Размещено на http://www.allbest.ru/

8

Содержание

• 1. Характеристика ферментов класса оксидоредуктаз 3
• Флавиновые ферменты, строение, роль 4
• Убихинон, строение и роль 5
• Цитохромы, представители, строение и роль 5
• Каталаза, пероксидаза - строение и роль 7
• Оксигеназы - строение и роль 7
• 2. Кинетика роста культуры микроорганизмов в жидкой питательной среде 9
• 3. Иммобилизованные ферменты и их применение в пищевых технологиях 10
• Заключение 17
• Список литературы 18


1. Характеристика ферментов класса оксидоредуктаз

Это большой класс ферментов, которые катализируют окислительно-восстановительные реакции (реакции отщепления или присоединения водорода или электронов). По химической природе двухкомпонентны. Различают около 90 подклассов. Для удобства изложения и усвоения этого материала ОР-азы можно разделить на 4 группы:

1) ДГ-азы

2) цитохромы

3) каталаза и пероксидаза

4) гидрооксилазы и оксигеназы

К дегидрогеназам относятся ферменты, осуществляющие окисление веществ путем их дегидрирования (отнятия водорода), участвуя в БО и восстановлении, т.е. в реакциях, связанных с процессами тканевого дыхания, гликолиза, брожения. Известно свыше 150 ДГ-аз.

Пиридиновые ферменты, строение, роль ПФ -- это двухкомпонентные ферменты, коферментом которых явялются НАД или НАДФ. Действующей группой кофермента этих ферментов является кольцо пиридина. Связь между апоферментом и коферментом осуществляется с помощью цинка, связь непрочная, поэтому в клетке имеются как целые, так и диссоциированные молекулы. НАД - никотинамидадениндинуклеотид - состоит из АМФ, Н3РО4, рибозы, НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, отличается от НАД наличием в своей молекуле еще одного остатка фосфорной кислоты, присоединенной ко второму положению в рибозе. НАД и НАДФ - коферменты первичных ДГ-аз. Роль вещества, отнимающего водороды выполняет никотинамид, остальная часть НАДа стабилизирует молекулу. Один водород присоединяется к 6-ому углероду, а второй расщепляется до протона и электрона, электрон присоединяется к азоту, при этом у него нейтрализуется заряд, а протон остается в растворе. В кольце никотинамида меняется количество и расположение двойных связей. Окисленная форма НАД прочно удерживает апофермент, а восстановленная связь с ним теряет - показать на доске формулами

НАД-зависимые ПФ содержатся в больших количествах в митохондриях и участвуют в окислении субстратов путем дегидрирования. НАДФ-зависимые ПФ играют роль в синтетических реакциях, содержатся, в основном, в цитоплазме - в биологическом окислении не участвуют. Восстановленные НАДФН2, следовательно, служат источником энергии и водородов. НАДН2 передают водороды к флавиновым ферментам, окисляясь при этом, а ФП при этом восстанавливаются. Показать на доске схематично.

Флавиновые ферменты, строение, роль

Это двухкомпонентные ферменты, в состав кофермента входит витамин В2 - рибофлавин, который состоит из диметилизоаллоксазина и спирта рибитола. Кофермент ФП бывает 2 видов - ФМН и ФАД. Показать на табл, формулы знать см. материалы стр. 64. Связь между апо- и коферментом в отличие от ПФ прочная. На один апофермент приходится несколько коферментов. В некоторых ФП имеются негемовое железо, молибден, медь. Действующей частью кофермента является кольцо изоаллоксазина. В окисленной форме ФП имеет желтый цвет (лат. Flavus - желтый), отсюда название. Восстановленная форма ФП бесцветная.

Рациональное название ФМН - рибофлавинфосфорная кислота, т.е. содержит рибофлавин и фосфорную кислоту. ФАД - флавинадениндинуклеотид - отличается от ФМН наличием АМФ. ФП с коферментом ФМН являются вторичными ДГ-азами, т.к. они окисляют восстановленные ферменты, в частности НАДН2. Показать на доске формулой окисление НАДН2 с помощью ФМН.

ФП с коферментом ФАД называются первичными ДГ-азами, т.к. они окисляют непосредственно субстраты, например, СДГ окисляет сукцинат. Основная масса ФПН2 окисляется КоQ показать на доске на предыдущей реакции обратную стрелку.

Некоторые ФП, например, ксантиноксидаза, МАО, ДАО и др., могут окисляться молекулярным кислородом, т.е. обладают свойством аутооксидабельности (самоокисления). Показать на доске.

Т.о., ФП делятся на три группы: первая и вторая по коферменту, а третья по способности окисления.

Убихинон, строение и роль

Называется коферментом в связи с тем, что апофермент не найден. Название убихинон от англ. “вездесущий хинон”, т.к. найден во всех клетках. По химической природе - это четырехзамещенный бензохинон, соединенный с изопреноидными остатками (у человека 10), которые придают КоQ липофильность.

Убихинон функционирует в цепи биологического окисления, свободно перемещаясь в липидной фазе мембран как в окисленной, так и в восстановленной форме. КоQ является более сильным окислителем, чем ФП, поэтому способен окислять ФПН2, при этом сам восстанавливается. Витамины Е и К также участвуют в этом процессе. Показать на формулами реакции восстановления КоQ.

КоQН2 окисляется особым образом, без участия ферментов. При этом водороды распадаются до протонов и электронов, протоны используются для образования эндогенной воды, а электроны передаются в цепь цитохромов - показать на доске на предыдущей реакции обратную стрелку. Кроме участия в БО убихинон обладает антиоксидантной активностью, особенно выраженной при нехватке витЕ (антиоксидантного витамина). АО роль убихинона заключается в отдаче подвижного водорода свободному радикалу.

Цитохромы, представители, строение и роль

Цитохромы -- двухкомпонентные ферменты, относящиеся к гемсодержащим ХП, т.е. кофермент всех Цх представлен гемом. Основная биологическая функция цх - перенос электронов по цепи БО к молекулярному кислороду. Открыто около 20 цх, которые отличаются спектрами поглощения, по химической природе гема и сродству к молекулярному кислороду. Цх делятся на 4 группы в зависимости от природы входящего в них гема. Ферменты одной группы содержат одинаковые коферменты, но разные апоферменты. 5-ая и 6-ая координационные связи железа соединены с остатками гистидина и метионина (в ЦхС обе винильные группы также связаны с остатками цистеина). Железо, входящее в гемы цх может иметь степень окисления 2+ и 3+, например, показать на доске.

Цх служат переносчиками электронов в цепи БО, при этом последовательность цх в этой цепи следующая - показать на доске.

Представители 1. Цхb имеет гем, идентичный гему Нb и Mgb, формулу знать см. материалы стр. 66, показать на табл. или пленке Биологическая роль цхb заключается в том, что он получает электроны от восстановленной формы КоQ, при этом КоQ окисляется, а цхb восстанавливается. 2. ЦхС (с1 и с) имеют одинаковые гемы, разные апоферменты. Гем имеет рац. название - 1,3,5,8 тетраметил 2,4 диэтил 6,7дипропионовокислый железопорфин формулу знать см. материалы стр. 66, показать на табл. Ферроформа цхс1 передает электроны цхс, который восстанавливается, а цхс1 окисляется 3. Цха и цха3 - имеют одинаковые коферменты, но разные апоферменты. Гем имеет следующее строение - в 1,3,5-триметил-2-радикал-4-винил-8-формил-6,7-дипропионовокислый железопорфин формулу знать, см. материалы, стр. 66. Цха и а3 связаны в один комплекс - цитохромоксидазу. Это крупная молекула с большим молекулярным весом, состоит из 2 молекул цха, 4-х молекул цха3 и 6 атомов меди. Медь в ЦХО переменной валентности и может служить источником электронов. Восстановленный цхс передает электроны цха, при этом окисляясь, цха восстанавливается, а цха3 окисляет ферроформу цха и передает электроны молекулярному кислороду.

Каталаза, пероксидаза - строение и роль

Каталаза и пероксидаза не имеют прямого отношения к окислительно-восстановительным реакциям, способствуют распаду перекиси водорода, образованной при окислении. По строению эти ферменты двухкомпонентны. Коферментом является гем, идентичный гему Hb, но железо имеет степень окисления 3+.

Пероксидаза содержит один гем. Пероксидазы распространены, в основном, в растительном мире, но встречаются и в животных организмах, например, миелопероксидаза в лейкоцитах, лактатпероксидаза в молоке и т.д. Слабым пероксидазным свойством обладает Hb, на этом основана качественная реакция на него (бензидиновая проба). Пероксидазы ускоряет распад перекиси водорода до воды и атомарного кислорода, который является сильным окислителем. Эти ферменты участвуют в окислении ароматических соединений. Показать на доске

Каталаза содержит 4 гема. Разлагает перекись водорода до воды и молекулярного кислорода. Показать на доске

Присутствие каталазы обеспечивает защиту клеточных структур от действия перекиси водорода, образованной при пероксидазном типе окисления.

Оксигеназы - строение и роль

Оксигеназы можно условно разделить на моноооксигеназы и диоксигеназы. Они играют важную роль в обмене стероидов и других циклических соединений.

Монооксигеназы ускоряют окисление субстратов путем включения в них одного атома кислорода, при этом образуются гидроксилированные продукты или соединения типа SO. Монооксигеназы, которые ускоряют гидроксилирование субстратов, называются гидроксилазы. Гидрооксилазы двухкомпонентные ферменты, в состав кофермента пирролохинолинохинон (PQQ) и витамин Сформулу витамина С знать см. стр. 78 по материалам. Гидроксилазы способствуют включению кислорода в молекулу субстрата и образованию Н2О. Донатором водорода является НАДФН2, например, схематично показать на доске гидроксилирование фен и про, повторить формулы этих аминокислот

Гидроксилазы также участвуют в образовании холестерина и адреналина. Эти ферменты содержатся в цитоплазме, в мембранах ЭПР, митохондрий и микросом. оксидоредуктазы фермент кинетический

Монооксигеназы, которые окисляют субстраты и приводят к образованию продуктов типа SО, относятся к микросомальным оксигеназам, например, цитохромы Р450 (кофермент гем). Эти ферменты играют роль в обезвреживании чужеродных веществ, например, лекарств, а также в метаболизме некоторых эндогенных веществ, например половых гормонов, ПРГ.

Диоксигеназы -- двухкомпонентные ферменты, в состав кофермента также входят пирролохинолинохинон и витамин С. Они способствуют включению молекулы О2 в вещество, вызывая окислительное расщепление кратной (например, двойной) связи. Это имеет место при окислении ПНЖК, в результате этого образуются диоксиды (пероксиды) ненасыщенной жирной кислоты; окисление триптофана под действием триптофандиоксигеназы приводит к образованию формилкинуренина, окисление цистеина под действием цистеиндиоксигеназы приводит к образованию цистеинфульфината.

2. Кинетика роста культуры микроорганизмов в жидкой питательной среде

Кинетические кривые роста микроорганизмов в закрытых системах (периодическое культивирование) имеют сложный характер. Выделяют несколько фаз в развитии культуры.

После введения инокулята обычно наблюдают индукционный период (лаг-фазу), в течение которого не происходит сколько-нибудь заметного увеличения числа клеток или образования каких-либо продуктов. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, специфичные к использованию новых субстратов, активируется биосинтез белка.

Индукционный период сменяется фазой экспоненциального роста, в течение которой быстро накапливаются биомасса и продукты разных реакций. Эта фаза достаточно строго описывается экспоненциальной кривой.

В замкнутой системе экспоненциальная фаза роста не может развиваться неограниченно. Как правило, она переходит в фазу линейного роста, характеризующуюся равномерным во времени линейным ростом культуры, имеет место отклонение от точек в сторону меньших значений количества клеток или продуктов, что служит экспериментальным критерием перехода культуры в линейную фазу роста.

Фаза линейного роста может смениться весьма непродолжительным периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля. Это фаза замедления роста.

В некоторых случаях рост культуры может переходить в достаточно устойчивую по продолжительности стационарную фазу. В этих условиях культура развивается в режиме постоянства общего числа клеток. Режим характеризуется достаточно высокими скоростями отмирания клеток. При этом скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток.

3. Иммобилизованные ферменты и их применение в пищевых технологиях

Методы иммобилизации универсальны для всех видов иммобилизованных биокатализаторов - индивидуальных ферментов, клеток, субклеточных структур, комбинированных препаратов.

Для иммобилизации используются такие ферменты как: Е. Coli, Kluyvervmyces fragilis, К lactis, Aspergillus niger, A oryzae, B. Subtilis, B.licheniformis, B. Thermoproteolyticus, Mucor pusillus.

Наряду с иммобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяется иммобилизации клеток и субклеточных структур: Mucobacterium globiformis, Arthrobacter, Aureobacidium pullulan, Bacillus thermoproteoluticus, Erwinia herbicola, Е. Intermedia, Е. Coli. Это объясняется тем, что при использовании иммобилизованных клеток отпадает необходимость выделения и очистки ферментных препаратов, применение кофакторов; создается возможность получения полиферментных систем, осуществляющих многостадийные непрерывно действующие процессы.

В промышленных процессах чаще используют покоящиеся клетки. Для подавления роста иммобилизованных клеток растений используют дефицит фитогормонов, а рост клетки бактерий тормозят добавлением антибиотиков.

Идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособную форму).

Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечисленным требованиям. Тем не менее, существует широкий набор носителей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

В зависимости от природы носители делятся на органические и неорганические материалы.

Сочетание уникальных каталитических свойств энзимов с преимуществами иммобилизованных ферментов как гетерогенных катализаторов позволило создать новые промышленные технологические процессы. Следует отметить, что все они относятся к производству пищевых продуктов и лекарственных препаратов.

В настоящее время в мире разработаны следующие крупномасштабные производства с использованием иммобилизованных ферментов и клеток:

Получение глюкозофруктозных сиропов.

Получение оптически активных L-аминокислот из их рацемических смесей.

Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония.

Синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты.

Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты.

Получение безлактозного молока.

Получение Сахаров из молочной сыворотки.

Получение 6-аминопенициллановой кислоты.

В качестве примера рассмотрим некоторые из них.

Получение глюкозофруктозных сиропов.

Фруктоза (фруктовый, плодовый или медовый сахар) - важнейший в физиологическом и технологическом отношении природный моносахарид. Превращаясь в печени и кишечнике млекопитающих в глюкозу, фруктоза включается в пластический и энергетический обмен клетки. Она в 2,5 раза слаще глюкозы и в 1,7 раза слаще тростникового сахара (сахароза), благодаря чему фруктоза - менее калорийный пищевой продукт по сравнению с последними. В отличие от глюкозы обмен фруктозы не контролируется инсулином, поэтому фруктовый сахар может потребляться больными диабетом. Фруктоза практически не вызывает кариеса зубов. В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется, поэтому широко используется для производства кондитерских изделий.

Объем производства сахарозы за последние 100 лет возрос в 15 раз и составляет, по разным оценкам, 30 - 40 кг в год на человека. Однако, несмотря на явные преимущества использования фруктозы, первая промышленная установка для превращения глюкозы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы была запущена лишь в 1973 г. (компания «Клинтон Корн», США). Исходным сырьем для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала в присутствии минеральных кислот. Для конструирования промышленного биокатализатора глюкозоизомеразу сорбируют на пористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Во многих случаях используют иммобилизованные клетки разного происхождения (Aspergillus niger, A. oryzae, Streptomyces phaeochrmogenes, S. olivaceus, S. venezuelae). Коммерческие препараты иммобилизованной глюкоизомеразы имеют вид гранул, шариков, волокон или аморфной массы. Наиболее эффективными биореакторами для получения фруктозы признаны аппараты колонного типа высотой около 5 м, в которых по сравнению с реакторами перемешивания расход фермента минимален.

Производительность такого реактора варьирует от 600 до 9000 кг глюкозофруктозного сиропа на 1 кг иммобилизованного фермента в зависимости от чистоты исходного сырья, а время полуинактивации катализатора - 20-50 суток. Возникающий в результате, каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42 -45% фруктозы, около 51 % глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы. Эти смеси постепенно вытесняют инвертиро ванный сахар в промышленности и медицине. Глюкозофруктозную смесь широко применяют для производства тонизирующих напитков, консервированных фруктов, кондитерских изделий, хлеба, мороженого и пр. Экономические расчеты показали, что производство глюкозофруктозных сиропов с использованием иммобилизованной глюкоизомеразы в 1,5 раза выгоднее получения сахарозы из сахарной свеклы по традиционной технологии. Благодаря этому обстоятельству производство глюкозофруктозных сиропов в мире постоянно растет. Так, в 1980 г. 10 % потребляемого населением Японии сахара заменено на глюкозофруктозную смесь. В США эта доля к началу нового столетия достигла 40 %.

Получение L-аспарагиновой кислоты.

Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель и подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из получаемого химическим путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. в Японии (фирма «Танабе Сейяку»); в ней использованы иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки кишечной палочки Е. coli, содержащие аспартат-аммиак-лиазу:

НООС - СН = СН - СООNH4 Аспарат-NH3 -лиаза НООС - СН2 - СН - СООН NH2

Полиакриламидный гель с иммобилизованными микробными клетками формуют в виде кубиков размером 2 - 3 мм, которыми заполняют колонку объемом 1 м3. Через колонку пропускают раствор фумарата аммония.

При подкислении выходящего из колонки элюата до рН 2,8 и охлаждении до 15 °С из него выкристаллизовывается аспарагиновая кислота в виде препарата 100%-й чистоты. Процесс получения аспартата полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Производительность процесса - 1700 кг чистой аспарагиновой кислоты в сутки на реактор. Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраняют активность фермента на 80 % в течение 120 дней и на 50 % в течение 600 дней работы реактора, в то время как свободные клетки - всего на протяжении 10 дней с уровнем активности 25 % от исходной.

Получение L-аланина.

В настоящее время основной промышленный способ получения L-аланина - ферментативное декарбоксилирование L-аспарагиновой кислоты:

Аспарат-в-декар-боксилаза

НООС - СН2 - СН - СООН H3C - CH - COOH + CO2 NH2 NH2

Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется аспартат-р-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), иммобилизованных в полиакриламидном геле, каррагинане или полиуретане. Разработанная установка производит этим способом 10 т аланина в месяц. Усовершенствование процесса связано с использованием в качестве сырья фумарата аммония. В данном случае процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в двух последовательно расположенных реакционных колонках. На первом этапе фумаратаммония превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной среды на втором этапе претерпевает в-декарбоксилирование с образованием аланина.

С помощью иммобилизованных клеток Serratia marcescens из треонина и глюкозы синтезируют L-изолейцин, а с помощью иммобилизованных клеток Corynebacterium glutamicum - L-глутаминовую кислоту из L-глюкозы; L-триптофан - из индола; L-орнитин - из L-аргинина. Таким образом, расширение производства аминокислот стало возможным благодаря изменению технологии получения промышленных биокатализаторов и снижению затрат при их производстве.

Получение L-яблочной кислоты.

Яблочная кислота - заменитель лимонной в продуктах питания и лекарственных препаратах.

Яблочную кислоту получают, используя иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки, содержащие фумаратгидратазу. В присутствии этого фермента происходит присоединение воды по двойной связи в молекуле фумаровой кислоты:

Фумарат-гилратаза

НООС - СН = СН - СООН + НОН НООС - СН2 - СН - СООН ОН

В интактных клетках время полуинактивации фумаратгидратазы составляет 6 суток, в иммобилизованных в полиакриламидном геле - 55 суток, а в иммобилизованных в геле на основе каррагинана - 160 суток.

Заключение

Кинетическое моделирование, как всякий модельный подход, позволяет проанализировать различные возможные механизмы процесса при последовательном усложнении схемы процесса. Так, были рассмотрены простейшая схема, схема с равновесным «насыщением» клетки субстратом, схема с субстратом, необратимо трансформирующимся в клетке. Последние две схемы дают зависимость удельной скорости роста от концентрации субстрата типа уравнения Моно. Вообще можно записать бесчисленной число кинетических схем, решения которых приводят к зависимости удельной скорости роста от концентрации субстрата типа уравнения Моно или Михаэлиса - Ментен. Необходимым общим элементом всех этих схем является, по крайней мере, двухстадийность процесса. Т.о., уравнение Моно - отражение многостадийности трансформации субстрата, при этом первая стадия процесса является субстрат-зависимый, скорость второй стадии не зависит от концентрации субстрата.

Принципиально важным и полезным при анализе конкретных экспериментальных данных является использование кинетической модели, учитывающей «старение» клетки в процессе роста. Предполагается, что «старение» клеточного аппарата выражается в инактивации клеточных ферментных систем. Уравнения для удельной скорости роста функционально мало похоже на «классическое» уравнение Моно, однако графически весьма к нему близко. Важный вывод в системах со «старением» должны иметь место критические явления при низких концентрациях субстрата. Рост культуры может происходить только при концентрации субстрата выше критического порога. Указанием на то, что рост исследуемой культуры клеток протекает в рамках механизма, отражающего «старение» клеток в процессе роста, может служить не линейность зависимости скорости роста от концентрации субстрата в обратных координатах.

Список литературы

2. Сеитов З.С. «Биохимия», 2000 - С. 282-285, 302, 333.

3. Грачева И.М., Иванова Л.А. Биотехнология биологически активных веществ. - М., Издательство НПО «Элевар», 2006. - 453 с.

4. Гребенникова В.В. Биотехнология: сборник ситуационных задач с эталонами ответов. - Красноярск : тип. КрасГМУ, 2011. - 73 с.

5. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию. Курс лекций. - Мн.: БГУ, 2002. - 105 с.

6. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. - - М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 208 с.

7. Ермишин А.П. Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика. - Мн.: Тэхналогія, 2005. -430 с.

8. Ефимова М.В. Введение в прикладную биотехнологию. - Петропавловск-Камчатский: КамчатГТУ, 2004. - 95 с.

9. Катлинский А.В. Курс лекций по биотехнологии. - М.: Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова, 2005. - 152 с.

10. Коростелева Н.И., Громова Т.В., Жукова И.Г. Биотехнология. - Барнаул: АГАУ, 2006. - 127 с.

Размещено на http://www.allbest.ru/