Оксидантно-антиоксидантний стан організму щурів за умов оксидантного стресу та дії настоянки арніки гірської

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. Ю.ФЕДЬКОВИЧА

Яремій Ірина Миколаївна

Удк 577.1: 599.323.4-019: 615.322: 582.998.2

ОКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНИЙ СТАН ОРГАНІЗМУ ЩУРІВ ЗА УМОВ ОКСИДАНТНОГО СТРЕСУ ТА ДІЇ НАСТОЯНКИ АРНІКИ ГІРСЬКОЇ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Чернівці

1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Буковинській державній медичній академії
МОЗ України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор Мещишен Іван Федорович,

Буковинська державна медична академія МОЗ України,

завідувач кафедри медичної хімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Виноградова Руфіна Петрівна,

Київський університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії;

доктор медичних наук, професор Гонський Ярослав Іванович,

Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського,

завідувач кафедри медичної хімії

Провідна установа: Харківський державний університет, кафедра біохімії

Захист відбудеться " 17 ” червня 1999 р. о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 в Чернівецькому державному університеті ім. Ю. Федьковича, м.Чернівці, вул.Коцюбинського, 2.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Чернівецького державного університету ім. Ю. Федьковича (м.Чернівці, вул. Лесі Українки, 23).

Автореферат розісланий “ 14 ” травня 1999р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Копильчук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження останніх років переконують у набагато більшому, ніж вважалось раніше, впливові на біологічні системи активних форм кисню та залежної від них внутрішньоклітинної генерації вільних радикалів [Логинов А.С., Матюшин Б.М., 1991, 1996, Владимиров Ю.В., 1998] .Згідно сучасних уявлень, синдром пероксидації, як неспецифічна патофізіологічна реакція, відіграє провідну роль у патогенезі різноманітних захворювань і розглядається як універсальний механізм пошкодження клітин [Барабой В.А., 1997, Владимиров Ю.В., 1998]. Внутрішньоклітинна регуляція в тканинах вмісту активних форм кисню та інтенсивності перебігу процесів пероксидного окислення ліпідів та біополімерів здійснюється за допомогою ферментативних та неферментативних систем антиоксидантного захисту [Зборовская И.А., 1995, Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997, Мещишен І.Ф., 1999].

Для з'ясування механізмів формування та перебігу різноманітних патологічних станів в організмі та з метою виявлення в патогенезі окремих захворювань тих ланок, діючи на які, можна впливати на розвиток в організмі патологічного процесу, проводяться комплексні дослідження вмісту в тканинах продуктів пероксидного окислення біомолекул, зокрема ліпідів та функціонування систем антиоксидантного захисту.

За останнє десятиріччя, у зв'язку із значним погіршенням екологічної ситуації, в Україні значно зріс процент захворюваності населеня. За таких умов активність власних систем антирадикального захисту організму доволі часто виявляється недостатньою для регуляції рівня вільних радикалів і потребує додаткового введення в організм екзогенних антиоксидантів. Тому, зрозумілим на нашу думку, є інтерес та посилений пошук нових засобів природнього, зокрема рослинного походження, здатних запобігати інтенсивному радикалоутворенню чи сприяти кращій мобілізації власних систем антирадикального захисту організму [Колесова И.П., 1996, Шуліпенко І.М.,1998].

Перспективною, на нашу думку, в цьому плані лікарською рослиною слід вважати арніку гірську, яка, як свідчать літературні дані [Костенникова З.П., 1984, Rosetti V., 1987, Pinchon T., 1988], містить значну кількість біологічно активних речовин з різноманітною фармакологічною дією.

Вивчення впливу настоянки арніки гірської на стан оксидантної та антиоксидантної систем організму за умов оксидантного стресу допомогло б не лише пояснити деякі механізми її біологічної дії, а й значно розширило б можливості щодо використання даного препарату в клінічній практиці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась в рамках науково-дослідницької роботи Буковинської державної медичної академії. Реєстраційний N 0197V015108.

Мета і основні завдання дослідження. Встановити характер впливу настоянки арніки гірської на стан оксидантної та антиоксидантної систем організму щурів за умов оксидантного стресу (дії низьких доз радіації, експериментального ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони та токсичного гепатиту).

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити вміст молекулярних продуктів ПОЛ (сполук з ізольованими подвійними зв'язками, дієнових кон'югатів, кетодієнів і спряжених триєнів, малонового диальдегіду) та функціонування систем антиоксидантного захисту (вміст церулоплазміну, глутатіону відновленого та активність супероксиддисмутази, каталази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, глутатіонредуктази, глутатіонпероксидази, глутатіон-S-трансферази) в крові та печінці щурів за умов одноразового рентгенівського опромінення в дозі 0,5 Гр, експериментального ерозивно-виразкового ураженння гастродуоденальної зони та токсичного гепатиту.

2. Вивчити фізико-хімічні показники настоянки арніки гірської, зокрема, провести дослідження по виявленню та визначенню в останній вмісту природніх антиоксидантів.

3. Дослідити in vitro характер дії настоянки арніки гірської на проникність мембран еритроцитів донорів та стан пероксидного окислення ендогенних ліпідів.

4. Вивчити вплив настоянки арніки гірської на стан пероксидного окислення ліпідів та систем антиоксидантного захисту крові та печінки щурів за умов одноразового опромінення в дозі 0,5 Гр, експериментального ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони та токсичного гепатиту.

Наукова новизна одержаних результатів. В даній роботі вперше:

встановлено характер дії настоянки арніки гірської на проникність клітинних мембран еритроцитів донорів, виявлено антиоксидантні властивості настоянки арніки гірської та вивчено механізми антиоксидантної дії препарату як за умов фізіологічної норми, так і при патології: дії низьких доз радіації, ерозивно-виразковому ураженні гастродуоденальної зони та токсичному гепатиті.

Практичне значення одержаних результатів.

Показана ефективність застосування настоянки арніки гірської за умов дії низьких доз радіації та обгрунтована можливість використання її в медичній практиці як антиоксидантного засобу при ерозивно-виразкових ураженнях шлунково-кишкового тракту та як гепатопротектора.

За матеріалами дисертації розроблено рацпропозицію Чернівецького медінституту N26/95 “Антиоксидантна дія настоянки арніки гірської”.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора в отриманні наукових результатів є основним і полягає у сформулюванні мети і завдань дослідження, проведенні основного об'єму експериментальної частини роботи, опрацюванні наукової літератури, статистичній обробці результатів досліджень, аналізі та узагальненні отриманих даних, апробації отриманих результатів і підготовці до друку робіт, що відображають основний зміст дисертації.

Апробація результатів роботи. Основні положення дисертаційної роботи викладені на: науковій конференції викладачів, співробітників та студентів, присвяченій 120-річчю заснування Чернівецького університету (Чернівці, 1995р.), симпозіумі “Актуальні питання медичної допомоги населенню” (Чернівці, 1996), II Українській науково-практичній конференції по народній і нетрадиційній медицині (Дніпропетровськ, 1996), науковій конференції “Актуальні питання морфогенезу” (Чернівці, 1996р.), VII Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997р.), Другому міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль,1998р.), III Українській науково-практичній конференції з народної та нетрадиційної медицини (Київ, 1998р.), звітних наукових конференціях Буковинської державної медичної академії (1998, 1999р).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 робіт (8 статей та 7 тез доповідей), з них 6 у фахових виданнях.

Структура та обсяг роботи. Робота викладена на 176 сторінках і складається із восьми розділів: вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень представлених у 5 розділах, узагальнення одержаних даних, висновків та практичних рекомендацій, списку використаних джерел (283 джерела, з яких 95 - іноземних авторів). Робота містить 20 таблиць та 2 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

Експериментальні дослідження було проведено на 290 білих безпородних щурах масою 135-145 г та еритроцитах крові 24 донорів.

У роботі використовували спиртову настоянку арніки гірської (НАГ), яка була виготовлена із висушених суцвіть Arnica montana L. у співвідношенні (1:10), способом мацерації (настоювання) на 70% етиловому спирті і відповідала усім поставленим до неї вимогам згідно Державної фармакопеї та ФС 42-206183 (На-стойка арники).

Вивчення характеру дії настоянки арніки гірської на проникність мембран еритроцитів донорів за умов гіпотонічного гемолізу та вплив останньої на швидкість індукованого in vitro ферментативного (НАДФН-залежного) та неферментативного (аскорбат-залежного) пероксидного окислення ендогенних ліпідів проводилися згідно описаних раніше методів (І.Ф. Мещишен, 1991).

Як моделі оксидантного стресу у щурів було використано: опромінення в дозі 0,5 Гр, ерозивно-виразкове ураження гастродуоденальної зони та токсичний гепатит.

Опромінення тварин проводили рентгенівським діагностичним апаратом 12 П6, одноразово в сумарній дозі 0,5 Гр за таких умов: напруга 40 кВ, сила струму 80 мА, фільтри 0,5 мм Сu, шкірно-фокусна відстань 40 см, потужність дози 1 Р/секунду. Аппарат, який використовували, був пристосований до наших потреб, рівномірність опромінення по площі контролювали за допомогою дозиметра. Тварин опромінювали в спеціальних клітках по 5 в кожній серії, що давало можливість розташувати тварин в межах фокусної плями рентгенапарату.

Ерозивно-виразкове ураження гастродуоденальної зони (ЕВУ) у щурів викликали за розробленою раніше методикою (О.І. Волошин, І.Ф.Мещишен, 1986). Тваринам протягом 12 днів перорально вводили суміш, що складалася з 10% розчину консервованої медичної жовчі (10 мл/кг), індометацину (3мг/кг) та ацетилсаліцилової кислоти (100 мг/кг).

Токсичний гепатит у щурів викликали шляхом внутрішньошлункового введення тваринам тетрахлорметану, дворазово (через день), із розрахунку 0,25 мл/100г маси тіла тварини у вигляді 50%-ного олійного (оливкового) розчину (Ю.И.Губский, 1984; Н.П. Скакун, 1989).

Дослідних тварин розділено на три групи: 1 - інтактні щурі (контроль),
2 - неліковані щурі з модельованим оксидантним стресом, 3 - щурі, які як корегуючий засіб отримували настоянку арніки гірської.

Тварин забивали декапітацією під легким ефірним наркозом. Кров відбирали в присутності ЕДТА в концентрації 1 мг/мл цільної крові. В цільній крові визначали вміст: сполук з ізольованими подвійними зв'язками (ІПЗ), дієнових кон'югатів (ДК), кетодієнів і спряжених триєнів (КД і СТ) (И.А. Волчегорский и др., 1989), глутатіону відновленого (ГВ) (О.В. Травина, 1955). В гомогенатах печінки та стінок шлунку щурів визначали вміст сполук з ІПЗ, ДК, КД і СТ (І.В. Печенюк, 1993 ) та малонового диальдегіду (МДА) (Ю.В. Владимиров, А.И.Арчаков, 1972). В гемолізатах крові та гомогенатах печінки щурів визначали активність: супероксиддисмутази (СОД) [КФ 1.15.1.1] (Е.Е. Дубинина и соавт., 1983), каталази [КФ 1.11.1.6] (М.А. Королюк и соавт., 1988), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ) [КФ 1.1.1.49] (Ю.Л. Захарьин, 1967), глутатіон-редуктази (ГР) [КФ 1.6.4.2.] (E. Beutler, 1969), глутатіонпероксидази (ГП) [КФ 1.11.1.9] (І.В. Геруш, І.Ф. Мещишен, 1998). В плазмі крові та гомогенатах печінки визначали активність глутатіон-S-трансферази (Г-S-Т) [КФ 2.5.1.18] (Habig Н., 1974). Вміст церулоплазміну (ЦП) [КФ 1.16.3.1] в плазмі крові визначали за модифікованим методом Ревіна, а вміст МДА в еритроцитах крові - за Н.В. Васильевою та І.Ф. Мещишеним, 1998.

Одержані експериментальні дані обробляли статистично з використанням t-критерію Ст'юдента (И.А. Ойвин, 1960).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Фізико-хімічні показники та біологічні властивості настоянки арніки гірської

Згідно отриманих результатів, настоянка з суцвіть арніки гірської містить значну кількість природних антиоксидантів. Це, зокрема, флавоноїди та інші поліфенольні сполуки (кверцетин, рутин, хлорогенова кислота, дубильні речовини), сесквітерпени (арніфолін), есенціальні жирні кислоти (олеїнова, лінолева та ліноленова), аскорбінова кислота, валепотріати, ?-каротин.

Вивчення характеру дії настоянки арніки гірської на проникність мембран еритроцитів донорів за умов гіпотонічного гемолізу та проведений в системі in vitro скринінг антиоксидантних властивостей настоянки показали, що досліджуваний препарат має виражені мембраностабілізуючі та антиоксидантні властивості в досить широкому діапазоні концентрацій. За основу концентрації препарату в експериментах in vitro нами було обрано вміст однієї з основних діючих речовин арніки - арніфоліну (521 мг/100г настоянки). В діапазоні концентрацій настоянки арніки, що відповідають 5,21?10-7 -5,21?10-2 мг арніфолі-ну/100г настоянки виявлена мембраностабілізуюча дія препарату, а при концентраціях вище 5,21?10-2 - спостерігався гемолітичний ефект.

Скринінг антиоксидантних властивостей настоянки арніки гірської in vitro показав, що вже починаючи з концентрації препарату, що відповідає 5,21?10-6 мг арніфоліну/100г настоянки і вище препарат гальмує індуковане Fe2+ пероксидне окислення ліпідів, про що свідчило зниження вмісту одного з кінцевих продуктів ПОЛ - малонового диальдегіду.

Для пiдтвердження отриманих в умовах in vitro даних про антиоксидантнi властивостi настоянки арнiки гiрської ми провели ряд дослiджень in vivo. Оскiльки половинне гальмування НАДФН-залежного ПОЛ спостерiгалося при концентрацiї препарату 2,605?10-3 мг арніфоліну/100 г настоянки, то в перерахунку на 1 кг маси тіла необхiдно 0,2 мл настоянки.

Стан оксидантної та антиоксидантної систем організму щурів за умов дії настоянки арніки гірської

Тваринам, що попередньо голодували протягом 12 годин, настоянку арнiки гiрської вводили щоденно перорально в дозi 0,02 мл/100г маси тварини, у вигляді 1 мл водно-спиртового розчину (1:50). Тварин забивали методом декапiтацiї пiсля легкого ефiрного наркозу через 12 та 24 год, а також на 3-, 7- та 14-ту добу після щоденного одноразового введення препарату. Проведенi дослiдження пiдтвердили встановленi ранiше в системi in vitro антиоксидантнi властивостi настоянки арнiки гiрської.

Так, як показано на табл. 1, вже через 12 год пiсля введення щурам настоянки арніки гірської у крові останніх спостерiгалося зниження вмiсту дієнових кон'югатів.

Таблиця 1.

Вміст продуктів пероксидного окислення ліпідів в крові щурів за умов дії настоянки арніки гірської (М?m; n=8-20)

Групи тварин, умови досліду	Досліджувані показники (одиниці вимірюванння)
	ІПЗ, Е220/ мл крові	ДК, Е232 / мл крові	КД і СТ, Е278/ мл крові	МДА, нмоль/мл еритр.
Контроль	4,180,09	1,700,08	0,760,03	12,660,42
12 годин	3,700,13	1,420,09	0,710,02	12,580,57
24 години	3,50,11	1,40,07	0,600,03	12,400,13
3 доби	2,860,18	1,350,09	0,580,02	10,140,36
7 діб	3,140,11	1,300,04	0,580,03	9,830,90
14 діб	3,920,07	1,300,12	0,670,07	12,500,30

Примітка: вірогідні зміни досліджуваних показників порівняно з контролем (Р<0,05).

Через 24 год пiсля введення настоянки у кровi та печінці щурiв знизився вмiст усiх проміжних молекулярних продуктiв ПОЛ: сполук з ізольованими подвійними зв'язками, дієнових кон'югатів, кетодієнів і спряжених триєнів, порівняно з інтактними тваринами. Вміст одного з кінцевих продуктів ПОЛ - малонового диальдегіду в еритроцитах крові при цьому залишався на рiвнi тварин контрольної групи, а у печінці - знизився в середньому на 13%.

Щоденне застосування настоянки арніки протягом 3 та 7 днiв призвело до зниження у крові та печінці тварин вмiсту усіх досліджуваних продуктів ПОЛ, в порівнянні з інтактними щурами. У крові тварин, які отримували настоянку протягом 14 днів, спостерігали зниження вмісту дієнових кон'югатів в середньому на 23%, а в печінці - дієнових кон'югатів та малонового диальдегіду- на 14 та 11% відповідно, у порівнянні з інтактними тваринами. Решта досліджуваних показників ПОЛ у крові та печінці щурів, які щоденно протягом двох тижнів отримували настоянку арніки гірської практично не відрізнялися від таких у тварин контрольної групи.

Регуляцiя процесiв ПОЛ у клiтинi, як відомо, здiйснюється за допомогою систем антиоксидантного захисту. Згiдно отриманих результатiв (табл.2), одноразове введення iнтактним тваринам настоянки арнiки гiрської (1:10) в дозі 0,2 мл/кг маси щура активує функцiонування систем антиоксидантного захисту кровi. Так, уже через 12 годин пiсля введення препарату в кровi та печінці тварин дослiдної групи спостерiгалося пiдвищення активностi глутатіонпероксидази (на 14 та 16%, відповідно). В печінці щурів спостерігалося також тимчасове підвищення активності глутатіон-S-трансферази, активність якої через 24 години нормалізувалася і залишалася на такому ж рівні у всі решту строки дослідження. Через 24 години пiсля введення щурам настоянки арнiки в крові та печінці щурів спостерiгали пiдвищення активностi супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази та вмiсту церулоплазміну. Вмiст глутатіону відновленого знизився, очевидно, через посилене його використання глутатіонпероксидазою, проте при повторному введенні препарату відновлювався до рівня тварин контрольної групи і залишався на такому ж рівні до кінця експерименту, що, імовірно, пов'язано з посиленням процесу регенерації його з окисленої форми, про що свідчило підвищення активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази та глутатіонредуктази. Не виключена також можливість активації синтезу глутатіону в печінці під дією препарату.

За умов регулярного перорального введення тваринам настоянки арнiки гірської протягом 3 та 7 днiв у тій же дозі пiдвищеною у крові та печінці щурів була активнiсть: супероксиддисмутази, каталази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, глутатіонредуктази, глутатіонпероксидази та вміст церулоплазміну в плазмі. Вмiст ГВ в крові та печінці щурів, які отримували настоянку, не вiдрiзнявся вiд такого у iнтактних тварин. При тривалому її введенні (протягом двох тижнiв) пiдвищеною залишалася лише активнiсть глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в крові та глутатіонпероксидази в печінці щурів.

Таблиця 2.

Показники антиоксидантної системи крові щурів за умов дії настоянки арніки гірської (М±m; n=8-20)

Групи тварин, умови досліду	Досліджувані показники (одиниці вимірювання)
	СОД, од/мл крові	Каталаза, мкмоль/хв г Нb	ЦП, мг/ л плазми	Г-6-ФДГ, мкмоль / хв г Нb	ГР, мкмоль / хв г Нb	ГВ, мкмоль / мл крові	ГП, мкмоль/хв мл крові
Контроль	34,14 1,10	132,10 4,29	186,25 4,41	6,00 0,16	2,42 0,12	1,12 0,06	22,03 0,67
12 годин	33,15 1,2	139,22 9,07	184,63 4,6	5,93 0,31	2,32 0,11	1,16 0,04	25,11 0,92
24 години	37,58 0,77	223,5114,29	225,20 3,50	6,85 0,23	3,66 0,08	0,87 0,03	30,4 0,99
3 дні	39,99 1,7	173,9711,60	215,0 3,0	6,89 0,13	3,0 0,17	1,04 0,04	26,22 0,53
7 днів	34,42 2,5	153,94 7,9	230,7 6,10	7,58 0,09	2,86 0,15	1,07 0,05	30,4 0,99
14 днів	30,24 0,16	127,08 6,06	206,53 14,20	6,70 0,07	2,7 0,10	1,02 0,07	22,91 0,84

Примітка: * - вірогідні зміни досліджуваних показників порівняно з контролем (Р?0,05).

Отже, настоянка арнiки гiрської при введеннi її в органiзм гальмує перебіг процесів пероксидного окислення ліпідів та стимулююче діє на функцiонування систем антиоксидантного захисту кровi - пiдвищує активнiсть супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, церулоплазміну, сприяє регенерацiї з окисленої форми важливого ендогенного антиоксиданта крові - глутатіону відновленого.

Дослідження останніх років показали існування в природі діапазону так званих малих доз радіації [Барабой В.А., 1997], одним з молекулярних механізмів пошкоджуючої дії яких є підвищення в тканинах організму концентрації активних форм кисню, посилення внаслідок цього процесів вільнорадикального окислення ліпідів та виснаження антиоксидантних резервів клітини.

Через 7 днів після одноразового опромінення тварин в дозі 0,5Гр в крові та печінці щурів спостерігали підвищення вмісту усіх досліджуваних молекулярних продуктів пероксидного окислення ліпідів (рис.1).

В крові та печінці опромінених щурів спостерігалася також дискоординація у функціонуванні систем антиоксидантного захисту: пригнічення активності СОД, каталази, глутатіонпероксидази, підвищення вмісту церулоплазміну, ГВ та ферментів, що беруть участь у його регенерації з окисленої форми (рис. 2).

Рис.2. Показники систем антиоксидантного захисту крові щурів за умов одноразового опромінення в дозі 0,5 Гр та дії настоянки арніки гірської

Активність глутатіон-S-трансферази знизилася в печінці опромінених щурів, проте підвищилася в плазмі крові, що, очевидно, є результатом посилення деструкції плазматичних мембран за умов дії малих доз радіації [Леус Н.Ф., 1997].

Введення опроміненим щурам настоянки арніки гірської протягом 7 днів після опромінення з метою корекції пострадіаційних порушень оксидантно-антиоксидантної рівноваги сприяло покращенню досліджуваних показників: усі вони за виключенням вмісту кетодієнів і спряжених триєнів та глутатіону відновленого в крові нормалізувалися.

Ще ефективнішим виявилося застосування настоянки арніки гірської з лікувально-профілактичною метою (протягом 7 днів до та 7 днів після опромінення). Усі досліджувані показники ПОЛ та систем антиоксидантного захисту в даній групі тварин не відрізнялися від таких у інтактних щурів, що свідчить про високі радіопротекторні можливості настоянки арніки гірської.

Процес виразкоутворення, як відомо [Звершхановский Ф.А., 1988, Пасечников В.Д., 1988], також супроводжується порушенням в тканинах оксидантно-антиоксидантної рівноваги.

Так, вміст сполук з ізольованими подвійними зв'язками, дієнових кон'югатів, кетодієнів і спряжених триєнів та малонового диальдегіду в крові та печінці щурів з експериментальною виразкою збільшився в середньому відповідно на 35, 14, 20, 51% та на 48, 29, 34, 61%. Порушення у функціонуванні систем антиоксидантного захисту у щурів з експериментальними ерозивно-виразковими ураженнями гастродуоденальної зони характеризувалися у крові, зокрема, різким пригніченням активності супероксиддисмутази та каталази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, виснаженням запасів глутатіону відновленого (в середньому на 10, 24, 16 та 23%, відповідно), порівняно з інтактними тваринами (табл. 3). У крові та печінці щурів з експериментальним ерозивно-виразковим ураженням гастродуоденальної зони спостерігалося також компенсаторне підвищення активності глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази.

Таблиця 3.

Показники антиоксидантної системи крові щурів за умов експерементального ерозивно-виразкового ураження гастродуоенальної зони (ЕВУ) та дії настоянки арніки гірської (НАГ) (М?m; n=8-16)

__ Групи тварин, Умови досліду	Досліджувані показники (одиниці вимірювання)
	СОД, од/мл крові	Каталаза, мкмоль / хв г Нb	ЦП, мг/л плазми	Г-6-ФДГ, мкмоль /хв г Нb	ГР, мкмоль / хв г Нb	ГВ, мкмоль/мл крові	ГП, мкмоль/хв мл крові	Г-S-T, нмоль/хв мл пл.·
Контроль	33,87 0,76	134,49 9,84	211,9910,42	6,24 0,10	2,92 0,16	1,07 0,03	21,33 0,69	40,84 1,15
ЕВУ	30,67 0,65	102,6610,0	371,8823,19	5,25 0,15	3,63 0,19	0,82 0,03	24,73 0,44	48,62 2,5
7 доба	ЕВУ	30,73 1,01	105,845,73	409,914,88	5,31 0,18	3,47 0,18	0,84 0,05	25,21 1,1	46,43 2,17
	ЕВУ + НАГ	35,45 0,85	121,0 4,75	365,0415,89	5,96 0,29	3,35 0,11	0,93 0,04	22,4 1,05	40,23 1,18
14 доба	ЕВУ	32,93 0,97	113 6,42	335,7620,3	5,74 0,11	3,29 0,12	0,92 0,04	23,28 0,87	45,0 2,15
	ЕВУ + НАГ	3304 0,80	144,088,39	219,3518,4	6,08 0,12	2,88 0,09	1,07 0,02	21,66 0,71	42,28 1,69

Примітка:* -вірогідні зміни досліджуваних показників порівняно з контролем (Р?0,05).

Застосування настоянки арніки гірської з метою корекції виявлених у щурів з ерозивно-виразковими ураженнями гастродуоденальної зони порушень оксидантно-антиоксидантного гомеостазу сприяло швидшому його відновленню, а двотижневе застосування препарату призвело до повної їх нормалізації.

Токсичний гепатит розглядається нині [Губский Ю.И, 1984, 1989, Скакун Н.П., 1989] як універсальна модель молекулярної патології клітинних мембран, порушеннях структури та функцій яких є ключовим процесом у розвитку багатьох різних за етіологією патологічних станів.

Одним з молекулярних механізмів гепатотоксичної дії тетрахлорметану є, як відомо [Губский Ю.И., 1989, Скакун Н.П., 1989], його прооксидантний ефект. Введення щурам тетрахлорметану веде до формування в організмі тварини так званого “оксидантного стресу”. Так, вже в перші строки отруєння щурів в печінці останніх спостерігалося пригнічення систем антиоксидантного захисту (табл. 4), за виключенням активності глутатіонпероксидази, активність якої через добу після інтоксикації була підвищеною (на 47%), порівняно з контролем, та суттєве накопичення усіх досліджуваних нами молекулярних продуктів ПОЛ (табл. 5).

Таблиця 4.

Показники антиоксидантної системи печінки щурів за умов експериментального токсичного гепатиту та дії настоянки арніки гірської (НАГ) (М?m; n=8-20)

Групи тварин, Умови досліду	Досліджувані показники (одиниці вимірювання)
	СОД, од/мг білка	Каталаза, мкмоль/хв мг білка	ГВ, мкмоль/мг тканини	Г-6-ФДГ, нмоль /хв мг білка	ГР, нмоль /хв мг білка	ГП, нмоль/хв мг білка	Г-S-T, нмоль/хв мг білка
Контроль	0,52 0,02	189,45 4,17	7,17 0,09	9,45 0,14	3,93 0,1	274,06 9,14	56,45 1,16
Гепатит (1 доба)	0,34 0,01	118,14 0,06	4,03 0,20	6,41 0,29	2,33 0,1	401,35 2,2	29,91 1,68
3 доба	Гепа-тит	0,38 0,03	131,77 0,6	11,91 0,17	12,91 0,17	4,97 0,1	415,8320,67	39,881,39
	Гепатит + НАГ	0,40 0,02	146,44 7,08	12,41 0,17	11,94 0,24	5,14 0,1	409,24 2,11	45,73 2,74
7 доба	Гепа-тит	0,41 0,02	141,91 5,36	9,12 0,12	11,20 0.19	4,64 0,13	392 15,66	42,11 2,98
	Гепатит + НАГ	0,49 0,01	171,72 8,14	8,27 0,13	9,54 0,20	4,21 0,17	284,9 9,81	50,65 1,15
14 доба	Гепа-тит	0,48 0,02	173,27 6,82	8,23 0,14	9,41 0,24	4,45 0,10	363,14 10,0	45,82 1,86
	Гепатит + НАГ	0,49 0,02	179,25 8,52	7,15 0,27	9,21 0,25	4,01 0,10	280,78 18,51	56,47 1,61

Примітка: * -вірогідні зміни досліджуваних показників порівняно з контролем (Р?0,05).

Таблиця 5.

Вміст продуктів пероксидного окислення ліпідів в печінці щурів за умов експериментального токсичного гепатиту та дії настоянки арніки гірської (НАГ) (М±m; n=8-20)

Групи тварин, умови досліду	Досліджувані показники (одиниці вимірюванння)
	ІПЗ, Е220/ г тканини	ДК, Е232/ г тканини	КД і СТ, Е278/г тканини	МДА, мкмоль/г тканини
Контроль	37,740,81	22,380,53	12,860,32	39,811,09
Гепатит (1 доба)	49,882,24	26,210,55	21,840,47	60,433,11
3 доба	Гепатит	58,392,14	35,261,23	18,740,26	89,862,67
	Гепатит + НАГ	50,041,07	30,151,15	15,320,27	86,343,21
7 доба	Гепатит	51,871,44	30,70,84	13,320,27	65,972,94
	Гепатит + НАГ	45,441,12	26,370,85	12,810,4	60,222,03
14 доба	Гепатит	44,022,26	26,031,46	12,220,71	45,572,38
	Гепатит + НАГ	37,351,51	21,621,48	12,240,5	37,882,77

Примітка: 0 вірогідні зміни досліджуваних показників порівняно з контролем (Р?0,05)

Через три доби після інтоксикації тварин в крові та печінці останніх спостерігалася мобілізація антиоксидантних систем захисту (підвищився вміст ГВ, активність Г-6-ФДГ, ГР, ГП).

Активність Г-S-Т в печінці інтоксикованих щурів залишалася зниженою, проте в плазмі крові - підвищилася, що може бути пов'язано з виходом ферменту із гепатоцитів в кров.

Незважаючи на мобілізацію антиоксидантних резервів клітини, рівень продуктів ПОЛ в тканинах щурів на третю добу після інтоксикації продовжував зростати.

У групі тварин, яка отримувала на фоні післядії тетрахлорметану настоянку арніки гірської, позитивна динаміка щодо досліджуваних показників ПОЛ прослідковувалася вже починаючи з третьої доби застосування препарату. Вміст молекулярних продуктів ПОЛ в даній групі тварин був нижчим, ніж у нелікованих, а введення настоянки протягом 14 днів сприяло повній стабілізації процесів ПОЛ та функціонування систем антиоксидантного захисту крові тпечінки щурів.

Таким чином, показано, що настоянка арніки гірської стабілізує, порушений за умов оксидантного стресу оксидантно-антиоксидантний гомеостаз шляхом:

1) гальмування процесів пероксидного окислення ліпідів, можливо за рахунок зменшення в тканинах концентрації активних форм кисню;

2) активації систем антиоксидантного захисту крові та печінки щурів;

3) стабілізації клітинних мембран.

ВИСНОВКИ

1. Оксидантний стрес у щурів (дія низьких доз радіації, ерозивно-виразкове ураження гастродуоденальної зони, токсичний гепатит) супроводжується суттєвим накопиченням в тканинах тварин первинних, проміжних та кінцевих молекулярних продуктів пероксидного окислення ліпідів (ПОЛ): сполук з ізольованими подвійними зв'язками, дієнових кон'югатів, кетодієнів і спряжених триєнів, малонового диальдегіду.

2. Порушення оксидантно-антиоксидантної рівноваги в організмі щурів на 7 день після одноразового їх опромінення в дозі 0,5 Гр характеризується зниженням в крові та печінці опромінених тварин активності супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази та глутатіон-S-трансферази; підвищенням активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, глутатіонредуктази, вмісту відновленого глутатіону та церулоплазміну.

3. Експериментальне ерозивно-виразкове ураження гастродуоденальної зони та токсичний гепатит супроводжуються істотніми порушеннями функціонування систем антиоксидантного захисту: в крові та печінці тварин спостерігалося різке їх пригнічення в ранні строки та часткове відновлення у віддалені.

4. Настоянка арніки гірської при дії на мембрани еритроцитів донорів за умов гіпотонічного гемолізу виявляє двофазовий характер дії: концентрації препарату, що відповідають 5,21?10-7 - 5,21?10-2 мг арніфоліну/100г настоянки проявляють виражену мембраностабілізуючу дію, а концентрації препарату вище 5,21?10-2 мг арніфоліну/100г настоянки - гемолітичний ефект.

5. Встановлено антиоксидантні властивості настоянки арніки гірської: при введенні її інтактним щурам в дозі 0,2 мл/кг маси остання гальмує перебіг процесів пероксидного окислення ліпідів (ПОЛ), про що свідчило зменшення в крові та печінці щурів вмісту досліджуваних молекулярних продуктів ПОЛ.

6. Введення інтактним щурам настоянки арніки гірської в дозі 0,2 мл/кг маси сприяло активації функціонування систем антиоксидантного захисту крові та печінки тварин: за дії препарату підвищилася активність супероксиддисмутази, каталази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, глутатіонредуктази, глутатіонпероксидази, вміст глутатіону відновленого та церулоплазміну.

7. Введення тваринам настоянки арніки гірської за умов оксидантного стресу (дії низьких доз радіації, експериментального ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони та токсичного гепатиту) протягом 14 днів сприяло стабілізації перебігу процесів ПОЛ та функціонування систем антиоксидантного захисту в тканинах щурів.

Основні роботи, що опубліковані за темою дисертації

1. Яремій І.М., Мещишен І.Ф., Волошин О.І., Захарчук Т.В. Мембраностабілізуюча дія настойки арніки гірської//Фармац. журн. -1997. -N2. -С.90-93.

2. Яремій І.М., Григор'єва Н.П., Мещишен І.Ф. Вплив настойки арніки гірської на стан пероксидного окислення ліпідів та захисної глутатіонової системи печінки щурів за умов експериментального токсичного гепатиту//Укр. биохим. журн. -1998. -Т.70, N2. -С.86-90.

3. Яремій І.М., Григор'єва Н.П. Антиоксидантні властивості настоянки арніки гірської//Науковий вісник Чернівецького університету. -1998. -Вип.20. (Біологія). -С.61-66.

4. Яремій І.М., Мещишен І.Ф. Вплив настоянки арніки гірської на оксидантний стан крові, печінки та шлунку щурів при експериментальній виразковій хворобі//Вісник проблем біології і медицини. -1998. -Вип.18. -С.77-79.

5. Яремій І.М., Григор'єва Н.П., Мещишен І.Ф., Костюк Л.С. Вплив настоянки арніки гірської на активність деяких гідролітичних ферментів щурів за умов експериментального токсичного гепатиту//Укр. биохим. журн. -1998. -Т.70,N6. -С.88-91.

6. Яремій І.М., Григор'єва Н.П. Вплив настоянки арніки гірської на стан антиоксидантної системи крові щурів при експериментальному ерозивно-виразковому ураженні гастродуоденальної зони//Науковий вісник Чернівецького університету. -1998. -Вип.20. (Біологія). -С.138-141.

7. Мещишен І.Ф., Волошин О.І., Яремій І.М. Арніка гірська як лікарська рослина//Деп. у ДНТБ Укр. 25.11.95, N2467-Ук95, Чернівці, 1995. -16с.

8. Яремій І.М., Григор'єва Н.П. Вплив спиртової настойки арніки гірської на стан пероксидного окислення ендогенних ліпідів//Матеріали наукової конференції викладачів, співробітників та студентів присвяченої 120-річчю заснування Чернівецького університету (4-6 травня 1995р.).-Т.3.-Чернівці: Рута,1995.-С.63.

9. Яремій І.М., Григор'єва Н.П., Захарчук Т.В. Вплив настойки арніки гірської на стан оксидантної та антиоксидантної систем крові та печінки щурів за умов експериментального гепатиту//Матеріали II Української науково-практичної конференції по народній і нетрадиційній медицині. Тези доповідей, Дніпропетровськ, 1996. -С.96.

10. Григор'єва Н.П., Яремій І.М. Антиоксидантні властивості настойки арніки гірської за умов норми та патології//Матеріали VII Українського біохімічного з'їзду (Тези доповідей). -К, 1997. -Ч.III. -С.22-23.

11. Яремій І.М. Корекція настоянкою арніки гірської порушень оксидантно-антиоксидантного статусу організму щурів з експериментальним ерозивно-виразковим ураженням гастродуоденальної зони//Матеріали 2 міжнародного медичного конгресу студентів та молодих вчених 6-8 травня 1998р. (Тези доповідей). -Тернопіль: Укрмедкнига. -1998. -С.93-94.

12. Яремій І.М., Григор'єва Н.П. Вплив настоянки арніки гірської на стан глутатіонової системи щурів за умов низьких доз радіації//Матеріали III української науково-практичної конференції з народної та нетрадиційної медицини 25-26 вересня 1998р. -Т.1. -С.138-139.

анотації

Яремій І.М. Оксидантно-антиоксидантний стан організму щурів за умов оксидантного стресу та дії настоянки арніки гірської. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Чернівецький державний університет ім. Ю. Федьковича, Чернівці, 1999 рік.

В дисертації містяться дані про оксидантний (пероксидне окислення ліпідів) та антиоксидантний (вміст церулоплазміну, відновленого глутатіону, активність супероксиддисмутази, каталази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, глутатіон-редуктази, глутатіонпероксидази та глутатіон-S-трансферази) стан організму щурів за умов оксидантного стресу: дії низьких доз радіації (одноразове опромінення в дозі 0,5 Гр), експериментального ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони, токсичного гепатиту та дії настоянки арніки гірської.

За умов оксидантного стресу показано суттєві порушення оксидантно-антиоксидантного гомеостазу (посилення процесів пероксидного окислення ліпідів, порушення функціонування систем антиоксидантного захисту) та антиоксидантні властивості настоянки арніки гірської.

Ключові слова: пероксидне окислення ліпідів, антиоксидантні системи, низькі дози радіації, ерозивно-виразкове ураження гастродуоденальної зони, токсичний гепатит, щурі, настоянка арніки гірської.

арніка гірський окислення ліпід

Яремий И.Н. Оксидантно-антиоксидантное состояние организма крыс в условиях оксидантного стресса и действия настойки арники горной. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04.- биохимия. Черновицкий государственный университет им. Ю. Федьковича, Черновцы, 1999 год.

В дисертации содержатся данные об оксидантном (пероксидное окисление липидов) и антиоксидантном (количестве церулоплазмина, глутатиона восстановленного, активности супероксиддисмутазы, каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы) состоянии организма крыс в условиях оксидантного стресса: действие низких доз радиации (однократное облучение в дозе 0,5 Гр), экспериментального эрозивно-язвенного поражения гастродуоденальной зоны, токсического гепатита и действия настойки арники горной.

Показано, что в условиях гипотонического гемолиза низкие концентрации настойки арники горной, соответствующие 5,21 10-7-5,21 10-2 мг арнифоли-на/100г настойки, стабилизируют клеточные мембранны эритроцитов, а концентрации выше 5,21 10-2 - обладают гемолитическим эффектом.

Проведенный в системе in vitro скрининг антиоксидантных свойств исследуемого препарата показал, что последний способен ингибировать индуцированное пероксидное окисление эндогенных липидов уже начиная с концентрации препарата, соответствующей 5,21 10-6 мг арнифолина/100г настойки, а 50% ингибирование процессов ПОЛ наблюдалось при концентрации настойки 2,605 10-3 мг арнифолина/100г настойки. Следует заметить, что более чувствительным к действию препарата оказалось ферментативное (НАДФН-зависимое) ПОЛ, по сравнению с неферментативным (аскорбат-зависимым).

На основании полученных в системе in vitro данных, а также для подтверждения последних было расчитано среднесуточную эффективную дозу препарата и проведено серию исследований in vivo. Согласно полученным результатам, уже через 12 часов после однократного введения интактным крысам изучаемого препарата в крови и печени последних снижается количество диеновых коньюгатов и повышается активность глутатионпероксидазы, а через 24 часа - снижение количества соединений с изолированными двойными связями, диеновых коньюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов, малонового диальдегида, увеличение концентрации церулоплазмина, активности супероксиддисмутазы, каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатион-редуктазы, глутатионпероксидазы. Уровень глутатиона восстановленного при этом был ниже, чем у интактных крыс, но при повторном введении настойки нормализовался и находился примерно на таком уровне до конца исследования.

Оксидантно-антиоксидантный статус организма крыс, установленный через 24 часа после введения настойки сохранялся и при введении ее в указанной дозе ежедневно в течении 3 и 7 дней.

Показатели антиоксидантной системы и ПОЛ в группе животных подвергшихся длительному введению препарата (ежедневно в течение 14 дней) практически не отличались от показателей контроля.

Оксидантный стресс у крыс (действие низких доз радиации, экспериментальное эрозивно-язвенное поражение гастродуоденальной зоны, токсический гепатит) сопровождаются существенными нарушениями оксидантно-антиоксидантного гомеостаза.

На 7 сутки после однократного рентгеновского облучения крыс в дозе 0,5 Гр в крови и печени животных наблюдается увеличение первичных, промежуточных и конечных продуктов ПОЛ, а также дискоординация в функционировании систем антиоксидантной защиты: снижения активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, увеличение количества церулоплазмина, глутатиона восстановленного и активности ферментов, принимающих непосредственное участие в регенерации его из окисленной формы (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глутатионредуктаза).

Введение животным настойки арники горной в течении 7 дней после облучения способствовало улучшению исследуемых показателей в крови и печени крыс. В группе животных принимавших настойку в течение 7 дней до и 7 дней после облучения все исследуемые показатели не отличались от показателей интактных животных.

Экспериментальное эрозивно-язвенное поражение гастродуоденальной зоны у крыс сопровождается существенным увеличением в стенках желудка, крови и печени крыс молекулярных продуктов ПОЛ. Процесс язвообразования сопровождается увеличением концентрации церулоплазмина, активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы; снижением активности супероксиддисмутазы, каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, уровня глутатиона восстановленного в крови и печени крыс. Активность глутатион-S-трансферазы была при этом снижена в печени и увеличена в плазме крови крыс.

Введение животным настойки арники горной способствовало более быстрой нормализации исследуемых показателей в тканях крыс, а 14-дневное ее применение привело к их полной нормализации.

Поражение печени четыреххлористым углеродом вызывает значительное накопление в печени и крови крыс всех исследуемых молекулярных продуктов ПОЛ, а также резкое угнетение всех антиоксидантных систем защиты (кроме активности глутатионпероксидазы) в ранние сроки после интоксикации (через сутки после последнего введения тетрахлорметана) и частичное их восстановление в отдаленные (на 7 и 14 сутки).

Применение настойки арники горной на фоне последействия четыреххлористого углерода способствует улучшению исследуемых показателей в крови и печени крыс, а двухнедельное ее использование - их полной нормализации.

Ключевые слова: пероксидное окисление липидов, антиоксидантные системы, низкие дозы радиации, эрозивно-язвенное поражение гастродуоденальной зоны, токсический гепатит, крысы, настойка арники горной.

Yaremiy I.M. Oxidant-antioxidant state of rats' organism in condition of an oxidant stress and the influence of Arnica montana tincture. Manuscript.

Thesis for the competition of a scientific degree of the Candidate of Biological science on the speciality 03.00.04 - Biochemistry. Chernivtsi State University named after Y. Fedkovych, Chernivtsi, 1999.

The present thesis is proposed to be defended for the competition of scientific degree of the Candidate of Biological science, the main principles of which were stated in 15 scientific publications.

The thesis contains date about oxidant (lipid peroxidation) and antioxidant (the level of caeruloplasmin, reduced glutathione, the activity of superoxide dismutase, catalase, glucoso-6-phosphate dehydrogenase, glutathione reductase, glutathione peroxidase and glutathione-S-transferase) state of rats' organism in conditions of oxidant stress: low dose of irradiation (single irradiation in a dose of 0,5 Gr), experimental erosive-ulcer affection of the gastroduodenal area, toxic hepatitis and the influence of Arnica montana tincture.

In condition of an oxidant stress substantial disorder of oxidant-antioxidant homeostasis (incrising the level of lipid peroxidation products and disorder in antioxidant system) in the liver and blood of rats and antioxidant properties of Arnica montana tincture were established.

Key words: lipid peroxydation, antioxydant sestems, low dose of irradiation, erosive-ulser affection of the gastroduodenal area, toxic hepatitis, rats, Arnica montana tincture.

Размещено на Allbest.ru

...