

V -- объем гидролизата, израсходованный на титрование 10 см³ медно-щелочного раствора.

Методика анализа по второму вариант

Подготавливают прибор к работе, как и в первом варианте (см. выше), но в эбулиостат кроме 5 см³ раствора А и 5 см раствора Б, добавляют, отмеривая пипеткой, определенный объем раствора сахара (гидролизата). В случае темного раствора, содержащего более 0,05% РВ, этот объем должен составлять 1...2 см³, а в случае раствора с массовой долей РВ менее 0,05%-- 5 см3. Затем к жидкости в эбулиостате добавляют из бюретки такой объем раствора глюкозы концентрацией около 0,1 г/100 см³, чтобы на дотитровывание после 2 мин кипячения (см. первый вариант) потребовалось бы не более 1 см³ этого раствора. Добавляемый объем определяют предварительным анализом. Концентрация добавляемого раствора глюкозы должна быть установлена точно; удобнее всего пользоваться раствором глюкозы, приготовленным для установки титра медно-щелочного раствора.

После перемешивания жидкости эбулиостат с пробкой медленно (см. первый вариант) вставляют в колбу, закрывают его пробкой с бюреткой, в которую налит раствор глюкозы. Через 2 мин (по секундомеру или по песочным часам) с начала про-булькивания пара через жидкость в эбулиостате проводят дотитровывание раствором глюкозы, добавляя его со скоростью одна капля за 6...7 с до перехода окраски в желтую от одной капли раствора глюкозы, израсходованного на дотитровывание.

Массовую долю РВ, %, в гидролизате легкогидролизуемых полисахаридов или в разбавленном нейтрализованном гидролизате трудногидролизуемых полисахаридов рассчитывает по формуле:

где T2 - титр медно-щелочного раствора по глюкозе для второго варианта, мг;

с1 - концентрация раствора глюкозы, мг/см³;

а - общий расход раствора глюкозы при титровании, см³;

v - объём исследуемого гидролизата, взятого на анализ, см³.

Установка титра медно-щелочного раствора по глюкозе

Титром медно-щелочного раствора по глюкозе условно называют массу глюкозы, мг, расходующуюся на восстановление 10 см³ медно-щелочного раствора при данных условиях титрования. Для получения более точных результатов анализа титр медно-щелочного раствора устанавливают для каждого варианта титрования, так как условия прибавления раствора сахара (при нагревании медно-щелочного раствора в первом варианте и на холоду во втором варианте) влияют на расход раствора сахара на восстановление меди.

Для установления титра медно-щелочного раствора используют чистую глюкозу, перекристаллизованную из этанола и высушенную до постоянной массы в вакуум-сушильном шкафу при температуре 50...60°С. Точную навеску такой глюкозы (массой около 0,1 г) растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 100 см³. Хорошо перемешивают раствор, наполняют им бюретку и проводят титрование 10 см³ медно-щелочного раствора по обоим вариантам (не менее трех параллельных титрований для каждого варианта). Определяют средний объем раствора глюкозы, израсходованный на титрование по каждому варианту, и рассчитывают титры медно-щелочного раствора по глюкозе, мг глюкозы, соответственно для первого Т1 и второго Т2 вариантов:

T = c1*b,

где с1 - концентрация раствора глюкозы, мг/см³;

b - объем раствора глюкозы, израсходованный на титрование 10 см³ медно-щелочного раствора, см³. [13]

4.3 Определение пентозанов фотоколориметрическим методом с орсиновым реагентом

Методика анализа.

Навеску воздушно-сухих опилок (массой 1 г для образцов древесины с ожидаемой массовой долей пентозанов до 10% и 0,5 или 0,3 г - с ожидаемой массовой долей пентозанов, соответственно, от 10 до 20% или свыше 20%) помещают в колбу для перегонки. Вносят 20 г хлорида натрия и добавляют мерным цилиндром 100 см³ 13%-ного раствора HCl. Колбу нагревают на электрическом колбонагревателе (или в глицериновой бане с температурой 164...166°С, помещая установку в вытяжной шкаф). Отгонка дистиллята должна происходить со скоростью 30 см³ в течение 10 мин. Дистиллят собирают в мензурку или мерный цилиндр, помещенный в баню с ледяной водой. После отгонки каждых 30 см³ дистиллята из капельной воронки в перегонную колбу добавляют по 30 см³13%-ного раствора HCl. Собирают примерно 225 см³ дистиллята. Конец отгонки фурфурола следует проверить по цветной реакции санилинацетатом.

По окончании перегонки дистиллят из приемника переносят в мерную колбу на 250 см³, ополаскивают приемник небольшим количеством 13%-ного раствора НСl и доводят объем дистиллята в колбе до метки той же кислотой. Колбу закрывают пробкой и тщательно перемешивают содержимое.

В отдельных случаях при очень высокой массовой доле пентозанов в растительном сырье требуется отгонять более 250 см³ дистиллята. Тогда для подготовки дистиллята к последующему анализу используют мерную колбу на 500 см³.

Из полученного раствора отбирают пипеткой пробу 5см³ в мерную колбу на 50 см³с притертой пробкой; пипеткой с грушей добавляют 25 см³орсинового реагента, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают содержимое. Затем колбу с реакционной смесью выдерживают в термостате при температуре (20±0,5)°С в течение 50 мин. Доливают до метки 95%-ный этанол, перемешивают, слегка охлаждают, выдерживают колбу в термостате при (20±0,5)°С в течение 15 мин и после этого при необходимости добавляют до метки дополнительное небольшое количество этанола. Аналогичным образом готовят параллельную пробу и контрольную. В контрольной пробе вместо 5 см³ дистиллята используют отмеренные пипеткой 5 см³ 13%-ного раствора HCl. Интервал между пробами должен составлять 3...4 мин, причем контрольную пробу готовят первой.

Раствор из подготовленной пробы заливают в кювету с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм и закрывают ее крышкой. Определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром или на спектрофотометре при длине волны 630 нм. Контрольную пробу используют в качестве раствора сравнения. По полученному показателю оптической плотности D с помощью градуировочного графика находят массу пентозанов в каждой параллельной пробе и берут среднее значение.

За результат определения принимается среднеарифметическое значение, полученное при фотометрировании двух параллельных проб. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать0,5%.

Приготовление орсинового реагента.

Навески орсина массой 0,400±0,025 г и хлорида железа (III) (FeCI₃-6H₂0) массой 0,5 г растворяют в мерной колбе на 1 дм³ в соляной кислоте концентрацией (HCl) (9,5±0,05)моль/дм³ доведением до метки. Срок хранения реагента в холодильнике в темной бутыли не более 3 нед.

Построение градуировочного графика.

Готовят эталонный раствор ксилозы, содержащий (2,2727 ± 0,0001) г безводной чистой ксилозы в 1 дм³ 13%-ного раствора HCl. Растворение проводят в мерной колбе доведением кислотой до метки. Безводную ксилозу получают высушиванием при 60°С в вакуумном сушильном шкафу.

Отбирают пипетками десять проб эталонного раствора ксилозы следующего объема: 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45 и 50 см³, что соответствует массе пентозанов для каждой пробы 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70;80; 90 и 100 мг. Так, для получения пробы, соответствующей 10 мг пентозанов, требуется отобрать 10x1000/0,88x2,2727= 5 см³ эталонного раствора (где 0,88 -- коэффициент пересчета безводной ксилозы в пентозаны).

Из каждой отобранной пробы эталонного раствора отгоняют фурфурол и определяют его содержание в дистилляте. Отгонку и определение оптической плотности дистиллята производят в условиях проведения анализа древесины (или технической целлюлозы). На основании средних данных фотометрирования при нескольких параллельных определениях (пять-шесть) для каждой пробы строят градуировочный график, откладывая по оси абсцисс массу пентозанов в пробе (мг), а по оси ординат -- оптическую плотность. Градуировочный график проверяют при замене прибора (фотоэлектроколориметра или спектрофотометра) или орсина.

При замене орсина для проверки графика достаточно проанализировать свежеприготовленный раствор ксилозы, масса которой соответствует 100 мг пентозанов. По полученному значению оптической плотности находят поправочный коэффициент k = D/D₁, где D - значение оптической плотности, соответствующее 100 мг пентозанов, по градуировочному графику; D₁ - значение оптической плотности вновь приготовленной пробы дистиллята, соответствующей 100 мг пентозанов, полученное с новым раствором орсинового реагента. Рассчитанную по вышеприведенной формуле массовую долю пентозанов в процентах умножают на поправочный коэффициент.

4.4 Определение лигнина с 72%-ной серной кислотой в модификации Комарова

Методика анализа.

Навеску воздушно-сухих обессмоленных этиловым эфиром или спиртотолуольной смесью опилок массой около 1 г помещают в коническую колбу (или баночку) вместимостью 50 см³ с притертой пробкой. К навеске добавляют 15 см³ 72%- ной Н₂S0₄ (плотностью 1,64 г/см³) и выдерживают в термостате при температуре 24...25°С в течение 2,5 ч при периодическом осторожном помешивании во избежание образования комков. Затем смесь лигнина с кислотой переносят в коническую колбу вместимостью 500 см³, смывая лигнин 200 см³ дистиллированной воды. При этом можно пользоваться стеклянной палочкой с резиновым наконечником. Разбавленную смесь кипятят с обратным холодильником на электрической плитке (слабое кипение) в течение 1 ч. Частицам лигнина дают укрупниться и осесть. Затем лигнин отфильтровывают на стеклянном пористом фильтре, высушенном до постоянной массы. Фильтрование рекомендуется проводить на следующий день. При проведении параллельных и серийных анализов фильтрование следует проводить через строго определенный промежуток времени. Мелкодисперсные лигнины (лиственные и др.) фильтруют через стеклянный фильтр с «нафталиновой подушкой». Водно-спиртовую суспензию нафталина наливают в стеклянный фильтр, отсасывают и промывают холодной водой с отсосом, после чего фильтруют лигнин.

Начинать фильтрование рекомендуется без отсоса. Сначала на фильтр сливают отстоявшуюся жидкость, а затем начинают переносить осадок. Окончательно переносят осадок лигнина из колбы на фильтр с помощью горячей воды, добавляя ее малыми порциями, при промывке. (В случае применения нафталиновой подушки вода для промывки не должна быть очень горячей во избежание расплавления нафталина.) При замедлении фильтрования подключают водоструйный насос, но при этом не следует отсасывать осадок на фильтре досуха. Необходимо оставлять слой воды перед добавлением каждой новой порции фильтруемой жидкости. После промывки от кислоты (по индикатору метиловому оранжевому) отсасывают жидкость полностью.

Для установления конца промывки каплю жидкости, стекающей с фильтра, наносят на фильтровальную бумагу и добавляют каплю индикатора. Если последний не меняет цвета, промывку считают законченной.

Фильтр с лигнином сушат в сушильном шкафу при температуре (103±2)°С до постоянной массы и взвешивают. При использовании нафталиновой подушки сушку в шкафу для влажных веществ продолжают до исчезновения слоя нафталина и только после этого переносят фильтр с лигнином в шкаф для сухих веществ.

Массовую долю лигнина, % к абсолютно сухой исходной (необессмоленной) древесине, рассчитывают по формуле, где m₁ - масса фильтра с лигнином, г; m - масса пустого фильтра, г; g - масса абсолютно сухой навески обессмоленной древесины, г; К_э - коэффициент экстрагирования органическим растворителем. Разность между результатами двух параллельных определений не должна превышать 0,5%.

Приготовление нафталиновой подушки:

Растворяют 25 г нафталина в 500 см³ этанола при нагревании на водяной бане (при 400⁰С). Раствор после фильтрования вливают в 500 см³ дистиллированной воды при перемешивании для получения суспензии.



5. Результаты по проделанной работе

В данной работе изучается процесс подготовки древесного сырья к ферментативному гидролизу на опилках из древесины березы и ели. По стандартным методикам в них было определено содержание основных компонентов (лигнин, целлюлоза, трудногидролизуемые и легкогидролизуемые полисахариды). Для предобработок использовались растворы: 10% надуксусная кислота и водный состав на основе уксусной кислоты и пероксида водорода. В качестве катализатора использовалась серная кислота. Для некоторых образцов перед обработкой органосольвентным раствором был проведен водный предгидролиз для выделения гемицеллюлозных сахаров с целью повышения эффективности ферментативного гидролиза целлюлозы. Выделяемые гемицеллюлозные сахара можно использовать на получение кормовых дрожжей, пока нет возможности использовать их на производство биоэтанола. Применение 10%-ой надуксусной кислоты для обработки позволяет выделять почти всю углеводную часть, растворяя весь лигнин.

Водные растворы уксусной кислоты и пероксида водорода с добавкой катализатора и обработка таким раствором опилок при температуре 98-100єС позволили получить техническую целлюлозу (твердый остаток) с содержанием лигнина 3,8-6,0% при продолжительности обработки 240 минут. Водный предгидролиз позволил отделить гемицеллюлозные легкогидролизуемые сахара, при этом содержание лигнина в целлюлозе снижается незначительно по сравнению с обработкой без предгидролиза. Содержание редуцирующих сахаров в водном гидролизате при этом составляет 1,9-2,4%.

На данном этапе перед нами стоит задача по выделению микроорганизмов, разлагающих целлюлозу и отработке условий ферментативного гидролиза древесного сырья и определения оптимальных условий его подготовки к ферментативному гидролизу.

Условия обработки и результаты делигнификации древесины в системе пероксид водорода - уксусная кислота - вода (с предгидролизом*)

№ Образ-ца	Условия обработки	Выход целлюлоз-ного материала, % к древесине	Содержание в т.о., %
	Реагент	Гидро- модуль	Продолжи-тельность, мин
					Целлю- лоза (ХЦ**)	Лиг- нин
1	Н2О2/ CH3CООH = 0,5 98-1000С	1:10	120	62,8	85,7	14,3
2			180	58,4	87,8	12,2
3			240	53,4	93,5	6,5
4			300	50,8	96,5	3,5
5	Н2О2/ CH3COОH =0,5 1200С	1:10	240	49,9	97,4	2,6
6	Н2О2/ CH3COОH = 0,5 1200С Повторное использование	1:10	240	53,1	96,5	3,4
7	Н2О2/ CH3COH =0,3 98-1000С	1:6	300	52,2	96,1	3,9

*Условия предгидролиза: реагент - вода, гидромодуль 1:10, продолжительность 2 ч; температура предгидролиза 98-100 ⁰С.;выход т.о.-92.5% ;содержание РВ в гидролизате-1,9% (3,5% после инверсии)

** - холоцеллюлоза (целлюлоза + трудногидролизуемые гемицеллюлозы)



6. Список литературы

1. Петров А.А. Органическая химия: учебник для вузов / А.А. Петров, Х.В. Бальян, А.Т. Трощенко; под ред. М.Д. Стадничука. - Спб.: «Иван Федоров», 2002. - 624 с.

2. Холькин Ю.И. Технология гидролизных про- изводств / Ю.И. Холькин. - М.: Лесная про- мышленность, 1989. - 496 с.

3. Клесов А.А. Ферментативное превращение целлюлозы // Итоги науки и техники. - 1983. - №1. - С. 63-150.

4. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лаюораторные работы по химии древесины и целлюлозы. - М.: Экология, 1991. - 320с.

5. Синицин А.П. Сравнительное изучение влияния различных видов предобработки на скорость ферментативного гидролиза природных целлюлозосодержащих материалов / А.П. Синицин, Г.В. Ковалев, С.Р. Меса- Манреса // Химия древесины. - 1984. - №5. - С. 60-71.

6. Синицин А.П. Влияние предобработки на эффективность ферментативного превра- щения хлопкового линта / А.П. Синицин, А.А. Клесов // Прикладная биохимия и мик- робиология. - 1981. - Т.17. - №5. - С. 682- 695.

7. Клесов А.А. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Влияние физико-химических и структурных факторов субстрата на эффективность ферментативного гидролиза / А.А. Клесов, А.П. Синицин // Биоорганическая химия. - 1981. - Т.7. - №12. - С. 1801-1812.

8. Целлюлоза и ее производные / под. ред. Н. Байклза, Л. Сегала. - М.: Мир, 1974. - Т.1. - 500 с.

9. Химия древесины / под. ред. Б.Л. Браунинга. - М.: Мир. - 1967. - 400 с.

10. Головлева Л.А. Микробная деградация лигнина / Л.А. Головлева, Х.Г. Ганбаров // Успехи микробиологии. - 1982. - №17. - С. 136- 158.

11. Большая советская энциклопедия.

Размещено на Allbest.ru

...