Практическая биохимия

Материалы и реактивы: целлофановый или коллодиевый мешочки; 1 %-ный раствор яичного белка; 1 %-ный раствор желатина, 10 %-ный раствор азотной кислоты; 1 %-ный раствор нитрата серебра; 10 %-ный раствор гидроксида натрия; 1 %-ный раствор сульфата меди.

Оборудование: стеклянные палочки, пробирки, капельницы, пипетки, диализатор (или стеклянный стакан объемом 0,5 л), штатив для пробирок.

Ход работы. Вначале с помощью биуретовой реакции определяют, содержит ли исследуемый раствор белок. Для этого к 10 каплям раствора белка добавляют три капли 10 %-ного раствора гидроксида натрия, одну каплю 1 %-ного раствора сульфата меди и полученную смесь тщательно перемешивают. Красно-фиолетовая окраска свидетельствует о наличии в растворе белка.

Целлофановый (коллодиевый) мешочек наполняют на 1/3 объема 1 %-ным раствором исследуемого белка. Мешочек помещают в диализатор, заполненный дистиллированной водой (или в стеклянный стакан с водой), зажимая у верхнего края двумя стеклянными палочками, которые скреплены резиновыми колечками. Через 1,5 ч с диализатом (наружная жидкость) и используемой для диализа дистиллированной водой проводят реакцию на обнаружение хлоридов.

Готовят две пробирки, в одну из них добавляют 1 мл дистиллированной воды, в другую - 1 мл диализата, затем по одной капле 10 %-ного раствора азотной кислоты и 1 %-ного раствора нитрата серебра. В пробирке, содержащей диализат, наблюдают выпадение белого осадка хлорида серебра, а в пробирке с дистиллированной водой такого осадка нет. Делают вывод о том, что при диализе солевого раствора белка хлориды проникли в диализат через полупроницаемую мембрану.

Для проверки содержания белка в первую пробирку добавляют 3 мл диализата, во вторую - 3 мл диализируемой жидкости, а так же по 1 мл 10 %-ного раствора гидроксида натрия и 12 капли 1 %-ного раствора сульфата меди (проводят биуретовую реакцию). Содержимое перемешивают и наблюдают красно-фиолетовый цвет в пробирке, содержащей диализируемую жидкость. Такое окрашивание отсутствует в пробирке с диализатом. Делают вывод о том, что белок не проникает через полупроницаемую мембрану.

3.6 Лабораторная работа «Определение изоэлектрической точки белков»

Определение изоэлектрической точки белков основано на способности белков под действием осадителей, вызывающих дегидратацию белков, при значении pH среды, соответствующем их изоэлектрической точке, легко осаждаться.

Материалы и реактивы: 1 %-ные растворы казеина и желатина; 0,01, 0,1 и 1 моль/л растворы уксусной кислоты; 0,1 моль/л раствор ацетата натрия; 96 %-ный этиловый спирт (или 95 %-ный ацетон); дистиллированная вода.

Оборудование: стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив для пробирок.

Ход работы. В шесть пробирок помещают соответствующие количества (мл) растворов уксусной кислоты, ацетата натрия, дистиллированной воды и овальбумина (яичного белка) согласно данным таблицы 6. Содержание каждой пробирки перемешивают. Затем во все пробирки медленно по стенке доливают по 2 мл спирта (или ацетона). Через 30 мин определяют изоэлектрическую точку. Она будет соответствовать pH пробирки с максимальной степенью помутнения. Далее провести аналогичный опыт с желатином согласно данным таблицы 7.

Таблица 6. Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для образования значения рН при выявлении изоэлектрической точки овальбумина

Вода	СН3СООН (0,01 моль/л)	CH3COOH (0,1 моль/л)	Раствор казеина (1 %-ный)	рН среды
8,4	0,6		1,0	5,9
7,8	1,3	--	1,0	5,6
8,8	--	0,3	1,0	5,3
8,5	--	0,5	1,0	5,0
8,0	--	1,0	1,0	4,7
7,0	--	2,0	1,0	4,4
5,0	--	4,0	1,0	4,1
1,0	--	8,0	1,0	3,8

Таблица 7. Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для образования рН при выявлении изоэлектрической точки желатина

Вода	CH3COOH (0,1 моль/л)	СН3СООН (1 моль/л)	CH3COONa (0,1 моль/л)	Раствор желатина (1 %-ный)	рН среды
3,8	0,8		2,0	2,0	5,6
3,5	0,5	--	2,0	2,0	5,3
3,0	1,0	--	2,0	2,0	5,0
2,0	2,0	--	2,0	2,0	4,7
--	4,0	--	2,0	2,0	4,4
3,2	--	0,8	2,0	2,0	4,1

Оформить результаты в табличной форме (таблица 8).

Таблица 8. Отчетная таблица экспериментальных данных

Реакции осаждения белков	Яичный белок (овальбумин)	Растительный белок
Осаждение нагреванием
Осаждение минеральными кислотами
Осаждение органическими кислотами
Реактивы на алкалоиды
Осаждение тяжелыми металлами (ацетат свинца и сульфат меди)
Осаждение органическими растворителями (ацетон)
Осаждение солями (NaCl)
Осаждение сульфатом аммония
Диализ солевого раствора белка
Определение изоэлектрической точки белков

4. Ферменты

Ферменты являются белковыми катализаторами биохимических реакций, большая часть которых в отсутствие фермента протекала бы крайне медленно. В отличие от химических катализаторов каждый фермент способен катализировать лишь очень небольшое число реакций, часто только одну.

Таким образом, ферменты это реакционно-специфические катализаторы. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами.

Многие ферменты оказывают каталитическое действие на субстраты только в присутствии специфического термостабильного низкомолекулярного органического соединения - кофермента.

В таких случаях холофермент (каталитически активный комплекс) состоит из апофермента (белковая часть) и связанного с ним кофермента (Приложение Н). Кофермент может быть связанным с апоферментом ковалентными и нековалентными связями. Термин «простетическая группа» относится к ковалентно связанному коферменту. К числу реакций, требующих присутствия кофермента, относятся: окислительно-восстановительные, переноса групп, изомеризации, а также реакции конденсации (по системе IUB это классы 1, 2, 5, 6). Реакции расщепления протекают в отсутствие коферментов (по системе IUB это классы 3 и 4).

4.1 Лабораторная работа «Определение активности амилазы солода по методу Вольгемута»

Метод Вольгемута основан на определении минимального количества фермента, способного при определенных условиях полностью гидролизовать 1 мл 0,1 %-ного раствора крахмала. Амилазная активность солода выражается количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может быть гидролизовано 1 мл вытяжки из солода при температуре 38 °С в течение 30 мин. В норме амилазная активность равна от 160 до 320 единиц активности.

Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности крови и мочи, в пивоварении - для определения амилазной активности солода. Резкое повышение амилазной активности в крови и моче (в 10-30 раз) наблюдается при острых панкреатитах, опухолях поджелудочной железы.

Материалы и реактивы: вытяжка из солода зерновых, разбавленная в 10 раз; 0,1 %-ный раствор крахмала; 0,1 %-ный раствор йода в 0,2 %-ном растворе иодида калия.

Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, капельницы, термостат.

Ход работы. В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в 10 раз вытяжки, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают и 1 мл переносят в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из последней пробирки отбирают 1 мл и выливают. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Разведение вытяжки в десяти пробирках составит: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл раствора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой для прекращения действия фермента, добавляют по две капли раствора йода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением окраски. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвет.

Отметив, при каком разведении произошел полный гидролиз крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с желтоватой окраской содержимого), по количеству неразведенной вытяжки (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность вытяжки (А мл вытяжки расщепляет Х мл 0,1 %-ного раствора крахмала).

Например, желтый цвет появился в четвертой пробирке, где вытяжка разведена в 160 раз. Это количество вытяжки способно гидролизовать 2 мл 0,1 %-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной вытяжки в тех же условиях гидролизует 320 мл: Х = 2Ч160/1. Следовательно, амилазная активность равна 320.

4.2 Лабораторная работа «Определение активности каталазы по Баху»

Метод основан на определении количества пероксида водорода, оставшегося после действия на него каталазы, титрованием на него раствора KMnO₄. Реакция протекает по уравнению

1 мл 0,1 моль/л раствора перманганата калия соответствует 85 мг пероксида водорода.

Материалы и реактивы: препарат каталазы (1 г проростков солода ячменного растирают в фарфоровой ступке с 6 мл фосфатного буфера и фильтруют); 10 %-ный раствор H₂SO₄; 0,1 %-ный раствор пероксида водорода на фосфатном буфере, pH=7,0 (35,0 мл 0,2 моль/л NaH₂PO₄ в 13,6 мл 0,2 моль/л NaH₂PO₄); 0,1 моль/л раствор KMnO₄.

Оборудование: колбы емкостью 100 мл, пипетки, бюретки, термостат.

Ход работы. В две колбы вносят по 2 мл препарата каталазы, в одну из них (проба) прибавляют 1 мл 10%-ного раствора H₂SO₄, затем наливают по 2 мл раствора пероксида водорода в каждую колбу, ставят в термостат на 40 мин при температуре 38 °С. По истечении времени инкубации во вторую колбу (контроль) прибавляют 1 мл 10 %-ного раствора H₂SO₄ и оба раствора титруют 0,1 моль/л раствором KMnO₄ до появления стойкого розового окрашивания от излишка перманганата калия.

Активность каталазы определяют по количеству разложенного пероксида водорода (мл) и рассчитывают по формуле:

,

где - разность результатов титрования контрольного и исследуемого образцов 0,001 н раствором KMnO₄, мл;

Q - количество пероксида водорода (85 мг), соответствующее 1 мл 0,1 моль/л раствора KMnO₄.

4.3 Лабораторная работа «Капельный метод (по Климовскому и Родзевич)»

Амилолитическая активность, обусловленная в основном наличием в препарате б-амилазы, характеризует способность фермента катализировать гидролиз крахмала до неокрашиваемых йодом продуктов. При наличии в препарате б-амилазы и глюкоамилазы этим методом определяется суммарное действие всех амилолитических ферментов.

За единицу амилолитической активности в этом методе принято такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 г растворимого крахмала до продуктов, неокрашиваемых йодом, за 1 час при температуре 30 єС в строго определенных условиях. Амилолитическую активность АС выражают числом указанных единиц в 1 г препарата, культуры или в 1 см³ раствора. Величина АС показывает, сколько граммов крахмала может быть гидролизовано до неокрашиваемых йодом соединений 1 г препарата, культуры или 1 см³ раствора за 1 ч в условиях определения. Окончание реакции контролируют визуально по йодной пробе.

Чувствительность метода определяют минимальным количеством времени, за которое можно визуально уловить изменение окраски йода. Допускают, что скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству применяемого фермента и остается постоянной на протяжении от 5 мин до 1 ч, то есть реакция подчиняется закону реакции нулевого порядка. Кроме того, установлено влияние величины рН и химической природы буфера на величину АС. С ацетатным буфером (рН=4,7) величина АС у грибных препаратов в среднем в 1,5 раза выше, чем при определении с фосфатным буфером (рН=6,0). Поэтому, при определении величины АС грибных культур рекомендуется брать ацетатный буфер.

Недостатком метода является нечеткость визуального определения окончания реакции.

Материалы и реактивы: ацетатный буфер с рН=4,7 для ферментов грибного происхождения; фосфатный буфер с рН=6,0 для ферментов бактериального происхождения; 1 %-ный раствор крахмала (раствор крахмала, употребляемый для анализа грибных препаратов, должен иметь рН=4,7, для анализа бактериальных препаратов - 6,0); растворы йода. Для приготовления основного раствора йода в тарированный стаканчик с притертой крышкой отвешивают 4,4 г йодида калия, 1,4 г металлического йода, добавляют около 2 см³ дистиллированной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содержимое перемешивают и после растворения йода переводят раствор в мерную колбу объемом 100 см³ с притертой пробкой. Доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы хранят в темном прохладном месте. Основным раствором йода можно пользоваться в течение 30 дней со дня его приготовления. Рабочий раствор йода готовят из основного раствора. Для этого 20 см³ основного раствора йода наливают в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 4,4 г йодида калия и доводят общий объем раствора до 100 см³. Рабочий раствор йода может быть употреблен в течение шести дней после его приготовления.

Оборудование: широкие пробирки, стеклянные палочки, пипетки, стаканы объемом 50 мл, чашки Петри, термостат.

Ход работы. Для определения значения АС важно строго соблюдать условия реакции. Для этого предварительно все растворы - субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до температуры 30 °С.

Субстрат в количестве 25 см³ (12,5 мл) помещают в широкую пробирку, в которую вставлена стеклянная палочка. 30 см³ (15 мл) вытяжки и 30 см³ (15 мл) воды наливают в отдельные пробирки, помещают в термостат и выдерживают при температуре 30 єС в течение 10 минут.

Затем в широкую пробирку к раствору крахмала, не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток добавляют от 1 до 25 см³ исходного ферментного раствора и соответствующее количество воды так, чтобы общий объем реакционной смеси был 50 см³. Если ферментная вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см³, а воду вообще не добавлять.

Содержимое пробирки перемешивают палочкой и отмечают время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала. Через каждые 60 секунд из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирают палочкой каплю пробы. Каплю помещают на белую фарфоровую пластину, соединяют эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдают окраску. Реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 секунд. Изменение окраски отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель - йода и реакционной смеси.

Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в пределах от 10 до 20 минут.

Если время гидролиза менее 10 мин, определение повторяют, беря на гидролиз меньше вытяжки и больше воды. Если гидролиз не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, беря на определение больше ферментной вытяжки и меньше воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза.

Если ферментная вытяжка имеет малую или слишком высокую активность, и количество ферментного раствора от 1 до 25 см³ не обеспечивает длительности гидролиза крахмала в течение 10…20 мин, то для анализа берут не 25 см³ раствора крахмала, а большее или меньшее его количество, например, 10 или 40 см³, внося соответствующую поправку в расчетную формулу (соответственно 0,1 или 0,4 вместо, обычных 0,25).

Величину значения амилолитической активности АС (ед./г) рассчитывают по формуле:

где 0,25 - количество крахмала, которое находится в 25 см³ 1 %-ного раствора, г;

60 - коэффициент пересчета на 1 ч;

n - количество фермента, участвующего в реакции, г или см³ (эта величина определяется с учетом концентрации исходной вытяжки и последующего разведения);

t - время, за которое произошло расщепление крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов, мин.

Пример. Для анализа взята ферментная вытяжка воздушной культуры гриба. Исходный раствор приготовлен из расчета 5 г культуры в 100 см³ забуференной воды. Известно, что данная культура очень активна, поэтому сделано дополнительное разведение исходного раствора: 20 см³ доведено в мерной колбе до 50 см³ дистиллированной водой и оттуда на анализ взято 2 см³, т.е. получена такая последовательность разведения:

5 г > 100 см³ > 20 см³ > 50 см³ > 2 см³.

Для гидролиза 0,25 крахмала (25 см³ 1 %-ного раствора крахмала) ферментным раствором последнего разведения (2 см³) потребовалось 12 мин. Тогда АС воздушно-сухой культуры (ед./г) составит:

При пересчете ферментативной активности следует учитывать не абсолютно сухое вещество ферментного препарата, а с учетом влажности. Расчет следует производить по формуле:

,

где W - влажность культуры или препарата.

4.4 Лабораторная работа «Метод Вильштеттера и Вальдшмидта-Лейтца определения протеолитической активности ферментов в модификации»

Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражается количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 1 г препарата или 1 см³ ферментного раствора за 1 ч при температуре 40 єС.

За единицу протеолитической активности принимается количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 ч при принятых условиях опыта.

Материалы и реактивы: 96 %-ный этиловый спирт; 1 %-ный раствор тимолфталеина; 0,1 н раствор NaOH; субстрат - 5 %-ный раствор желатина; вытяжка из анализируемого растения.

Приготовление вытяжки для определения протеолитической активности: навеска 0,25 г растительного материала помещается в фарфоровую ступку и растирается в течение 2,5 мин с 2,5 мл фосфатного буфера (рН=7,3), далее масса фильтруется.

Приготовление 5 %-ного раствора желатина (субстрат): 5 г желатина предварительно замачивается в стеклянном стаканчике в 15…20 см³ дистиллированной воды в течение 20…30 мин. Набухший белок заливается 20…25 см³ буферного раствора с температурой от 70 до 80 °С и тщательно перемешивается стеклянной палочкой. Растворившаяся часть сливается в мерную колбу объемом 100 см³, к нерастворившейся части добавляется еще 20…25 см³ буферного раствора, и полученный раствор снова переносится в эту же колбу. Охлажденный до 40 °С раствор желатина доводится до метки буферным раствором такой же температуры. Готовый раствор желатина хранится в холодильнике при температуре от 2 до 5 °С и используется для анализа в течение двух суток. Перед анализом раствор желатина нагревается до температуры 40 °С на водяной бане.

Оборудование: конические колбы объемом от 200 до 250 мл, мерные колбы объемом 50 мл, стеклянные палочки, пипетки, бюретки, термостат.

Ход работы. К 10 см³ 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 приливают 2 см³ испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см³ реакционной смеси в коническую колбу емкостью от 50 до 100 см³, куда предварительно наливают 20 см³ 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см³ 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют 0,1 н раствором NaOH до появления голубой окраски.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40 єС для гидролиза. Через 3 ч 1 см³ реакционной смеси отбирают во вторую колбу емкостью от 50 до 100 см³, куда предварительно наливают 20 см³ 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см³ 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют, как в случае контрольного варианта.

Расчет протеолитической активности ПС проводят по формуле:

,

где А - количество аминного азота, накопленного за время опыта из реакционной среды, мл;

t - продолжительность протеолиза, ч;

Р - коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см³ жидкого ферментного раствора.

Величину А рассчитывают по формуле:

,

где а - количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1 см³ опытной пробы, см³;

а_к - то же для контрольной пробы;

1,4 - коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К - поправка к титру щелочи.

5. Жиры

Липиды - это гетерогенная группа соединений, непосредственно или опосредовано связанных с жирными кислотами. Их общими свойствами являются:

относительная нерастворимость в воде;

растворимость в неполярных растворителях - эфире, хлороформе, бензоле.

В зависимости от химического состава липиды подразделяют на несколько классов:

- простые липиды, включают вещества, молекулы которых состоят только из остатков жирных кислот (или альдегидов) и спиртов; к ним относятся жиры (триглицериды), воски (эфиры жирных кислот и жирных спиртов);

- сложные липиды могут присоединять функциональные группировки с образованием фосфолипидов (остатки фосфорной кислоты), сульфолипидов (остатки серной кислоты), гликолипидов (углеводы), липопротеидов (белки) (Приложения Л, М).

5.1 Лабораторная работа «Определение числа омыления жира»

Числом омыления называется количество миллиграммов едкого калия, необходимое для нейтрализации всех, как свободных, так и входящих в состав триацилглицеролов жирных кислот, содержащихся в 1 г жира.

Материалы и реактивы: растительное масло, 0,1 %-ный раствор фенолфталеина; раствор HCl (0,5 моль/л); спиртовый раствор KOH (0,5 моль/л). Для приготовления этого реактива растворяют 40 г КОH в 30 мл воды, в зависимости от концентрации спиртового раствора берут соответствующее количество водного раствора КОH и разводят перегнанным в присутствии NаОН (на 100 г спирта 5 г NаОH) спиртом. Спирт с таким соотношением NаОН кипятят с обратным холодильником в течение часа, затем перегоняют. Раствор отстаивают сутки, фильтруют и сохраняют в склянке темного стекла, хорошо закупорив (для защиты от углекислоты воздуха).

Оборудование: колбы емкостью 50 мл, обратный холодильник, водяная баня, пипетки, бюретки, капельницы.

Ход работы. В одну колбу (исследуемая проба) помещают 0,5 г растительного масла, в другую (контрольная проба) - 0,5 мл воды. В обе колбы доливают по 15 мл спиртового раствора КОН и кипятят с обратным холодильником на водяной бане в течение 50 мин до полного омыления глицеридов и нейтрализации свободных жирных кислот. Затем в обе колбы доливают по 10 капель раствора фенолфталеина и титруют в теплой воде раствором НС1 до исчезновения розовой окраски (до нейтральной реакции).

Количество КОН (мг) или число омыления (ЧО), которое пошло на нейтрализацию свободных жирных кислот в 1 г жира, равно:

,

где (В - А) - разность результатов титрования контрольного и опытного образцов раствором соляной кислоты (0,5 моль/л), мл;

a - навеска исследуемого жира, г;

f - коэффициент поправки на титр раствора НС1 (0,5 моль/л);

Q - количество КОН (28,05 мг), эквивалентное 1 мл раствора КОН (0,5 моль/л).

5.2 Лабораторная работа «Определение кислотного числа жира»

Кислотностью жира или кислотным числом называется число миллиграммов едкого калия, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира.

Материалы и реактивы: спирт; нейтрализованный по фенолфталеину; раствор КОН (0,1 моль/л); 0,1 %-ный раствор фенолфталеина, жир (подсолнечное масло).

Оборудование: колбы емкостью 50 мл, пипетки, бюретки.

Ход работы. К 1 г растительного масла добавляют 5 мл спирта, нейтрализованного по фенолфталеину, тщательно перемешивают для максимального растворения свободных жирных кислот и титруют раствором КОН до появления не исчезающей после взбалтывании розовой окраски (окраска не должна исчезать в течение 0,5…1 мин).

Количество КОH (мг) или кислотное число (КЧ), которое пошло на титрование свободных жирных кислот в 1 г жира, рассчитывают по формуле:

,

где А - объём раствора КОН (0,1 моль/л), израсходованного на титрование исследуемой пробы;

f - коэффициент поправки на титр раствора КОН (0,1 моль/л);

Q - количество КОН (5,61 мг), эквивалентное 1 мл раствора КОН (0,1 моль/л).

5.3 Определение эфирного числа жира

Эфирным числом называется число миллиграммов едкого калия, небходимое для нейтрализации всех жирных кислот, образующихся при омылении триацилглицеролов, содержащихся в 1 г жира. Это число определяют как разницу между числом омыления данного жира и его кислотным числом.

5.4 Лабораторная работа «Определение йодного числа жира»

Йодным числом называется количество граммов йода, которое прореагировало с 100 г жира. Это число указывает на содержание в жире непредельных жирных кислот.

Определение йодного числа основывается на реакции присоединения йода по месту двойной связи, которая протекает по уравнению:

Материалы и реактивы: растительное масло; эмерсионное масло; спиртовой раствор йода (0,1моль/л); 1 %-ный раствор крахмала; раствор Na₂S₂O₃ (0,5 моль/л).

Оборудование: две конические колбы ёмкостью 50 мл, пипетки, бюретки.

Ход работы. В первую колбу помещают навеску жира от 0,1 до 0,2 г (исследуемая проба), во вторую от 0,1 до 0,2 мл воды (контрольная проба), прибавляют по 10 мл спиртового раствора йода и перемешивают. Через 15 мин содержимое колб оттитровывают раствором Na₂S₂O₃ сначала до появления слабо-желтого окрашивания, а потом, прибавив 1 мл раствора крахмала, титруют до исчезновения синего окрашивания.

Йодное число вычисляют по формуле:

,

где (В - А) - разность результатов титрования контрольного и опытного образцов в растворе гипосульфита (0,5 моль/л), мл;

a - навеска исследуемого жира, г;

f - коэффициент поправки на титр раствора Na₂S₂O₃ (0,5 моль/л);

Q - количество йода (12,69 мг), эквивалентное 1 мл раствора Na₂S₂O₃ (0,5 моль/л).

6. Витамины

Витамины - важнейший класс незаменимых биологически активных веществ. Организм человека и животных не синтезирует витамины или синтезирует их в недостаточном количестве. В отличие от других незаменимых веществ (аминокислоты и жирные кислоты) витамины не являются пластическим материалом или источником энергии и участвуют в обмене веществ преимущественно как коферменты при биокатализе и регуляторы биохимических и физиологических процессов (Приложение Н).

6.1 Лабораторная работа «Реакция окисления тиамина в тиохром»

Принцип реакции. Витамин В₁ в щелочной среде под действием гексоциано-III феррата калия окисляется в тиохром пигмент желтого цвета, который в изобутиловом спирте дает интенсивно синюю флюоресценцию:

Материалы и реактивы: тиамин в концентрации 5 мкг в 1 мл; 1 %-ный раствор K₃Fe(CN)₆; 30 %-ный раствор NaOH; изобутиловый спирт.

Оборудование: источник ультрафиолетового излучения (флюороскоп), штатив с пробирками, пипетки.

Ход работы. К 1 мл раствора витамина В₁ прибавляют 2 мл смеси (1 мл раствора K₃Fe(CN)₆ и 1 мл раствора NaOH), тщательно перемешивают и оставляют на три минуты. Затем прибавляют 5 мл изобутилового спирта, энергично и равномерно встряхивают в течение 2 мин. Изобутиловый экстракт тиохрома в ультрафиолетовых лучах имеет интенсивную синюю флюоресценцию. Это очень чувствительная специфическая реакция.

6.2 Лабораторная работа «Реакция восстановления рибофлавина (витамина В₂)»

Образующийся при добавлении металлического цинка к концентрированной соляной кислоте водород восстанавливает желтый рибофлавин сначала в родофлавин (промежуточное соединение) красного цвета, а затем в бесцветный лейкофлавин:

Материалы и реактивы: концентрированная HCl; металлический цинк; 0,025 %-ный раствор витамина B₂ (эмульсия рибофлавина в воде).

Оборудование: пробирки, пипетки.

Ход работы. В пробирку приливают 1 мл раствора витамина В₂, 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и опускают кусочек металлического цинка. Выделяющийся водород реагирует с рибофлавином, восстанавливая его, и жидкость постепенно окрашивается в розовый цвет, а затем обесцвечивается. При взбалтывании обесцвеченного раствора лейкофлавин вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин.

6.3 Лабораторная работа «Реакция на пиридоксин (витамин В₆) с хлоридом железа (III)»

При взаимодействии пиридоксина с раствором хлорида железа жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образования комплексной соли типа фенолята железа.

Материалы и реактивы: водный 1 %-ный раствор витамина В₆; 1 %-ный раствор FeCl₃.

Оборудование: пробирки, пипетки.

Ход работы. В пробирке смешивают 1 мл водного раствора пиридоксина и 2 капли раствора хлорида железа. Смесь встряхивают. Наблюдают окрашивание жидкости в красный цвет.

6.4 Лабораторная работа «Выделение фолиевой кислоты из дрожжей и ее обнаружение»

Фолиевая кислота хорошо растворима в 0,1 моль/л растворе NaOH. При экстрагировании фолиевой кислоты из дрожжей и ультрафиолетовом облучении наблюдается ее интенсивная голубая флюоресценция.

Материалы и реактивы: дрожжи пищевые; ледяная уксусная кислота; 0,4 %-ный раствор перманганата калия; 3 %-ный раствор пероксида водорода; 0,1 моль/л и 0,005 моль/л растворы гидроксида натрия; индикаторная бумага; кварцевый песок.

Оборудование: центрифуга, флюороскоп, центрифужные пробирки, ступка с пестиком, пипетки.

Ход работы. В ступку помещают 10 г дрожжей, прибавляют 10 мл 0,1 моль/л раствора NaOH, 2 г кварцевого песка и растирают в течение 5 мин. Затем центрифугируют в течение 15 мин при скорости 800 об/мин.

К 10 каплям надосадочной жидкости приливают 20 капель ледяной уксусной кислоты (pH=3,0) и 10 капель раствора KMnO₄ так, чтобы розовая окраска не исчезала в течение 10 мин (при её исчезновении следует прилить ещё несколько капель KMnO₄). Через 10 мин избыток перманганата калия удаляют путем добавления 45 капель раствора H₂O₂ и приливают 0,005 моль/л раствора NaOH (около 5 мл) до pH 4,04,5 (в присутствии индикатора).

При ультрафиолетовом облучении фолиевой кислоты в щелочном растворе в флюороскопе наблюдается интенсивная голубая флюоресценция.

6.5 Реакции на аскорбиновую кислоту (витамин С)

Лабораторная работа «Качественные реакции на витамин С»

Аскорбиновая кислота способна легко вступать в окислительно-восстановительные реакции и восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндо-фенол, гексоциано-(III)-феррат калия, нитрат серебра, метиленовый синий. При этом окисленные формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (синий цвет) и метиленового синего восстанавливаются в бесцветные лейкосоединения, а K₃Fe(CN)₆ восстанавливается до K₄Fe(CN)₆, который с ионами валентного железа дает соль Fe[Fe(CN)₆]₃ синего или зеленого цвета. Реакция восстановления метиленового синего происходит по уравнению:

Материалы и реактивы: 0,1 %-ный раствор 2,6-дихлорфенол-индофенола; 10 %-ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,01 %-ный раствор метиленового синего; 10 %-ный раствор Na₂CO₃; 1 %-ный раствор K₃Fe(CN)₆; 1 %-ный раствор FeCl₃.

Оборудование: штатив с пробирками, капельницы, пипетки, термостат.

Ход работы. Для проведения реакции с 2,6-дихлорфенолиндофе-нолом в пробирку вносят 0,5 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, 12 капли раствора HCl и каплями раствор аскорбиновой кислоты. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола обесцвечивается.

Для проведения реакции с метиленовым синим в две пробирки вносят по одной капле раствора метиленовой сини и по одной капле раствора бикарбоната натрия. В первую вливают пять капель раствора аскорбиновой кислоты, во вторую - пять капель воды и ставят обе пробирки в термостат при температуре от 37 до 40 °С. Через некоторое время в пробирке с раствором аскорбиновой кислоты жидкость обесцвечивается.

Для реакции с гексациано-(III)-ферратом калия к 1 мл раствора аскорбиновой кислоты прибавляют 1 мл раствора K₃Fe(CN)₆ и 0,5 мл раствора FeCl₃. Наблюдают образование сине-зеленого окрашивания.

Лабораторная работа «Количественное определение витамина С по Тильмансу»

Метод количественного определения аскорбиновой кислоты основан на ее способности окисляться 2,6-дихлорфенолиндофенолом до дегидроаскорбиновой кислоты. По количеству 2,6-дихлорфенол-индофенола, затраченного на титрование, определяют количество аскорбиновой кислоты в исследуемом материале. Как только все количество витамина С окислится, титруемый раствор приобретает розовую окраску за счет образования недиссоциированных молекул 2,6-дихлор-фенолиндофенола (в кислой среде). В щелочной среде 2,6-дихлор-фенолиндофенол имеет синюю окраску, в кислой - красную, а при восстановлении обесцвечивается:



Материалы и реактивы: соляная кислота (2 %-ный раствор); натриевая соль 2,6-дихлорфенолиндофенола 0,0005 моль/л раствор (молекулярная масса - 290, грамм-эквивалент - 145).

Оборудование: растительные продукты (капуста, хвоя, картофель, шиповник), фарфоровая ступка с пестиком, коническая колба, микробюретка, стаканы для титрования, пипетки, воронки, весы с разновесами, стеклянный песок.

Ход работы. Взвешивают 1 г растительного продукта, тщательно растирают в фарфоровой ступке со стеклянным песком. К растертой массе прибавляют 9 мл раствора соляной кислоты и отстаивают. Через 10 мин содержимое перемешивают и фильтруют. Для количественного определения берут 3 мл фильтрата, помещают в коническую колбу и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 секунд; 1 мл 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты.

Массовую концентрацию аскорбиновой кислоты (мг) рассчитывают по формуле

,

где Q - количество аскорбиновой кислоты (0,088 мг), соответствующее 1 мл 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола;

А - количество 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндо-фенола, затраченного на титрование, мл;

V₀ - общее количество экстракта, мл;

V₁ - объем экстракта, взятый для титрования, мл;

а - количество пищевого продукта, мг.

7. Нуклеиновые кислоты

Нуклеиновые кислоты - это макромолекулы кислотного характера, содержащиеся в ядре, а так же в митохондриях, хлоропластах и цитоплазме, состоят из нуклеотидов.

В живых организмах присутствуют два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Их биологическая функция заключается в хранении и передаче наследственной информации живых организмов. Наследственная информация (наследственные признаки) определяет вид, форму, химический состав и функции живой клетки и всего организма в целом.

Мономеры нуклеиновых кислот - нуклеотиды, принимают участие во множестве биохимических процессов. Наиболее известна роль пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в качестве мономеров-предшественников при биосинтезе РНК и ДНК. Помимо этого пуриновые рибонуклеотиды выполняют функции универсальных источников энергии (например, АТФ), входят в состав коферментов (ФАД, НАД, НАДФ). Пиримидиновые нуклеотиды входят в состав макроэргов углеводного обмена (Приложения ПУ).

7.1 Лабораторная работа «Обнаружение пуриновых оснований в составе нуклеопротеидов»

Метод основан на образовании комплексов пуриновых оснований с солями серебра.

Материалы и реактивы: концентрированный раствор аммиака; 1 %-ный раствор АgNО₃; дрожжи (в круглодонную колбу для гидролиза помещают 1 г пекарских дрожжей, доливают 20 мл 10 %-ного раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды, колбу закрывают пробкой, в которую вставлена в качестве холодильника стеклянная трубка длиной от 20 до 30 см, кипятят под тягой в течение 1 ч на асбестовой сетке при слабом нагревании, после окончания гидролиза жидкость охлаждают, доводят водой до первоначального объема и фильтруют).

Оборудование: колба, пипетки, пробирки, воронки, стеклянная трубка длиной от 25 до 30 см, газовая горелка.

Ход работы. К 1 мл гидролизата добавляют концентрированный раствор аммиака до получения щелочной среды (по лакмусу) и 0,5 мл раствора АgNО₃. Через 3…5 мин образуется рыхлый осадок серебряных солей пуриновых оснований.

7.2 Лабораторная работа «Обнаружение белков в составе нуклеопротеидов»

Для подтверждения наличия белков в составе нуклеопротеидов проводят биуретовую реакцию. Эта реакция характерна для соединений, содержащих не менее двух пептидных связей. Такие полимеры (белки) в щелочной среде образуют с сульфатом меди окрашенные комплексные соединения, цвет которых зависит от длины полипептидной цепи. Раствор нативного белка дает сине-фиолетовое окрашивание, а продукты его гидролиза (пептиды) - красно-фиолетовое.

Материалы и реактивы: гидролизат нуклеопротеидов дрожжей; 10 %-ный раствор гидроксида натрия; 1 %-ный раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки, пипетки, капельница.

Ход работы. В пробирку вносят 0,5 мл гидролизата дрожжей, нейтрализуют (по лакмусу) раствором NaОН, затем добавляют 0,5 мл раствора NаОН и 23 капли раствора СuSО₄. Смесь перемешивают и наблюдают появление окраски, что свидетельствует о присутствии в пробе полипептидов, образующихся в результате гидролиза белковой части нуклеопротеидов.

8. Содержание лабораторного практикума по биохимии

Лабораторная работа № 1 (4 часа). «Техника безопасности, правила работы в биохимической лаборатории, методы определения рН среды». Правила безопасной работы в химической лаборатории, организация лаборатории, правила пользования электрооборудовани-ем, приборами. Электрометрическое определение рН. Индикаторный метод измерения рН.

Лабораторная работа № 2 (4 часа). «Углеводы и их обмен». Структура, свойства и функции углеводов в организме. Количественное определение углеводов в растворах (методом Бертрана, методом ХангендорнаИенсена и др.).

Лабораторная работа № 3 (4 часа). «АМИНОКИСЛОТЫ, ПЕПТИДЫ, БЕЛКИ И ИХ ОБМЕН». Физико-химические свойства белков (высаливание, осаждение сернокислым аммонием, хлористым натрием, сернокислым магнием, органическими кислотами, этиловым спиртом, ацетоном). Количественное определение белка в растворе методом Матиопуло, формольным титрованием, методом Лоури. Количественное определение смеси аминокислот в растворе по Сьоренсону.

Лабораторная работа № 4 (4 часа). «Ферменты». Изучение действия ферментов. Свойства ферментов. Определение активности ферментов (каталазы, пероксидазы, амилазы, протеазы) в солоде ржи, проса, ячменя, овса, пшеницы, в молоке, в дрожжевой воде. Влияние рН и температуры на активность ферментов.

Лабораторная работа № 5 (4 часа). «Липиды и их обмен». Омыление жира и образование свободных жирных кислот. Определение числа омыления липидов (касторовое масло, подсолнечное масло, сливочное масло). Определение кислотного числа жира. Определение эфирного, йодного, перекисного чисел жира.

Лабораторная работа № 6 (4 часа). «Витамины». Качественные реакции на витамины А, Е, К, D. Реакция с диазореактивом на тиамин (В₁), реакция восстановления рибофлавина (В₂), реакция на пиридоксин (В₆), определение содержания фолиевой кислоты в дрожжевом экстракте. Количественное определение витамина С в морсах и соках.

Лабораторная работа № 7 (4 часа). «Нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды». Выделение нуклеопротеидов. Обнаружение углеводов, пуриновых оснований, фосфорной кислоты, белков в составе нуклеопротеидов.

Лабораторная работа №8 (4 часа). Защита выполненных лабораторных работ.

Литература

1. Кучеренко, Н.Е. Биохимия: практикум / Н.Е. Кучеренко [и др.]. - К.: Высшая школа, 1988. - 128 с.

2. ГОСТ 7.32-2001 СИБИД. Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления.

3. ГОСТ 8.417-20002 ГСИ. Единицы физических величин.

4. Равич-Щербо, М.И. Физическая и коллоидная химия / М.И. Равич-Щербо, В.В. Новиков. - М.: Высшая школа, 1975. - 255 с.

5. Кушманова, О.Д. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии / О.Д. Кушманова, Г.М. Ивченко. - М.: Медицина, 1983. - 272 с.

6. Ленинджер, А. Биохимия / А. Ленинджер. - М.: Мир, 1974. - 957 с.

7. Методы практической биохимии // Под редакцией Б. Уильямс, К. Уилсон. - М.: Мир, 1978. - 268 с.

8. Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. - М.: Медицина, 1982. - 752 с.

9. Аверьянова, Е.В. Крахмал: методические указания по курсу «Методы переработки растительного сырья» / Е.В. Аверьянова, В.П. Севодин. - Бийск: Изд-во АлтГТУ, 1999. - 33 с.

10. Викторов, Д.П. Малый практикум по физиологии растений / Д.П. Викторов. - М: Высшая школа, 1983. - 120 с.

11. Гильманов, А.П. Методы очистки и изучения ферментов растений / А.П. Гильманов, О.В. Фурсов, А.П. Францев. - Алма-Ата: Наука, 1981. - 84 с.

12. Кошелев, Ю.А. Витамины: методические указания к лабораторному практикуму по курсам «Биохимия», «Пищевая химия» / Ю.А. Кошелев, М.Э. Ламберова. - Бийск: Изд-во АлтГТУ, 2005. - 56 с.

13. Мезенцева, Н.И. Определение активности оксидоредуктаз растений, экстрагируемых различными буферами / Н.И. Мезенцева // И.Л. КазГос ИНТИ ВК ЦНТИ. № 2, 1995. - 4 с.

14. Мезенцева, Н.И. Применение электрофореза белков / Н.И. Мезенцева, С.В. Лаптев, И.В. Рогова // И.Л. КазГос ИНТИ ВК ЦНТИ. № 1, 2000. - 4 с.

15. Мезенцева, Н.И. Биохимия: методические указания к изучению дисциплины и выполнению контрольных работ для студентов всех форм обучения / Н.И. Мезенцева, Е.В. Аверьянова, С.В. Лаптев. - Бийск: Изд-во АлтГТУ, 2006. - 96 с.

16. Пустовалова, Л.М. Практикум по биохимии / Л.М. Пустовалова. - Ростов-н/Д: Феникс, 1999. - 544 с.

17. Рухлядева, А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов / А.П. Рухлядева, Г.В. Полыгалина. - М: Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 287 с.

18. Савронь, Е.С. Практикум по биохимии животных / Е.С. Савронь, В.И. Воронянский. - М.: Высшая школа, 1967. - 239 с.

19. Северин С.Е. Практикум по биохимии / С.Е. Северин, Г.А. Соловьев. - М: Изд-во МГУ, 1989. - 509 с.

20. Третьяков, Н.Н. Практикум по физиологии растений / Н.Н. Третьяков, Т.В. Карнаухова, Л.А. Паничкин. - М: Агропромиздат, 1990. - 271 с.

21. Филиппович, Ю.Б. Практикум по общей биохимии / Ю.Б. Филиппович, Т.В. Бурова, Г.А. Севастьянова. - М: Изд-во МГУ, 1982. - 78 с.

22. Практикум по биохимии / под редакцией В.П. Комова. - М.: Дрофа, 2004. - 215 с.

23. Сельскохозяйственная биотехнология / под редакцией В.С. Шевелухи. - М.: Высшая школа, 1998. - 415 с.

24. Суханова, Г.А. Биохимия клетки / Г.А. Суханова, В.Ю. Серебров. - Томск: Изд-во ТГУ, 2000. - 184 с.

25. Лаптева, Т.А. Основы физколлоидной химии: учебно-методическое пособие для студентов факультета ветеринарной медицины / Т.А. Лаптева. - Томск: Изд-во ТСХИ, 2006. - 38 с.

26. Коряжнов, В.П., Макаров В.А. Практикум по ветеринарно-санитарной экспертизе молока и молочных продуктов / В.П. Коряжнов, В.А. Макаров. - М.: Колос, 1981. - 170 с.

27. Лаптев, С.В. Лабораторный практикум по ветеринарно-санитарной экспертизе с основами технологии и стандартизации продуктов / С.В. Лаптев, Н.И. Мезенцева. Томск: Изд-во ТСХИ, 2008. 146 с.

Приложение А

Классификация моносахаридов

Приложение Б

Дисахариды

Приложение В

Глюконеогенез

Приложение Г

Схема потока метаболитов пентозофосфатного пути и их связи с гликолизом

Приложение Д

Взаимопревращение питательных веществ

Приложение Е

Классификация аминокислот, основанная на полярности и заряде R-групп

Приложение Ж

Элементы вторичной структуры белков: а -спираль; б -слой

Приложение И

Некоторые -аминокислоты, не входящие в состав белков, но играющие важную роль в метаболизме

Приложение К

Цикл мочевины (орнитиновый цикл)

Приложение Л

-Окисление жирных кислот

Приложение М

Биосинтез жирных кислот

Приложение Н

Коферменты

Приложение П

Нуклеотиды РНК и ДНК

Приложение Р

Распад пуринов

Приложение С

Распад пиримидинов

Приложение Т

Структура ДНК

Приложение У

Структура тРНК

Размещено на Allbest.ru

...