Механiзми дiї хлориду ртутi та хлориду кобальту на активнiсть амiнолевулiнатсинтази в печiнцi щурiв

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Механiзми дiї хлориду ртутi та хлориду кобальту на активнiсть амiнолевулiнатсинтази в печiнцi щурiв

1. Загальна характеристика робоТИ

ртуть хлорид біосинтез печінка

Актуальність теми. Широке використання важких металів в виробничих цілях, збільшення об'єму їх добування та переробки спричинили останнім часом значне накопичення важких металів та їх сполук в навколишньому середовищі [Трахтенберг И.М., Колесников В.С., Луковенко В.П., 1994]. Надлишкове надходження металів до організму людини та тварин викликає різноманітні функціональні та метаболічні порушення [Москалев Ю.И., 1985; Ершов Ю.А., Плетенева Т.В., 1989], у тому числі пов'язані з біосинтезом гему та гемопротеїнів [Marks G., 1985]. Розвиток токсичних порфірій та зниження вмісту клітинних гемопротеїнів під впливом солей важких металів в значній мірі є наслідком порушення регуляції ключового ферменту біосинтезу гему -амінолевулінатсинтази (КФ 2.3.1.37) [Rimington C., 1989]. Встановлено, що солі кобальту, платини, нікелю або заліза викликають двохфазні зміни активності -амінолевулінатсинтази (-АЛК-синтази) в печінці ссавців: зниження в перші години і подальше підвищення [Maines M.D., 1984; Калиман П.А., Беловецкая И.В., 1986]. Однак механізми як гальмування, так і індукції іонами металів ключового ферменту біосинтезу гему залишаються не проясненими. Не вивчено також вплив на -АЛК-синтазну активність неорганічних сполук ртуті, вміст яких в навколишньому середовищі значно збільшилось [Трахтенберг И.М., Коршун М.Н., 1990].

Поряд з прямою інгібуючою дією на синтез або активність -АЛК-синтази, солі важких металів можуть викликати підвищення в клітинах печінки концентрації вільного гему [Калиман П.А. и др., 1996; Никитченко И.В. и др., 1998], що є основним регулятором активності -АЛК-синтази [May B.K. et al., 1990; Ades I.Z., 1990; Lathrop J.T., Timko M.P., 1993], але джерела накопичення гему не встановлені. Актуальною проблемою в цьому плані постає пошук можливих шляхів запобігання гемолізу під впливом важких металів з метою виключити надмірне надходження гему в печінку з кров'яного руслу. Додатковим механізмом дії іонів Co²⁺, Zn²⁺, Sn²⁺ на -АЛК-синтазу може з'явитись формування металопорфіринових комплексів, тим часом як іони Hg²⁺, Pb²⁺, Ni²⁺, Pt²⁺ та інші не здатні заміщувати Fe²⁺ в гемопротеїнах [Maines M.D., 1984]. Вказані розбіжності властивостей іонів кобальту та ртуті, поряд з їх широким використанням в практичній діяльності людини та значним розповсюдженням в зовнішньому середовищі [Трахтенберг И.М., Колесников В.С., Луковенко В.П., 1994], обумовили вибір цих металів для дослідження.

Враховуючи вищевикладене, встановлення механізмів дії хлориду ртуті та хлориду кобальту на активність ключового ферменту біосинтезу гему, -АЛК-синтази, в печінці ссавців з'являється актуальним та перспективним в плані подальшої розробки рекомендацій щодо лікування гострих отруєнь солями важких металів та токсичних порфірій.

Взаємозв'язок даної роботи з науковими програмами. Дисертаційне дослідження було частиною держбюджетної теми НДІ біології Харківського держуніверситету "Клiтиннi та молекулярнi механiзми адаптацiї метаболiзму при окисному стресi" (№ ДР 0197U008188).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення основних механізмів дії іонів Hg²⁺ і Со²⁺ на активність -АЛК-синтази в печінці і ролі гемолізу та змін рівня відновленого глутатіону (GSH) в реалізації цих механізмів. У зв'язку з метою дослідження, а також враховуючи, що рівень відновленого глутатіону в значній мірі визначається активністю глутатіонредуктази і генерацією НАДФН [Pinto R.E., Barley W., 1969], були поставлені такі задачі:

Вивчити вплив HgCl₂ та CoCl₂ на активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегидрогенази та вміст відновленого глутатіону в печінці, а також на вміст продуктів гемолізу і гем-зв'язувального білку гемопексину в сироватці крові щурів.

Вивчити вплив HgCl₂, геміну та сироватки крові інтактних і дослідних тварин на активність -АЛК-синтази печінці в дослідах in vitro.

Враховуючи дані щодо антигемолітичної дії -адреноблокатору пропранололу [Соминский В.Н. и др., 1988] та антиоксидантної дії відновленого глутатіону [Meister A., Anderson M.E., 1983], вивчити вплив сумісного введення пропранололу і HgCl₂ або CoCl₂, а також сумісного введення CoCl₂ і GSH, на вищенаведені біохімічні показники.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що хлорид кобальту викликає накопичення в сироватці крові модифікованих кобальтом гемопротеїнів та більш виражене і тривале, у порівнянні з хлоридом ртуті, гальмування активності -АЛК-синтази в печінці.

Вперше встановлено, що зниження активності -АЛК-синтази в печінці і накопичення продуктів гемолізу в сироватці крові в перші години дії HgCl₂ та CoCl₂ запобігається при попередньому введенні, відповідно, -адреноблокатору пропранололу та відновленого глутатіону.

Показано, що індукуюча дія вивчених солей металів на -АЛК-синтазну активність може бути послаблена попереднім введенням пропранололу або, як встановлено для хлориду кобальту, введенням відновленого глутатіону.

Встановлено, що зміни вмісту відновленого глутатіону в печінці при дії HgCl₂ та CoCl₂ в певній мірі залежать від накопичення продуктів гемолізу в сироватці крові і запобігаються в умовах відсутності гемолізу.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Здобуті в цій роботі дані свідчать про залежність динаміки активності ключового ферменту біосинтезу гему від накопичення продуктів гемолізу і здатності іонів металу формувати металопорфіриновий комплекс, що значно розширює уяви щодо регуляції біосинтезу гему в печінці ссавців.

Практичне значення має встановлення важливої ролі гемолізу в механізмах дії іонів важких металів на біосинтез гему в печінці, а також здатності -адреноблокатору пропранололу та відновленого глутатіону запобігати гемолізу в перші години дії, відповідно, HgCl₂ та CoCl₂. Зберігання активності -АЛК-синтази в печінці на контрольному рівні в перші години і зменшення або запобігання подальшої індукції ферменту під впливом цих металів в умовах відсутності гемолізу може бути використано при розробці терапевтичних заходів щодо лікування отруєнь солями важких металів та токсичних порфирій.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконано під науковим керівництвом докт. біол. наук П.А. Калімана, в співробітництві з канд. біол. наук І.В. Нікітченко, з якими автор має спільні публікації. Всі результати, що приведені в рукопису, одержані автором самостійно. Дисертантом особисто проведено експерименти і визначення вибраних для дослідження біохімічних показників, проаналізована література за темою дослідження, обговорено одержані результати.

Апробація результатів дисертації. За матеріалами дисертації зроблені доповіді на міжнародному симпозіумі ``Биологические механизмы старения", Харків, 1996 р ., на VII біохімічному з'їзді, Київ, 1997 р., на міжнародній конференції ``Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии", С.-Петербург, 1998 р., на науковій конференції молодих вчених-біологів ХДУ, Харків 1996 р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті та 5 тез доповідей.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, методичної частини, трьох розділів результатів досліджень та їх обговорення, висновків і переліку літературних посилань (260 джерел). Робота викладена на 136 стор. Результати досліджень ілюстровано 19 рисунками та 17 таблицями.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділу роботи подано огляд літератури за темою дисертації. Особлива увага приділена основним механізмам регуляції -амінолевулінатсинтази в печінці ссавців, в тому числі ролі гему, гем-зв'язувальних білків та гормональних факторів в регуляції ферменту, а також впливу солей важких металів та змін рівню відновленого глутатіону в печінці. Розглянути біологічні функції GSH, та фактори, що впливають на його вміст в печінці ссавців.

У другому розділу описано матеріали та основні методи дослідження.

Матеріали та методи дослідження

В роботі використані щури лінії Вістар 3-х місячного віку обох статей. Самки знаходились в фазі proestrus [Киршенблат Я.Д., 1973]. CoCl₂6H₂O та HgCl₂ було введено в сублетальній дозі, відповідно, 3 мг [Maines M.D., 1977; Калиман П.А., Беловецкая И.В, 1986] та 0,7 мг [Maines M.D., 1977] на 100 г маси тіла тварини. Пропранолол (0,025% розчин) було введено в дозі 0,15 мг на 100 г маси тіла [Bassukevitz Y. et al., 1989], відновлений глутатіон (10% розчин) - в дозі 50 мг на 100 г маси тіла [Конвай В.Д. и др., 1988]. Всі сполуки введено внутрішньочеревинно. При сумісному введенні пропранолол було введено за 30 хв до введення хлориду кобальту або ртуті, відновлений глутатіон - за 15 хв до введення CoCl₂. Тварин брали в дослід після введення HgCl₂ або CoCl₂ - через 30 хв, 2 год або 24 год; після введення тільки пропранололу - через 1 год, 2,5 год або 24 год (контроль на блокатор); після введення тільки відновленого глутатіону - через 15 хв, 45 хв та 2 год (контроль на GSH). Об'єктом дослідження були печінка та кров тварин. В дослідах in vitro використано печінку інтактних щурів-самців.

Печінку перфузували холодним фізіологічним розчином in situ. Постмітохондріальну фракцію отримували диференціальним центрифугуванням в 0,1 М К-Na-фосфатном буфері, pH 7,5 [Ещенко Н.Д., 1982].

Визначення -АЛК-синтазної активності проведено в гомогенаті печінки за методом [Marver H.S. et al., 1966]. -АЛК, що утворювалась, було переведено до форми піролу кип'ятінням в присутності ацетилацетону [Granick S., 1966]. Пірольну форму -АЛК відділяли від аміноацетону [Sassa S. et al., 1975] та ії вміст визначали після забарвлювання реактивом Эрліха. Питому активність ферменту виражали в нмоль -АЛК/ мг білку за 1 год.

Вміст GSH визначали в гомогенаті печінки спектрофотометрично по поглинанню комплексу з аллоксаном при 305 нм [Путилина Ф.Е., 1982] та виражали в мкмоль/г сирої тканини. Активність глутатіонредуктазы [Чернов Н.Н., 1979] та глюкозо-6-фосфатдегидрогенази [Bottomley R.H. et al., 1963] визначали в постмітохондріальній фракції спектрофотометрично по зміні поглинання НАДФН (340 нм) при 37^oC в присутності відповідних субстратів. Активність ферментів виражали в нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв.

Спектр поглинання сироватки крові реєстрували на двохпроменевому спектрофотометрі Specord UV-VIZ при 37^oC в 0,1 М Na-фосфатному буфері, рН 7,1 [Hrkal Z., Muller-Eberhard U., 1971]. На підставі змін оптичної густини сироватки крові в Soret-зоні (зона поглинання гемопротеїнів: 380-450 нм) та при 280 нм робили висновок про вміст, відповідно, гему та гемопротеїнів [Smith A., 1993; Yonetani T. et al., 1974] (продукти гемолізу), та гемопексину [Takahashi N. et al., 1985]. Оптичну густину розраховували по різниці максимуму та мінімуму поглинання в відповідній зоні [Perkampus H.-H., 1992] та виражали в A/мг білку.

Вміст білку визначали за методом Лоурі в модифікації Міллера [Miller G.L., 1959]. Статистичну обробку проведено за методом Стьюдента-Фішера.

У третьому, четвертому та п'ятому розділах дисертації наведено основні результати досліджень та їх обговорення.

3. Результати досліджень та їх обговорення

Вплив хлориду ртуті та хлориду кобальту на активність -амінолевулінатсинтази та вміст відновленого глутатіону в печінці щурів.

Хлорид ртуті та хлорид кобальту викликають двохфазну зміну -АЛК-синтазної активності в печінці щурів обох статей в першу добу після введення: зниження в перші години з наступним підвищенням на 24 годину (табл.1,2).

Таблиця 1 Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самців в різні строки після введення HgCl₂ або CoCl₂ (M±m, n=6-8)

Гальмування ферменту в печінці супроводжується накопиченням продуктів гемолізу в сироватці крові (див.табл.1,2, рис.1). Основним механізмом гемолізу в перші години після введення СоCl₂ за даними літератури являється посилення вільнорадикального окислення [Ribarov S.R., Benov L.C., 1981], тим часом, як гемоліз під впливом HgCl₂ пов'язано, насамперед, з прямою модифікацією сульфгідрильних компонентів мембран [Yang M., 1993]. Зниження вмісту гемопексину в сироватці крові щурів через 30 хв після введення HgCl₂ та 2 год після введення CoCl₂ може бути зумовлено його приєднуванням до специфічних рецепторів при транспорті гему з кров'яного русла в печінку [Smith A., 1981] в умовах накопичення продуктів гемолізу (див.табл.1,2).

Таблиця 2 Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самиць в різні строки після введення HgCl₂ або CoCl₂ (M±m, n=6-8)

Результати дослідів in vitro свідчать про можливість прямої інгібуючої дії іонів ртуті на активність -АЛК-синтази, але для цього необхідні досить високі концентрації HgCl₂ (50 мкМ, табл.3). За даними літератури, лише незначна доля іонів ртуті надходить до печінки при введенні HgCl₂ in vivo [Zalups R.K., 1993], крім того, реакційно-здібні сульфгідрильні групи в ключовому ферменті біосинтезу гему відсутні [Ferreira G.C., Gong J., 1995]. Таким чином, враховуючи ці дані, а також збереження на рівні контролю вмісту GSH та активності ферментів, що вміщують сульфгідрильні групи в активному центрі (глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегидрогенази, див.табл.1,2) через 30 хв після ін'єкції HgCl₂, концентрація вільних іонів ртуті в печінці в ці строки, очевидно, не досягає достатнього рівню щодо прямого гальмування -АЛК-синтазної активності.

Таблиця 3 Активність -АЛК-синтази в печінці щурів в дослідах in vitro при інкубації гомогенату печінки інтактних щурів-самців в присутності HgCl₂, геміну, або сироватки крові (кінцева концентрація 10%) інтактних і дослідних щурів (нмоль АЛК/мг білку за 1 год, M±m, n=4-5)

Примітки: p₁ - p<0,05 відносно до контролю; а - сироватка крові інтактних щурів; b - сироватка крові щурів через 10 хв після введення СoCl₂; c - сироватка крові щурів через 10 хв після введення HgCl₂

Низька чутливість -АЛК-синтази до дії in vitro іонів ртуті і висока - до геміну (50% гальмування при концентрації 0,1 мкМ, табл.3), а також встановлений раніше факт появи в клітинах печінки вільного гему після введення HgCl₂ [Калиман П.А. и др., 1998; Нікітченко И.В. и др., 1998], дозволяють зробити висновок, що зниження активності -АЛК-синтази під впливом хлориду ртуті (див.табл.1,2) зв'язане не з прямим гальмуванням іонами ртуті, а зі зростанням рівня вільного гему в печінці. Слід відзначити, що вільний гем є основним регуляторним фактором щодо активності ключового ферменту біосинтезу гему в нормі, здібний інгібувати перенесення попередника ферменту в мітохондрії та зменшувати період напіврозпаду мРНК -АЛК-синтази [Lathrop J.T., Timko M.P., 1993; Cable E.E. et al., 1994]. Зв'язування вільного гему специфічними білками та розщеплення його в гемоксигеназній реакції [Никитченко И.В. и др., 1998] робить можливим повернення активності -АЛК-синтази до контролю через 2 год після введення HgCl₂.

Швидкий гемоліз під впливом HgCl₂ та висока чутливість -АЛК-синтази до геміну in vitro пояснюють інгібуючу дію на фермент сироватки крові, отриманої через 10 хв після введення щурам HgCl₂ (див.табл.3). Таким чином, надходження в клітини печінки продуктів гемолізу може з'явитись основним механізмом зростання вмісту гему в печінці під впливом іонів ртуті.

Хлорид кобальту, в порівнянні з хлоридом ртуті, викликає більш виражене по ступеню та тривалості інгібування -АЛК-синтази (див. табл.1,2). Однак відомо, що введення CoCl₂ не викликає зростання вмісту вільного гему в печінці [Калиман П.А., Беловецкая И.В., 1986]. За даними літератури в печінці з'являються модифіковані кобальтом гемопротеїни та Со²⁺-протопорфірин, що пов'язано зі здатністю Co²⁺ заміщувати іони Fe²⁺ в протопорфіриновому кільці [Sinclair P. et al., 1979; Igarashi J. et al., 1978; Maines M.D., 1984]. Отримані в цій роботі результати свідчать, що джерелом Co²⁺-протопорфірину можуть з'явитись і модифіковані кобальтом продукти гемолізу, появу яких зафіксовано по зміні max піку поглинання сироватки крові в Soret-зоні через 30 хв після введення CoCl₂ (рис.1).

Рис.1. Спектри поглинання сироватки крові щурів в Soret-зоні в нормі та через 30 хв після введення HgCl₂ або CoCl₂ . (А - абсорбція, 1 - норма, 2 - хлорид ртуті, 3 - хлорид кобальту).

Накопичення іонів кобальту в клітинах печінки вже в перші хвилини після введення [Москалев Ю.И., 1985], формування Co²⁺-протопорфірину та Co²⁺-протопорфірин-вміщуючих білків (див.рис.1), висока чутливість -АЛК-синтази до інгібуючої дії Co²⁺ та Co²⁺-протопорфірину [Maines M.D., 1984], а також повільне виведення з клітин печінки модифікованих кобальтом гемопротеїнів [Yoshida T., Kikuchi G., 1978; Maines M.D., 1984] зумовлюють глибоке та тривале гальмування активності -АЛК-синтази при введенні CoCl₂.

Підвищення активності -АЛК-синтази в печінці щурів через 24 год після введення солей важких металів обумовлено індукцією ферменту de novo [Maines M.D., 1984; Калиман П.А., Беловецкая И.В., 1986], що за останніми даними, пов'язана з активацією ядерних дихальних факторів та спостерігається у відповідь на розвиток гіпоксії [Braidotti G. et al., 1993]. Статевих розбіжностей в динаміці активності -АЛК-синтази в печінці не спостерігається. Більш виражений приріст активності ферменту в печінці щурів-самиць на 24 годину після введення солей ртуті та кобальту може бути наслідком значного гемолізу в перші години в крові щурів-самиць (див.табл.2) та розвитком сильнішої гіпоксії [Braidotti G. et al., 1993].

Хлорид ртуті, на відміну від хлориду кобальту, викликає через 2 год після введення зниження рівня відновленого глутатіону в печінці щурів обох статей, що у самців супроводжується зниженням активності глутатіонредуктази та глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (див.табл.2). Різна динаміка активності глюкозо-6-фосфатдегидрогенази у щурів різної статі (див.табл.2) обумовлюється статевими особливостями регуляції активності цього ферменту [Hansen R.J., Jungermann K., 1987].

Вплив сумісного введення пропранололу і HgCl₂ на активність -АЛК-синтази та вміст відновленого глутатіону в печінці щурів - Під сумісним введенням пропранололу та HgCl₂ розуміється введення хлориду ртуті через 30 хв після ін'єкції пропранололу; під часом після сумісного введення пропранололу та HgCl₂ розуміється час, що минуле з моменту введення хлориду ртуті. Cумісне введення пропранололу та хлориду ртуті запобігає накопиченню продуктів гемолізу та зниженню активності -АЛК-синтази в печінці в першу годину дії хлориду ртуті (табл.4). Очевидно, зв'язування пропранололу, що має амфіфільні та мембранотропні властивості [Dash D., Rao G.R., 1990], з мембранами еритроцитів захищає мембрани від взаємодії з іонами ртуті. Таким чином, підтверджується зроблений раніше висновок, що інгібування -АЛК-синтази хлоридом ртуті in vivo опосередковано гемолізом та надходженням гему з кров'яного русла до печінки.

Підвищення активності ферменту через 2 год після сумісного введення пропранололу та хлориду ртуті свідчить, що синтез ферменту може посилюватись вже в перші години дії іонів металів в умовах відсутності гемолізу та накопичення вільного гема в клітинах печінки. Попереднє введення пропранололу запобігає також зниженню рівня відновленого глутатіону в печінці через 2 год дії HgCl₂ (див.табл.4), що може бути пов'язано з відсутністю накопичення гему, що є прооксидантом [Vincent S.H. et al. 1988]. Зростання вмісту GSH в печінці через 24 год супроводжується підвищенням активності глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (див.табл.4).

Таблиця 4 Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самиць в різні строки після сумісного введення HgCl₂ та пропранололу (M±m, n=6-8)

Введення тільки пропранололу викликає in vivo нетривале інгібування -АЛК-синтазы в печінці (0,0630,005 нмоль АЛК/мг білку за 1 год, p<0,05 відносно 0,0810,007 в контролі), що може бути спричинено підвищенням рівня вільного гему, як показано при введенні пропранололу в культуру гепатоцитів [Epstein O. et al., 1982]. Оптична густина сироватки крові в Soret-зоні через 1 год після дії пропранололу складає 0,0180,001 А/ мг білку, що на рівні 0,0210,002 в контролі, а при 280 нм - знижується до 0,480,04 А/ мг білку проти 0,760,03 в контролі (p<0,05). Таким чином, пропранолол не викликає посилення гемолізу, але впливає на обмін гемопексину. В цих умовах інгібування -АЛК-синтази в печінці може явитись наслідком впливу пропранололу на обмін внутришньоклітинного гему та гем-зв'язувальних білків, що спричинить порушення транспорту гему та накопичення вільного гему в клітинах печінки [Epstein O. Et al., 1982].

Вплив сумісного введення пропранололу і хлориду кобальту на активність -АЛК-синтази і вміст GSH в печінці щурів - Під сумісним введенням пропранололу та СоCl₂ розуміється введення хлориду кобальту через 30 хв після ін'єкції пропранололу; під часом після сумісного введення пропранололу та СоCl₂ розуміється час, що минуле з моменту введення хлориду кобальту.. Сумісне введення пропранололу та СoCl₂ не зменшує ступеню та тривалості гальмування -АЛК-синтази в перші години дії хлориду кобальту (табл.5). При цьому спостерігається більш швидке накопичення продуктів гемолізу, ніж після введення тільки CoCl₂ (вже через 30 хв проти 2 год, див. табл.1), що може бути наслідком впливу пропранололу на мембрани еритроцитів [Соминский В.Н. и др., 1988] та відсутності активації цАМФ-залежних антиоксидантних ферментів в умовах блокади -адренорецепції [Колесниченко Л.С. и др., 1987]. Таким чином, пропранолол не запобігає гемолізу при введенні CoCl₂, на відміну від HgCl₂, що вказує на різні механізми гемолітичної дії цих металів.

Таблиця 5 Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самців в різні строки після сумісного введення СоCl₂ та пропранололу (M±m, n=6-8)

Зниження рівня GSH через 30 хв після сумісного введення пропранололу та хлориду кобальту може бути пов'язано з більш швидким накопиченням продуктів гемолізу в сироватці крові (див.табл.5) та участю глутатіону в антиоксидантних реакціях [Griffith O.W., Meister A., 1985], враховуючи прооксидантні властивості вільного гему [Vincent S.H. et al., 1988]. Слід зазначити, що відновлення рівня GSH та його подальше підвищення супроводжується зростанням активності глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (див.табл.5).

Виходячи з відомого факту активації -адренорецепторів адреналіном в умовах блокади -адренорецепції [Кулинский В.И., Ольховский И.А., 1992] при розвитку стрес-реакції, а також стресорної дії солей важких металів [Голиков С.Н. и др., 1986], відсутність підвищення активності -АЛК-синтази через 24 год після сумісного введення пропранололу та CoCl₂ (див.табл.5), так само як менший приріст активності ферменту після сумісного введення пропранололу та HgCl₂ (див.табл.4), можуть бути пов'язані з активацією в печінці протеїнкінази С, що за останніми даними інгібує синтез ферменту de novo [Varone C.L., Canepa E.T., 1997].

Введення тільки пропранололу викликає зниження -АЛК-синтазної активності в печінці щурів-самців через 1 год (0,0660,008 нмоль АЛК/мг білку за 1 год, р<0,05 відносно 0,0850,007 нмоль АЛК/мг білку за 1 год в контролі,), але гемоліз не спостерігається. Оптична густина сироватки крові в Soret-зоні через 1 год після введення пропранололу не перевищує контроль, через 2,5 год зменшується до 0,0290,002 А/мг білку (p<0,002 відносно 0,0470,002 А/мг білку в контролі) і зберігається на цьому рівні через 24 год (0,0320,005А/мг білку, p<0,01). Зниження вмісту продуктів гемолізу та вмісту гемопексину так саме, як інгібування -АЛК-синтази в печінці після введення пропранололу можуть бути пов'язані з амфіфільними властивостями пропранололу [Dash D., Rao G.R., 1990] та його здібністю викликати накопичення вільного гему in vitro [Epstein O. et al., 1992]. Вивільнення гему із комплексів з гем-зв'язувальними білками та порушення його транспорту під впливом пропранололу спричинить зниження -АЛК-синтазної активності в печінці. Антигемолітична дія пропранололу може бути зумовлена зростанням приступності геміну, що накопився в цитоскелеті та мембранах еритроцитів [Solar I., Shaklai N., 1989], для гем-зв'язувальних білків, в тому числі гемопексину [Solar I. et al, 1989], та зростання періоду поновлення еритроцитів.

Вплив GSH та сумісного введення GSH та СoCl₂ на активність -АЛК-синтазы та вміст відновленого глутатіону в печінці щурів Під сумісним введенням GSH та СоCl₂ розуміється введення хлориду кобальту через 15 хв після ін'єкції відновленого глутатіону; під часом після сумісного введення GSH та СоCl₂ розуміється час, що минуле з моменту введення хлориду кобальту.. Запобігання гальмування -АЛК-синтази в печінці та накопичення продуктів гемолізу в крові під впливом іонів кобальту досягається при сумісному введенні CoCl₂ та відновленого глутатіону (табл.6). Це може бути зумовлено прямим зв'язуванням іонів кобальту відновленим глутатіоном [Maines M.D., Kappas. A., 1977], участю глутатіону в антиоксидантних реакціях [Meister A., Anderson M.E., 1983] та відновленні метгемоглобіну [Кения М.В. и др., 1993], що запобігає пошкодженню еритроцитарних мембран. Відсутність гемолізу та накопичення вільних іонів кобальту обумовлює зберігання активності ключового ферменту біосинтезу гему в печінці на рівні контролю.

Таблиця 6. Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самиць в різні строки після сумісного введення GSH та СоCl₂ (M±m, n=6-8)

Разом з тим, введення тільки глутатіону спричиняє тривале інгібування -АЛК-синтази в печінці. Враховуючи відсутність гемолізу в перші години після введення глутатіону, зниження активності ферменту не може бути пов'язане з надходженням продуктів гемолізу до печінки з крові (табл.7). Різке зростання рівню GSH вже в перші хвилини після введення екзогенного глутатіону (див.табл.7) може викликати зміщення окислювально-відновленої рівноваги та конформаційні перебудови гем-зв'язувальних білків, що містять сульфгідрильні групи [Iwahara S. et al, 1995; Hitomi M. et al, 1990], з наступним накопиченням вільного гему. Інгібування -АЛК-синтазної активності при введенні відновленого глутатіону пояснює відомий факт нормалізації екскреції порфіринів у хворих зі спадковими та набутими порфіріями при введенні GSH [Ferioli A. et al., 1992]. Відсутність підвищення активності -АЛК-синтази через 24 год після сумісного введення хлориду кобальту і GSH може бути наслідком відсутності гемолізу в перші години, що може запобігати розвитку гіпоксії в клітинах печінки.

Таблиця 7 Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самиць в різні строки після введення GSH (M±m, n=6-8)

Зниження рівня GSH передує індукції -АЛК-синтази в проведених експериментах тільки при введенні HgCl₂. В ці ж строки після введення CoCl₂, а також cумісного введення хлориду ртуті та пропранололу, що викликають подальшу індукцію ферменту, вірогідних змін вмісту GSH не зазначено. Зниження вмісту GSH в перші години після сумісного введення пропранололу та CoСl₂ не викликає підвищення -АЛК-синтазної активності в печінці через 24 години. Таким чином, зниження рівня GSH не є визначним в реалізації механізмів дії іонів ртуті та кобальту на активність -АЛК-синтази в печінці, тим часом, як накопичення продуктів гемолізу в сироватці крові та здатність іону металу до формування металопорфіринового комплексу може розглядатись як важливий фактор щодо регуляції ключового ферменту біосинтезу гему при дії важких металів.

Висновки

1. Одержано дані про можливість послаблення дії важких металів на -АЛК-синтазну активність печінки шляхом упередження гемолізу та надмірного надходження гему та металопорфіринів з кров'яного руслу до клітин печінки і про вплив на активність ферменту змін вмісту відновленого глутатіону в печінці.

2. Встановлено, що CoCl₂ викликає накопичення модифікованих кобальтом продуктів гемолізу в сироватці крові та більш виражене по ступеню і тривалості, ніж HgCl₂, гальмування -АЛК-синтази в печінці щурів.

3. Гемолітична дія іонів кобальту, на відміну від іонів ртуті, не запобігається попереднім введенням -адреноблокатору пропранололу, що вказує на різні механізми гемолізу під впливом HgCl₂ та CoCl₂. Гемоліз при дії хлориду кобальту може бути упереджено попереднім введенням відновленого глутатіону.

4. Зберігання -АЛК-синтазної активності в печінці щурів на рівні контролю в умовах відсутності гемолізу після сумісного введення HgCl₂ та -адреноблокатору пропранололу, а також CoCl₂ та відновленого глутатіону, свідчить про важливу роль гемолізу в механізмах дії іонів важких металів на біосинтез гему в печінці ссавців.

5. Не виявлено статевих розбіжностей в активності -АЛК-синтази у інтактних щурів, а також в характері змін активності ферменту під впливом HgCl₂ та СоCl₂. Більшому приросту -АЛК-синтазної активності в печінці щурів-самиць через 24 год після введення солей металів передує більш виражений гемоліз еритроцитів.

6. Встановлено, що зниження вмісту GSH в печінці в перші години дії іонів важких металів не може бути розглянуте як необхідна умова для наступного підвищення -АЛК-синтазної активності. Введення екзогенного відновленого глутатіону викликає тривале гальмування -АЛК-синтази в печінці щурів.

7. Встановлені статеві розбіжності в динаміці активності глутатіонредуктази та глюкозо-6-фосфатдегидрогенази після введення CoCl₂, HgCl₂ та пропранололу in vivo. Зниження рівню GSH в печінці щурів-самців через 2 год після введення HgCl₂ супроводжується інгібуванням глутатіонредуктази та глюкозо-6-фосфатдегидрогенази.

8. Гальмування -АЛК-синтази в печінці після введення -адреноблокатору пропранололу і відновленого глутатіону, а також послаблення індукуючої дії іонів ртуті та кобальту на -АЛК-синтазу при сумісному введенні пропранололу та HgCl₂ або CoCl₂ та сумісному введенні CoCl₂ і GSH підтверджують доцільність використання пропранололу та відновленого глутатіону при терапії порфірий.

Список опубликованих праць за темою дисертації

ртуть хлорид біосинтез печінка

Калиман П.А., Загайко А.Л., Шаламов Р.В., Ганусова Г.В., Баранник Т.В., Скрипник Э.В., Соколик В.В., Шаби Б.К. Содержание и состав липопротеинов крови и печени крыс и некоторые показатели окислительного стресса при введении хлорида кобальта// Укр.биох.журн., 1997.- т.69, № 5.- С.138-148. (Дисертант брала участь в підготовці експерименту, дослідженні вмісту відновленого глутатіону та активності НАДФН-генеруючих дегідрогеназ при дії СoCl₂, обговоренні одержаних результатів).

Никитченко И.В., Баранник Т.В., Калиман П.А. Возрастные особенности активности и индукции ключевых ферментов метаболизма гема в печени крыс при окислительном стрессe// Доповіді НАН України.- 1998.-№12 -С.160-164. (Дисертантом досліджені та обговорені вікові особливості впливу HgCl₂ на активність -амінолевулінатсинтази в печінці щурів)

Баранник Т.В., Никитченко И.В. Активность ключевых ферментов метаболизма гема и пул восстановленного глутатиона в печени крыс после введення хлориду ртути// Биологический вестник ХГУ, 1997.- №1.- С.45-50. (Дисертантом вивчена динаміка вмісту GSH, активностей -амінолевулінатсинтази, каталази, глутатіонредуктази та ряду НАДФН-генеруючих ферментів після введення HgCl₂ з наступним обговоренням отриманих результатів).

Соколик В.В., Баранник Т.В. Активность глутатион-зависимых ферментов антиоксидантной защиты та НАДФН-генерирующих дегидрогеназ в условиях окислительного стресса, вызванного хлоридом кобальта// Биологический вестник ХГУ, 1997.- №1,- С.51-56. (Дисертант брала участь у постановці експерименту, визначала вміст GSH та активності НАДФН-генеруючих ферментів при дії хлориду кобальту, аналізувала одержані дані).

Никитченко И.В., Баранник Т.В., Сокол О.А., Калиман П.А. Влияние анаприлина на метаболизм гема та гемопротеинов в условиях окислительного стресса, вызванного введением хлорида ртути// Труды Междунар. конф. ``Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии".- Том II.- С.-Петербург: Изд-во СПбГМУ.- 1998.- С.357-361.

Barannik T.V. Rat liver delta-aminolevulinate activity and the reduced glutathione content under oxidative stress caused by cobalt or mercury chloride// Proc. 2nd Parnas Conference.- Gdansk.- 1998.- P.37.

Калиман П.А., Никитченко И.В., Ганусова Г.В., Баранник Т.В., Немкова С.Н. Влияние хлорида ртути на метаболизм гема в печени крыс разного возраста// Междунар. симпозиум ``Биологические механизмы старения." Тез.докл.- Харків, 1996.- С.60.

Бараннік Т.В. Вплив хлориду ртути на активність -амінолевулінатсинтази в печінці щурів різного віку// VII Український біохімічний з'їзд. Тези доповідей.- Києв, 1997. С.86-87.

Баранник Т.В. Влияние иммобилизационного стресса и введения хлорида ртути на содержание восстановленного глутатиона и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени крыс// Материалы науч. конф. молод. ученых биол. ф-та и НИИ биол.- Харьков, 1996.- С.9.

Размещено на Allbest.ru