Модифіковані компоненти нуклеїнових кислот: синтез і властивості

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії

02.00.10 - Біоорганічна хімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

Модифіковані компоненти нуклеїнових кислот: синтез і властивості

Федоряк Олеся Дмитрівна

Київ - 1999



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України і в Університеті м. Лімож (Франція).

Наукові керівники:

доктор медичних наук, професор Луйк Олександр Ігорович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу медико-біологічних досліджень

професор Крос П'єр (Krausz Pierre), Університет м. Лімож (Франція), керівник лабораторії хімії природних сполук.

Офіційні опоненти:

доктор хімічних наук, професор СЕРЕБРЯНИЙ Саул Бенціонович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, головний науковий співробітник-консультант

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник АЛЕКСЄЄВА Інна Володимирівна, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, старший науковий співробітник

Провідна установа:

Київський університет імені Тараса Шевченка, кафедра органічної хімії, Міносвіти України, м. Київ

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 253660, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

В.о. вченого секретаря спеціалізованої вченої ради Г.О. Ковтун



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Синтетичні олігонуклеотиди знайшли широке застосування в молекулярній біології та генетичній інженерії. Особливо зацікавленість до них зросла після того, як було показано, що олігонуклеотиди можуть пригнічувати експресію відповідних генів і, таким чином, можуть бути використані як новий тип терапевтичних засобів з надзвичайно високою афінністю та селективністю дії.

Проте практичне використання природних олігонуклеотидів досить обмежене через нестабільність їх комплексів з НК-мішенями, нестійкість в присутності клітинних нуклеаз та низьку здатність проникати через клітинні мембрани. Це надало істотного поштовху до синтезу різним чином модифікованих олігомерів з метою подолання вказаних недоліків.

Останнім часом синтезована значна кількість аналогів нуклеїнових основ, нуклеозидів, нуклеотидів та олігонуклеотидів, модифікованих по гетероциклічному, вуглеводному або фосфатному фрагментах молекул. Бурхливого розвитку цей напрямок набув, у першу чергу, завдяки виявленню серед цього класу сполук речовин з протипухлинними, антивірусними та імуномодулюючими властивостями. Деякі з них уже широко застосовуються в медичній практиці або проходять клінічні випробування.

Модифіковані олігонуклеотиди все ширше використовуються як ДНК-зонди, праймери для ПЛР, в антисенсовій/антигенній технології, тощо. Розробка методів модифікації олігонуклеотидів з метою надання їм цінних властивостей (стійкості до нуклеаз, покращання проникнення через клітинні мембрани, можливості нерадіоактивної детекції та ін.) набуває все більшої актуальності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках Національної програми “Профілактика СНІД в Україні” за темою “Розробка нових ефективних методів діагностики СНІД, що базуються на використанні нерадіоактивних олігонуклеотидних міток” (0395U01037), науково-дослідної роботи “Створення високочутливих тест-систем для діагностики і пригнічення життєздатності мікоплазм, причетних до захворювань СНІД, а також респіраторного та урогенітального трактів людини” (0194U005451) та у відповідності з планами робіт лабораторії хімії природних сполук Університету м. Лімож (Франція).

Мета і задачі дослідження. Синтез модифікованих олігодезоксирибонуклеотидів (кон'югація з репортерними сполуками, модифікація міжнуклеотидних зв'язків, гетероциклічних основ, введення в олігомер неприродних аналогів нуклеозидів) та дослідження їх властивостей.

Основні задачі дослідження:

Синтез та вивчення властивостей нових неприродних аналогів нуклеозидів;

Розробка методів модифікації олігонуклеотидів введенням в олігомерний ланцюг неприродних аналогів нуклеозидів;

Створення зручного реагенту для флуоресцентного мічення олігонуклеотидів;

Синтез тіофосфатних аналогів олігонуклеотидів - інгібіторів процесів трансляції в клітинах молікутів;

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблені методи синтезу піразинонових і тимінових аналогів ацикловіру, їх азидо- та глікозильованих похідних.

Створений зручний метод модифікації олігонуклеотидів нуклеозидним похідним імідазофеназину, приєднаним до 3'-кінця олігомеру. Показано, що приєднаний таким способом нейтральний феназин істотно підвищує стабільність комплексів з НК.

Одержано ефективний Н-фосфонатний реагент для прямого 5'-флуоресцентного мічення олігонуклеотидів в процесі їх синтезу.

Синтезовано ряд тіофосфатних аналогів олігодезоксирибонуклеотидів, комплементарних до сигнатурних ділянок 16S рРНК молікутів, які ефективно інгібують процес трансляції в клітинах цих мікроорганізмів.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонований флуоресцеїн-Н-фосфонат дозволяє отримувати флуоресцентно-мічені олігонуклеотиди в одну стадію в процесі їх синтезу в твердофазному варіанті, або в розчині. Одержані флуоресцентно-мічені олігомери зручні для використання в молекулярно-біологічних дослідженнях і в медицині, як альтернатива ізотопним міткам.

Тіофосфатні аналоги олігонуклеотидів, комплементарних до сигнатурних ділянок 16S рРНК молікутів виявилися надзвичайно ефективними інгібіторами трансляції, стійкими до дії нуклеаз. Висока селективність антисигнатурних олігодезоксирибонуклеотидів є передумовою для цілеспрямованого створення на їх основі антимікробних хіміотерапевтичних засобів.

Особистий внесок здобувача. Дисертант безпосередньо виконував усі роботи по хімічному синтезу та фізико-хімічному аналізу, самостійно проводив узагальнення та інтерпретацію отриманих результатів. Біологічні, медико-біологічні і флуоресцентні дослідження отриманих сполук здійснені у відділах мікоплазмології Інституту мікробіології та вірусології НАН України, молекулярної біофізики Фізико-технічного інституту низьких температур НАН України та в Інституті вірусології Університету Луї Пастера (м. Страсбург, Франція).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи розглянуті та обговорені на Першому з`їзді Українського біофізичного товариства (Київ, 1994), на Першій Національній науково-практичній конференції з проблем ВІЛ/СНІД (Київ, 1995), на XVI Середземноморській конференції з цукрів (XVIemes Journees Mediterraneennes des Glucides (L'Isle-sur-la-Sorgue, Франція, 1996), на конференції “Органічна хімія: зв'язок з біохімією” (Journee “Chimie Organique: Interface avec la Biochimie” (Poitiers, Франція, 1996).

Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях вченої ради та наукових семінарах в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, в лабораторії хімії природних сполук Університету м. Лімож і в лабораторії біоорганічної хімії Університету м. Бордо (Франція).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 праць, з них 4 статті в наукових фахових журналах і 4 тези конференцій та з'їздів.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (1 розділ, 2 підрозділи), експериментальної частини (2 розділи, 9 підрозділів), висновків і списку використаних літературних джерел (189 найменувань). Робота викладена на 123 сторінках машинописного тексту та містить 57 ілюстрацій і 23 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Синтез і властивості неприродних аналогів нуклеозидів

З часу відкриття 9-[2-(гідроксиетокси)метил]гуаніну (ацикловір), селективного антигерпесного агенту, значний інтерес був спрямований на синтез нових ациклічних аналогів нуклеозидів. В результаті цих досліджень виявлено ряд гідроксиалкілованих похідних гуаніну з антивірусними властивостями. Недавно показано, що деякі 6-заміщені ациклічні піримідинові нуклеозиди близькі до ацикловіру, наприклад, 1-[2-(гідроксиетокси)метил]-6-(фенілтіо)тимін (НЕРТ), є селективними інгібіторами ВІЛ в різних лімфоцитах людини.

В нашій роботі здійснений синтез нових аналогів ацикловіру (похідних піразину і тиміну) та трансформація 4'-положення гідроксибутильного ланцюга гідроксиалкілованих нуклеозидів азидуванням і глікозилюванням.

Гідроксибутил- та азидобутилпіразинони

Приєднання бутильного ланцюга до піразинонів 1а,b,c здійснювали за схемою, наведеною на Рис. 1. (і) До охолодженого до 0 ⁰С розчину піразинону в DMF додавали 1,2 екв. NaH, перемішували 2 год і, при кімнатній температурі, додавали 1,2 екв. 4-бромбутилацетату. Через 16 год одержували суміш, що складалась з продуктів (2) та (4), які розділяли хроматографією на колонці з силікагелем. Їх детекція полегшувалася завдяки тому, що N-заміщені сполуки абсорбують при 254 нм та флуоресціюють при 365 нм, тоді як О-заміщені похідні позбавлені флуоресценції.

Дані ІЧ-спектрів дозволили ідентифікувати місце приєднання ацетоксиалкільного залишку. Продукт 2а дає смугу поглинання  = 1645 см^-1, що відповідає коливанням карбонілу піразину. Ця смуга відсутня у випадку продукту 4а, для якого виявлено область поглинання при 1220 см^-1 та 1100 см^-1, що відповідає асиметричним та симетричним коливанням C_Ar-O-C_Alk. На обох спектрах присутня смуга  = 1720 см^-1, що відповідає валентним коливанням карбонілу ацетильної групи. Сполуки 2b,с та 4b,с мають спектри аналогічні до сполук сімейства а. Для мас-спектрів характерні інтенсивний пік протонованого молекулярного іону (М+Н)⁺ та піки, що відповідають фрагментам з видаленими OAc-групами та алкільними залишками.

В результаті деблокування 2а,b,с та 4а,b,с 2 екв. метилату натрію одержані сполуки 3а,b,с та 5а,b,с (Рис. 1, іі). Виходи 90-96 %.

Рис. 1



Відщеплення ацетильної групи підтверджено методами ІЧ- та ЯМР-спектроскопії. На ІЧ-спектрах зареєстровано зникнення смуги валентного коливання С=О ацетилу ( = 1720 см^-1) і поява смуги в області поглинання між 3500 та 3200 см^-1, що відповідає коливанням гідроксильної групи. На ¹Н-ЯМР-спектрах сполук 3а,b,с та 5а,b,с сигнали протонів Н алкільного ланцюга зсунуті в більш сильне поле (3,58-3,65 м.д.), ніж сигнали ідентичних протонів вихідних ацетильованих продуктів (4,10-4,15 м.д.).

Азидування гідроксильованих сполук (ііі) складається з двох етапів: приєднання до гідроксилу групи, що легко видаляється (найбільш широко використовується тозильна група), та подальше нуклеофільне заміщення її на азидогрупу.

Спроба здійснити тозилювання 1-(4-гідроксибутил)-2-піразинону за методом Рено навіть протягом 72 год реакції при кімнатній температурі бажаного продукту не дала. Підвищення температури теж не привело до задовільного результату. Тому тозилювання замінили мезилюванням, яке здійснювали у безводному піридині в присутності 4 екв. мезилхлориду (MsCl, CH₃-SO₂-Cl).

Виявилося, що мезильований продукт нестабільний навіть при кімнатній температурі - через годину реакції помічена його деградація (виникнення багатьох плям на ТШХ). Бажаний продукт утворювався лише при 0 ⁰С. Тому отриману суміш використовували в реакції азидування без додаткової очистки, яку здійснювали в DMF при 100 ⁰С в присутності 5 екв. NaN₃. Через 1 год реакційну суміш екстрагували хлороформом і очищали препаративною хроматографією на колонці з силікагелем. При таких же умовах експерименту отримані азиди 2-О-заміщених (4-гідроксибутил)-2-піразинонів 5а,b,с. Контроль за ходом реакції здійснювали за допомогою ІЧ-спектроскопії: поява інтенсивної смуги поглинання в області  = 2110 см^-1 свідчить про приєднання азидогрупи до алкільного ланцюга. Ця смуга присутня в ІЧ-спектрах усіх синтезованих азидопохідних. В мас-спектрах 6а,b,с та 7a,b,c наявні інтенсивні піки протонованого молекулярного іону МН⁺. При аналізі ¹Н-ЯМР-спектрів сполук 6 і 7 помічено, що введення азидогрупи не впливає на величини хімічних зсувів піразинових протонів та протонів H, Н та Н алкільного ланцюга. Проте для протонів Н спостерігається зсув в більш сильне поле ( 3,34-3,37 м.д.), ніж для ідентичних протонів вихідних гідроксильованих продуктів ( 3,58-3,65 м.д.). Те ж саме спостерігається і при аналізі ¹³С-ЯМР-спектрів: для сигналів С помітний значний зсув в область сильного поля 50,8 м.д. порівняно з 62,0-62,3 м.д. для гідроксильованих речовин.

Піразинонові рибонуклеозиди з модифікованим глікозидним зв'язком

Створення нового типу аналогів нуклеозидів, що містять спейсер між гетероциклічною основою та цукровим залишком - N₁-[4-(-D-рибофуранозилокси)-бутил]-3-алкіл-2-піразинонів з групами Н-, СН₃- або С₁₀Н₂₁- в 3-му положенні основи, може привести до одержання сполук з цікавими біологічними властивостями, чи оригінальних модифікованих олігонуклеотидів при введенні їх в олігомерний ланцюг.

Реакцію глікозилювання здійснювали з використанням 1-О-ацетил-2,3,5-три-О-бензоїл--D-рибофуранози та системи SnCl₄/ацетонітрил. Реакції вели при кімнатній температурі в безводному середовищі (Рис. 2, iv).

Рис. 2



Поява в ІЧ-спектрах характерної для ефірів смуги біля 1730 см^-1 свідчить про наявність в молекулі бензоїльованого глікозиду. Мас-спектри кожної із сполук демонструють наявність піку протонованого молекулярного іону [M+H]⁺. На ¹Н-ЯМР-спектрах (CDCl₃) інтерпретовані сигнали, що відповідають протонам основи, бутильного ланцюга та бензоїльованого цукру. Аномерний протон резонує у формі розширеного синглету  5,23 м.д. замість звичайного дублету у випадку нуклеозидів. При аналізі ¹Н-ЯМР-спектрів в одержаних сполуках помічена наявність домішки -аномеру (близько 20%), тобто уникнути рацемізації в ході реакції не вдалося.

Дебензоїлювання нуклеозидів 8а,b,с (ii) здійснювали метилатом натрію за методом Холі та співр. За даними ТШХ через 2 год весь вихідний продукт було деблоковано. Глікозиди 9а,b,с отримували з виходами 75-89%. Структуру сполук підтверджено ІЧ-спектрами (зникнення смуги поглинання біля 1750 см^-1, що відповідає за валентні коливання С=О бензоатів), мас-спектрами (наявний інтенсивний пік протонованого молекулярного іону [M+H]⁺), а також спектрами абсорбції УФ (CH₃OH) (присутній лише один максимум біля 318 нм, що відповідає піразиноновим гетероциклам; пік абсорбції бензоїльних груп біля 248 нм відсутній). Протонні ЯМР-спектри (СD₃ОD) показують зникнення піків, що відповідають протонам трьох бензоїльних груп. В ¹³С-ЯМР-спектрах інтерпретовано сигнали вуглеців основи, алкільного ланцюга та дебензоїльованої рибози, причому для сигналів С-1 та С-4 помітний істотний зсув в область слабого поля, можливо, через зникнення анізотропного ефекту бензоїльних груп ( = 2,2 та 4,8 відповідно).

Синтез модифікованих похідних тиміну

Серед чисельного класу неприродних аналогів нуклеозидів важливе місце займають модифіковані похідні тимідину. Найбільш відомі серед них AZT та D₄T, що проявляють значну антивірусну активність. З метою одержання нових похідних цього нуклеозиду ми синтезували гідроксибутильні та модифіковані по глікозидному зв'язку його аналоги.

Гідроксибутилювання здійснювали у відповідності зі схемою, наведеною на Рис. 3,(i). До розчину тиміну в свіжоперегнаному DMF додавали 1,5 екв. гідриду натрію, суміш тримали при 100 С 4 год, охолоджували до кімнатної температури та додавали 1,1 екв. 4-бромбутилацетату. Розчин залишали на 2 год. при кімнатній температурі, після чого підігрівали до 100 С і тримали при цій температурі ще 7 год. Одержували суміш трьох сполук, які легко розділялись хроматографією на колонці: N₁-алкілований (10) і N₁,N₃-діалкілований (11) продукти з виходами 15% та 24% відповідно, та 3% О-алкілованої (12) похідної. Їх легко ідентифікувати за допомогою ЯМР-спектрометрії (протони основи резонують у різних формах - Н-1 має вигляд дублету, Н-3 - синглету).

Встановлено, що оптимального виходу монозаміщеної сполуки 10 (55%) при загальному виході 89% можна досягти при використанні надлишку алкілуючого реагенту. Це протирічить раніше опублікованим результатам, в яких підвищення виходу моноалкілованого продукту завжди досягали при використанні стехіометричних кількостей реагентів, або надлишку основи.

Рис. 3

З метою одержання диглікозидного похідного тиміну сполуку 11 дезацетилювали 1,5 екв. метилату натрію (Рис. 3,II). Відщеплення обох ацетильних груп підтвердили методами ІЧ-спектрометрії (зникнення смуги валентного коливання С=О ацетилу при  = 1720 см^-1) та протонної ЯМР-спектрометрії (зміщення сигналів протонів Н в область більш сильного поля від 4,09 та 4,07 до 3,67 м.д.).

Сполуку 13 глікозилювали за розробленим для піразинонів методом. Діалкіловане похідне розчиняли в свіжоперегнаному ацетонітрилі, додавали 2,2 екв. 1-О-ацетил-2,3,5-три-О-бензоїл--D-рибофуранози та таку ж кількість SnCl₄. Реакцію вели в атмосфері аргону протягом 3 год. Одержану суміш розділяли хроматографією на колонці. Вихід продукту 14 - 64%. Про проведене глікозилювання свідчить наявність на ¹Н-ЯМР-спектрі сигналів бензоїльованого цукру. Відношення інтегральних інтенсивностей сигналів протонів вуглеводів, бензоїльних груп та основи підтверджує наявність в молекулі двох глікозидних залишків.

Після обробки 14 метилатом натрію протягом 4 год, нейтралізації та екстракції з наступним упарюванням водної фази отримували 82 % цільового продукту 15.

Отже, в результаті проведеного дослідження розроблені методи синтезу ациклічних нуклеозидів - піразинонових і тимінових аналогів ацикловіру та їх азидо- і глікозидних похідних: N₁- та 2-О-(4-гідроксибутил)-, N₁- та 2-О-(4-азидобутил)-, N₁-[4-(-D-рибофуранозилокси)-бутил]-3-алкіл-2-піразинонів, N₁,N₃-ди-(4-гідроксибутил)тиміну та N₁,N₃-ди-[4-(-D-рибофуранозилокси)-бутил]тиміну.

Синтезовано та досліджено ІЧ-, мас-, ¹Н та ¹³С ЯМР-спектри 30 нових сполук. модифікований гетероциклічний олігодезоксирибонуклеотид

Більшість отриманих сполук перевірена на їх in vitro інгібуючу дію на реплікацію ряду вірусних ДНК (простого вірусу герпесу типу 1, цитомегаловірусу людини, вірусу вакцини) та вірусних РНК (вірус Coxsackie B4).

Сполуки, що містять гідроксибутильні залишки, не виявили істотної противірусної активності. Модифікація 4'-положення гідроксильної групи азидуванням (6a,b,c та 7a,b,c) чи глікозилюванням (9a,b,c) не покращила їх властивостей.

При проведенні двох проб на анти-ВІЛ 1 активність жодна з досліджених сполук не виявила антивірусного ефекту в концентраціях, нижчих від мінімальної концентрації, яка викликає помітні зміни життєздатності клітин MT-4 і CEM хазяїна.

Синтез і властивості 5'-, 3'-кон'югатів та тіофосфатних аналогів олігодезоксирибонуклеотидів

Модифiкованi олігонуклеотиди, якi мiстять ковалентно приєднанi залишки iнших молекул (флуорофори, інтеркалятори, аналоги нуклеозидів, лiпофiльні молекули та iн.), широко застосовуються в молекулярно-бiологiчних і медичних дослiдженнях та в бiотехнологiї. Значний інтерес викликають тіофосфатні аналоги олігонуклеотидів завдяки їх стійкості до дії нуклеаз. У зв'язку з цим розробка нових методів 5'- та 3'-модифікації олігомерів, дизайн та синтез тіофосфатних аналогів мають важливе теоретичне і практичне значення.

Синтез і властивості олiгонуклеотидiв, модифiкованих нуклеозидом iмiдазофеназину

Приєднання інтеркаляторів (акридин, антрахiнон, фенантролiн, феназин та iн.) до синтетичних олігонуклеотидів значно пiдвищує стабiльнiсть дво- та триспіральних комплексів таких олігомерів з комплементарними послiдовностями НК, в результатi чого зростає ефективнiсть взаємодiї олігонуклеотиду з його мiшенню без помiтної втрати специфiчностi, що особливо важливо для iнгiбування експресії генiв. Особливий iнтерес становлять аналоги нуклеозидів, що мiстять залишки iнтеркаляторів як аглiкони. Такi нуклеозиди можна вводити в заданi положення олiгонуклеотидної послiдовності безпосередньо в процесi її хiмiчного синтезу.

В нашій роботі використаний аналог нуклеозидів - N1-рибозид iмiдазо [4,5-b] феназину (Pzn), одержаний силільною конденсацією гетероциклу з перацильованою рибозою. Ранiше спектрально-флуоресцентними дослiдженнями показано, що похiднi iмiдазофеназину взаємодiють з нуклеїновими кислотами за механiзмом iнтеркаляцiї, стабiлiзуючи полiнуклеотиднi дуплекси.

Для синтезу олiгонуклеотидних послiдовностей, що мiстять аномальний нуклеозид на 3'-кiнцi, отримано полiмерний носiй з іммобілізованим Pzn (Рис. 4,1) приєднанням його тритолілметильного похідного до амінопропільованого силікагелю "Силохром С-80" через сукцинатну лінкерну групу за допомогою методів, звичайних для отримання нуклеозидвмісних полімерів. При цьому утворюється складноефiрний зв'язок мiж СООН-групою полiмеру та 2'- або 3'-гiдроксилом нуклеозиду, тобто, полiмер мiстить нуклеозиднi залишки, ковалентно зв'язанi по двох положеннях. Це не впливає на одержання олiгонуклеотидних продуктiв, оскiльки пiсля вiдщеплення олiгомеру з носiя в обох випадках утворюється олiгонуклеотид з 3'-кiнцевим Pzn. 3'(2')-Гiдроксильнi групи іммобілізованих нуклеозидів блокували ацилюванням оцтовим ангiдридом в пiридинi.

Синтез природних та модифікованих (Рис. 4) олігонуклеотидів здійснювали стандартним Н-фосфонатним твердофазним методом як в автоматичному, так i в ручному варiантi. Середнiй вихiд реакцiй конденсацiї становив 96-97% на стадiю.

Рис. 4

Пiсля завершення нарощування олiгонуклеотидного ланцюга та окислення гiдрофосфорильних груп олiгонуклеотиди вiдділяли від полiмерного носiя та деблокували, обробляючи концентрованим NH₃ протягом ночі (при кімнатній температурі для оліготимідилату та при 50 ⁰C для (dA)₁₅), а цiльовi продукти очищали препаративним гель-електрофорезом. Олiгонуклеотид, в складi якого знаходиться нуклеозид iмiдазофеназину, легко виявити в гелi при УФ-опромiненнi у виглядi чiткої смуги з жовтою флуоресценцiєю.

Дослiдженi фiзико-хiмiчнi властивостi синтезованих олiгонуклеотидних послiдовностей. В їхнiх електронних спектрах поглинання поруч з УФ-поглинанням олiгонуклеотиду та iмiдазофеназину при 260-270 нм реєструється смуга адсорбцiї барвника у видимiй областi (375-385 нм). При цьому спiввiдношення iнтенсивностей поглинання модифiкованих послiдовностей в УФ- i видимiй областi знаходились у вiдповiдностi з розрахованими за коефiцiєнтами екстинкцiї iнтеркалятора та олiгонуклеотиду. Показано, що введення 3'-термiнального нуклеозиду iмiдазофеназину в декатимiдилат (dT)₁₀ збiльшувало температуру плавлення його дуплексiв з poly-A або (dA)₁₅ на 10-12 ⁰С і, ще бiльше (на 15-20 ⁰С), стабiлiзувало потрiйнi комплекси модифiкованого (dT)₁₀. Спектроскопiчнi дослiдження взаємодiї з ДНК показали, що основним типом зв'язування нейтрального хромофора iмiдазофеназину є iнтеркаляцiя барвника, тодi як у випадку четвертинних солей феназинiю значний вклад в утворення комплексiв вносять також електростатичнi взаємодiї з фосфатними групами. На нашу думку, в останньому випадку знижується специфiчнiсть впiзнавання послiдовностей-мiшеней модифiкованими олiгонуклеотидами порiвняно з олiгомерами, що мiстять нейтральний iмiдазофеназин. При цьому стабiлiзуючий вплив нейтральних та катiонних iнтеркаляторів феназинового ряду на комплементарнi комплекси практично однаковий.

Отже, розроблено зручний метод синтезу олiгонуклеотидів, модифiкованих рибонуклеозидом iмiдазо [4,5-b]феназину в 3'-положенні. Показано, що цей нуклеозид як ефективний iнтеркалятор в складi модифiкованих олiгонуклеотидів істотно посилює стабiльність комплексів з комплементарними НК та пiдвищує стiйкiсть олігомерів до дiї клiтинних нуклеаз. Ймовiрно, що завдяки своїм лiпофiльним властивостям він здатний покращити транспорт антисенсових олiгонуклеотидів в клiтину. Слід зазначити, що iнтенсивна флуоресценцiя цього хромофора (максимум емiсiї барвника в складi олiгонуклеотидів спостерiгається при 537-539 нм) робить його зручною репортерною групою для детекцiї НК та для вивчення процесiв комплексоутворення.

Флуоресцеїновий реагент для твердофазного 5`-мічення олігонуклеотидів

Флуоресцентні барвники як і інші репортерні молекули можуть бути ковалентно приєднані до олігонуклеотиду різними методами. Звичайно мічення олігонуклеотидів здійснюється пост-синтетичними процедурами. Проте реакційна суміш, що при цьому утворюється, містить вихідний олігонуклеотид разом з міченим продуктом, який необхідно розділяти за допомогою ВЕРХ, більше того, видалення надлишку барвника може створювати серйозні проблеми. На наш погляд, пряме мічення в процесі хімічного синтезу більш перспективне. При такому підході відповідний реагент приєднують до 5`-кінця захищеного олігомера безпосередньо під час його твердофазного синтезу в умовах реакції міжнуклеотидної конденсації. Це можливе у тому випадку, коли репортерна молекула перетворена в фосфамідне, Н-фосфонатне чи фосфодіефірне (в залежності від обраного методу синтезу) похідне, стійке на стадіях конденсацій та деблокування.

Для синтезу олігонуклеотидів нами обрано Н-фосфонатний метод, який відзначається простотою, високою швидкістю та ефективністю. Метод базується на конденсації нуклеозид-Н-фосфонатів з нуклеозидними компонентами на полімерному носії в присутності конденсуючого реагенту, як правило, півалоїлхлориду. Фосфатзахисні групи в цьому підході не використовуються, а після завершення нарощування олігонуклеотидного ланцюга всі Н-фосфонатні діефіри окислюють одноразово.

Рис. 5

При виборі флуоресцентного барвника ми виходили з того, що для досягнення максимальної чутливості флуоресцентна мітка повинна мати одночасно як iнтенсивне поглинання, так і високий квантовий вихід флуоресценції. Серед досліджених барвників одним з найбільш оптимальних виявився флуоресцеїн (????????????квантовий вихід до 90 %).

Для використання флуоресцеїну в цьому методі синтезу його було отримано у вигляді Н-фосфонатного реагенту за розробленою нами методикою (Рис. 6). В результаті етерифікації флуоресцеїну метанолом в присутності H2SO4 отримували його метиловий ефір (1). Для введення лінкерної групи фенольний гідроксил алкілували (4,4'-диметокситритил)-4-хлорбутанолом-1 в DMF в присутності K₂CO₃ і KI як каталізатора. О-Захищений 4-хлорбутанол-1 легко отримати тритилюванням спирту в піридині. Проміжний продукт (2а) детритилювали і отриманий метиловий ефір 6-(4-гідроксибутил)флуоресцеїну (3а) фосфорилювали PTri3. Реакцію вели в суміші ацетонітрил-піридин у зв`язку з низькою розчинністю (3а) в ацетонітрилі. Н-фосфонат (4а) виділяли на колонці з силікагелем. Сполуки (1)-(4) охарактеризовані за допомогою елементного аналізу та спектрів флуоресценції.

Рис. 6

Флуоресцеїн-Н-фосфонат (4а) використали при одержанні 5'-флуоресцеїнмічених олігонуклеотидних праймерів для ампліфікації ділянок LTR та env геному HIV-1:

SK-29 5`-ACT AGG GAA CCC ACT GCT -3` (18)

SK-30 5`-GGT CTG AGG GAT CTC TA -3` (17)

SK-68 5`-AGC AGC AGG AAG CAC TAT GC-3` (20)

SK-69 5`-CCA GAC TGT GAG TTG CAA CAG-3` (21)

Хімічний синтез олігонуклеотидів здійснювали твердофазним Н-фосфонатним методом з середніми виходами 98-98,5 % на стадію. Після приєднання останнього нуклеотиду і детритилювання безпосередньо на полімері вводили флуоресцентну мітку за допомогою флуоресцеїн-Н-фосфонату (4а). Конденсацію здійснювали ручним методом в стандартних умовах, як і у випадку нуклеозид-Н-фосфонатів, за винятком довшого часу конденсації (4-5 хв.). Виходи на цій стадії практично кількісні.

Проведені дослідження спектрально-флуоресцентних властивостей одержаних сполук. Для них в УФ-спектрі характерні 2 максимуми поглинання ?max: 260 нм і 454 нм. Поглинання мічених праймерів при 260 нм зумовлені в основному олігонуклеотидною частиною, а в видимій області (454 нм) - виключно барвником. При виділенні Flu-мічених праймерів електрофорезом у ПААГ вони добре видні як смуги із жовто-зеленою флуоресценцією в районі 510 нм. Електрофоретична рухливість міченого олігонуклеотиду завдяки наявності додаткового фосфодіефірного зв`язку нижча, ніж неміченого тієї ж послідовності. Це дозволяє ефективно відділити вихідний олігонуклеотид від міченого продукту. При обернено-фазовій хроматографії мічений олігонуклеотид характеризується більшим часом утримання. Кількість флуоресцеїн-міченого олігонуклеотиду, що може бути зафіксований неозброєним оком у вигляді плями на фільтрувальному папері, складає 1-5 пмоль.

Таким чином, використання синтезованого нами флуоресцеїнового реагенту (4а) дозволяє ефективно вводити флуоресцентну мітку в нуклеозиди і олігонуклеотиди. Він може бути використаний в твердофазному методі синтезу олігонуклеотидів за стандартною процедурою синтезу, деблокування та очистки, значно спрощуючи процес одержання флуоресцентно-мічених олігомерів.

Антисигнатурні олігонуклеотиди - нові антимікробні засоби

Зростання стійкості мікроорганізмів до існуючих препаратів стало передумовою пошуку альтернативних антимікробних засобів, які за механізмом дії відрізняються від антибіотиків. Відповідні дослідження, розпочаті в 1978 році, були спрямовані на створення олігонуклеотидів, комплементарних до специфічних ділянок НК-мішеней, які блокували б процеси реплікації і транскрипції геномної ДНК або унеможливлювали трансляцію на рибосомах вже транскрибованих з ДНК інформаційних РНК (іРНК). Проте вплив олігонуклеотидів на такі мішені з терапевтичної точки зору виявився з тих чи інших причин недостатньо ефективним. Істотним недоліком антисенсових олігонуклеотидів є необхідність інгібування кожної новосинтезованої іРНК, що різко підвищує витрати цих реагентів, концентрація яких повинна сягати 50 і більше мкмоль/л, щоб стати згубною для мікробу, що стає токсичним і для макроорганізму.

Поза увагою дослідників залишилися новосинтезовані (ще не включені в рибосоми) рРНК як мішені для дії на них комплементарними олігонуклеотидами з метою виключення рибосом з процесу трансляції. В рРНК, особливо в 16S рРНК, виявлені послідовності, унікальні для окремих видів мікроорганізмів. Використовуючи ці послідовності як мішені можна пригнічувати життєдіяльність окремих видів патогенних мікроорганізмів.

Перевірка цієї гіпотези здійснювалася на патогенних мікоплазмах (клас Mollicutes). Мішенями для дії олігонуклеотидів обрано специфічні (“сигнатурні”) послідовності нуклеотидів 16S рРНК молікутів: 1) 5`-CUAACUAUG-3` - (послідовність 499-507) та 2) 5`-UAAUACAUAG-3` - (523-532).

Нами синтезовано природні та модифіковані по міжнуклеотидних зв'язках олігодезоксирибонуклеотиди, комплементарні (“антисигнатурні”) до цих послідовностей, а також тіофосфорильовані олігонуклеотиди з паралельними послідовностями (Таблиця 1).

Синтез здійснювали твердофазним Н-фосфонатним методом (Рис. 5). При одержанні тiофосфатних аналогів олiгонуклеотидiв на заключнiй стадiї синтезу гiдрофосфорильні групи олiгонуклеотидного ланцюга окислювали безпосередньо на полiмерному носiї елементарною сiркою у вiдповiдних розчинниках. Після деблокування конц. NH₃ протягом ночі при 50 ⁰С тіофосфати олігонуклеотидів виділяли препаративним електрофорезом у поліакриламідному гелі.

Таблиця 1

Послідовності синтезованих олігодезоксирибонуклеотидів

N	Послідовність (5'-3')	Комплементарність до ділянок 16S рРНК
1	d(CpsApsTpsApsGpsTpsTpsApsG) (9)	комплементарний (499-507)
2	d(CpsTpsApsTpsGpsTpsApsTpsTpsA) (10)	комплементарний (523-532)
3	d(GpsApsTpsTpsGpsApsTpsApsC) (9)	паралельний (499-507)
4	d(ApsTpsTpsApsTpsGpsTpsApsTpsC) (10)	паралельний (523-532)
5	d(CATAGTTAG) (9)	комплементарний (499-507)
6	d(CTATGTATTA) (10)	комплементарний (523-532)

Примітка: ps - тіофосфат

Встановлено, що нативні олігонуклеотиди 5 і 6 повністю гідролізуються при контакті з клітинами мікоплазм за 6 год. Тіофосфатні аналоги виявилися практично повністю стійкими до дії нуклеаз протягом 3-х діб їх експозиції з клітинами молікутів.

Дослідження впливу синтетичних олігонуклеотидів на трансляцію полі(U)-матриці в безклітинній системі білкового синтезу показали ефективне інгібування активності рибосом (до 21 %) при використанні олігонуклеотиду 1, та трохи менше (до 19 %) - олігонуклеотиду 2 (Рис. 7). Комплементарні олігомери з паралельною послідовністю (3 і 4) не впливали на рівень активності рибосом ахолеплазм.

Інгібування, %

концентрація олігонуклеотиду, мкМ

Рис. 7



Кінетичні дослідження синтезу білка в клітинах молікутів показали падіння синтезу лише після 4 год інкубації з тіофосфатними похідними олігонуклеотидів 1 і 2 (на 73% в клітинах M. fermentas PG-8 з реагентом 2) (Таблиця 2). На наш погляд, олігонуклеотиди інгібують білковий синтез за рахунок комплементарної взаємодії з відповідними “сигнатурними”, функціонально важливими для молікутів ділянками синтезованої “de novo” 16S рРНК, блокування місця зв'язування рибосомального білка S4 та пошкодження в результаті цієї взаємодії збирання рибосомальної 30S субодиниці.

Таблиця 2

Пригнічення синтезу білка в клітинах молікутів тіофосфатними аналогами олігодезоксирибонуклеотидів (концентрація реагентів 1 мкМ)

Молікути	Реагент	Iнгібування, %
		4 год
Mycoplasma fermentas PG-18	-	0
M. fermentas PG-18	1	64
M. fermentas PG-18	2	73
Acholeplasma laidlawii PG-8	-	0
A.laidlawii PG-8	1	57
A.laidlawii PG-8	2	61

Про ефективність інгібування свідчить те, що при інкубації A. laidlawii PG 8 з тіофосфатами 1 та 2 їх дія на процеси трансляції помітна вже при концентрації агента 0,5 мкМ, а для клітин M. fermentans - навіть при 0,25 мкМ (2 знижував синтез білків майже на 40 %). Максимального інгібування трансляції досягали при 1 мкМ.

Таким чином встановлено, що антисигнатурні олігодезоксирибонуклеотиди, захищені від дії нуклеаз модифікацією міжнуклеотидних зв'язків, специфічно пригнічують трансляцію в клітинах молікутів інгібуючи функціональну активність їх рибосом. Висока селективність антисигнатурних олігодезоксирибонуклеотидів є передумовою для цілеспрямованого створення хіміотерапевтичних засобів проти тих чи інших збудників хвороб, чи їх груп, не шкідливих при цьому іншим мікроорганізмам і макроорганізму.



ВИСНОВКИ

Розроблені методи синтезу ациклічних нуклеозидів - піразинонових і тимінових аналогів ацикловіру та їх азидо- і глікозидних похідних: N₁- та 2-О-(4-гідроксибутил)-, N₁- та 2-О-(4-азидобутил)-, N₁-[4-(-D-рибофуранозилокси)-бутил]-3-алкіл-2-піразинонів, N₁,N₃-ди-(4-гідроксибутил)тиміну та N₁,N₃-ди-[4-(-D-рибофуранозилокси)-бутил]тиміну.

Синтезовано та досліджено спектральні властивості 30 нових сполук (ІЧ-, Мас-, ¹Н та ¹³СЯМР-спектрометрія). Перевірка похідних піразинонів на їх інгібуючу дію на реплікацію ряду вірусних ДНК та РНК in vitro не показала істотної активності.

Розроблено зручний метод синтезу олiгонуклеотидів, модифiкованих рибонуклеозидом iмiдазо[4,5-b]феназину в 3'-положенні. Показано, що цей нуклеозид як ефективний iнтеркалятор в складi модифiкованих олiгонуклеотидів істотно посилює стабiльність комплексів з комплементарними НК та підвищує стійкість олігомерів до дії клітинних нуклеаз. Завдяки інтенсивній флуоресценції хромофора він може стати зручною репортерною групою для детекції НК.

Створено ефективний реагент для прямого флуоресцентного мічення нуклеозидів і олігонуклеотидів в процесі їх синтезу в твердофазному варіанті, або в розчині. Одержані флуоресцентно-мічені олігомери можуть стати зручними для використання в молекулярно-біологічних дослідженнях і в медицині як альтернатива ізотопним міткам.

Синтезовані модифіковані по міжнуклеотидних зв'язках тіофосфатні аналоги олігодезоксирибонуклеотидів, комплементарні до відповідних сигнатурних ділянок 16S рРНК молікутів. Встановлено, що вони стійкі до дії нуклеаз, ефективно й специфічно пригнічують трансляцію у клітинах молікутів шляхом інгібування активності їх рибосом. Висока селективність антисигнатурних олігодезоксирибонуклеотидів є передумовою для цілеспрямованого створення на їх основі антимікробних хіміотерапевтичних засобів, не шкідливих іншим мікроорганізмам і макроорганізмові.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Davis J., Benhaddou R., Fedoryak O., Granet R., Krausz P., Bliard C., De Monte M., Aubertin A.M. Potential antiviral agents. Part II. Synthesis and antiviral evaluation of pyrazinones substituted with acyclic chains // Nucleosides & Nucleotides.-1998.-17, №8.-P. 1489-1504.

2. Dubey I.Ya., Fedoryak O.D., Tkachuk O.M., Fedoryak D.M.. Preparation of the fluorescein reagent for solid-phase oligonucleotide 5'-labelling and its use for the synthesis of fluorescently labelled PCR primers for HIV-1 detection // Биополимеры и клетка.- 1995.-11, №3-4.- С. 35-41.

3. Егоров О.В., Скрипаль И.Г., Дубей И.Я., Федоряк О.Д.,Федоряк Д.М. Ингибирование трансляции in vivo у молликутов тиофосфатными аналогами олигодезоксирибонуклеотидов. // Мікробіол. ж. - 1996.-58, №4.- С. 11-19.

4. Зозуля. В.М., Благой Ю.П., Дубей I.Я., Федоряк О.Д., Щербакова А.С., Федоряк Д.М. Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину // Биополимеры и клетка.-1998.-14, №1.-C. 54-61.

5. Дубей І.Я., Федоряк О.Д., Ткачук О.М., Прокопенко В.В., Луйк О.І., Федоряк Д.М. Флуоресцентномічені олігонуклеотидні зонди для детекції нуклеїнових кислот // Тези доп. на 1 з`їзді Українського біофізичного товариства.-К.-1994.-С. 90.

6. Дубей І.Я., Федоряк О.Д., Ткачук О.М., Федоряк Д.М. Флуоресцентний реагент для твердофазного синтезу нерадіоактивно мічених PCR праймерів для детекції HIV-1 // Збірник тез Першої Національної науково-практичної конференції з проблем ВІЛ/СНІД.- К.- 1995.- С. 52-53.

7. Davis J.M., Fedoriak O., Benhaddou R., Granet R., Krausz P. Synthese D'Analogues de L'Acyclovir de Type Pyrazinique // XVIemes Journees Mediterraneennes des Glucides.-L'Isle-sur-la-Sorgue.-1996.

8. Davis J.M., Benhaddou R., Fedoriak O., Granet R., Krausz P. Synthese de Nouveaux Analogues de L'Acyclovir // Journee “Chimie Organique:

АНОТАЦІЇ

Fedoryak O.D. Modified components of nucleic acids: synthesis and properties. - Manuscript.

Thesis for a candidate of sciences degree by speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. - The Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1999.

The dissertation is devoted to the development of new effective methods of the synthesis of modified oligodeoxyribonucleotides.

The synthesis of a series of 4'-substituted hydroxybutyl pyrazine and hydroxybutyl thymine analogues of the anti-herpes compound, acyclovir, is described. The transformations of the 4' position of the hydroxybutyl chain of hydroxyalkylated pyrazinones and thymine by azidation and by glycosylation were studied. Some of the prepared compounds were tested for their in vitro inhibitory effects on the replication of number of DNA and RNA viruses. No antiviral activity was observed with compounds substituted with an hydroxybutyl group. Modification of the 4' position of the hydroxyalkyl group by azidation or glicosylation did not improve their activity.

A phenazine nucleoside derivative (Pzn) was covalently linked to the 3'-end of an oligothymidylate via a ribose residue of the dye glycoside. Oligonucleotides were synthesized by H-phosphonate method on polymer support with derivatised riboside of imidazo[4,5-b]phenazine. The effect of such modification on duplex and triplex formation by (dT)₁₀ with (dA)₁₅ and poly(dA)poly(dT) was studied. The attachment of Pzn strongly enhanced the stability of these complexes due to the intercalation of the dye chromophore into the dA and dAdT strands. Temperature of half dissociation was increased by 12 ^oC for the duplex and by 20 ^oC for the triplex formation.

A full synthetic protocol for the preparation of the fluorescein H-phosphonate derivatives for oligonucleotide 5'-labelling during solid phase synthesis was elaborated. Fluorescein H-phosphonate reagent was used as a building block for solid phase oligonucleotide synthesis at the last step.

Oligonucleotides were synthesized by H-phosphonate method using Victoria 6M gene synthesizer with average coupling yields 98-98,5% per step. After the chain elongation has completed the fluorescein reagent was coupled to the 5'-hydroxyl group of oligonucleotide. The coupling was carried out manually under standard conditions, as for nucleoside H-phosphonates, except that coupling time was prolonged (4-5 min). The coupling yields at this step were almost quantitative.

The use of the fluorescein reagent permits the efficient introduction of the fluorescent label into oligonucleotides and nucleosides on solid phase as well as in solution. This reagent can be used in solid phase oligonucleotide synthesis without changing the ordinary synthesis, deblocking and purification procedures, and significantly simplify the preparation of fluorescein-labelled oligonucleotides.

Inhibition of mollicutes by synthetic oligonucleotides and their analogs complementary to specific “signature” regions of 16S rRNA was studied. Phosphorothioate oligonucleotide analogs were synthesized by standard solid-phase H-phosphonate method followed by oxydation of H-phosphonate oligomers with sulphur. It was shown that translation in vivo was inhibited efficiently (up to 73%) by thiophosphate analogs of oligonucleotides complementary to sequences 499-507 and 523-532 of 16S rRNA.

Antisignature oligonucleotides are considered as superspecific agents not leading to the development of resistance of mollicutes and believed to be the main future remedy against diseases caused by microorganisms lacking the system of nucleoside synthesis.

Key words: oligodeoxyribonucleotides, modification, fluorescent labelling, imidazophenazine, thioanalogs, pyrazinones, antisignaturic oligonucleotides.

Федоряк О.Д. Модифіковані компоненти нуклеїнових кислот: синтез і властивості. - Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - Біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 1999.

Дисертація присвячена синтезу модифікованих олігодезоксирибонуклеотидів (кон'югація з репортерними сполуками, модифікація міжнуклеотидних зв'язків, гетероциклічних основ, введення в олігомер неприродних аналогів нуклеозидів) та дослідженню їх властивостей.

Розроблені методи синтезу піразинонових і тимінових аналогів ацикловіру, їх азидо- та глікозильованих похідних. Одержано ефективний Н-фосфонатний реагент для прямого 5'-флуоресцентного мічення олігонуклеотидів в процесі їх синтезу. Створений зручний метод модифікації олігонуклеотидів нуклеозидним похідним імідазофеназину, приєднаним до 3'-кінця олігомеру. Показано, що приєднаний таким способом нейтральний феназин істотно підвищує стабільність комплексів з НК. Синтезовано тіофосфатні аналоги олігодезоксирибонуклеотидів, комплементарні до сигнатурних ділянок 16S рРНК молікутів, які ефективно інгібують процес трансляції в клітинах цих мікроорганізмів.

Ключові слова: олігодезоксирибонуклеотиди, модифікація, флуоресцентне мічення, імідазофеназин, тіоаналоги, піразинони, антисигнатурні олігонуклеотиди.

Федоряк О.Д. Модифицированные компоненты нуклеиновых кислот: синтез и свойства. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 1999.

Диссертация посвящена синтезу модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов (коньюгация с репортерными соединениями, модификация межнуклеотидных связей, гетероциклических оснований, введение в олигомер неприродных аналогов нуклеозидов) и исследованию их свойств.

Разработаны методы синтеза пиразиноновых и тиминовых аналогов ацикловира, их азидо- и гликозилированных производных. Получен эффективный Н-фосфонатный реагент для прямого 5'-флуоресцентного мечения олигонуклеотидов в процессе их синтеза. Создан удобный метод модификации олигонуклеотидов нуклеозидным производным имидазофеназина, присоединенным к 3'-концу олигомера. Показано, что присоединенный таким способом нейтральный феназин существенно повышает стабильность комплексов с НК. Синтезированы тиофосфатные аналоги олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарные сигнатурным участкам 16S рРНК молликутов, эффективно ингибирующие процесс трансляции в клетках этих микроорганизмов.

Ключевые слова: олигодезоксирибонуклеотиды, модификация, флуоресцентное мечение, имидазофеназин, тиоаналоги, пиразиноны, антисигнатурные олигонуклеотиды.

Размещено на Allbest.ru

...