Шляхи енергозабезпечення і детоксикації у метилотрофних дріжджів та їх скерована модифікація з метою створення нових ферментативних і біосенсорних аналітичних систем

Підсумовуючи вищесказане, можна зробити висновок, що закислення середовища при інкубації клітин дріжджів із формальдегідом зумовлено сумарною активністю специфічної глутатіонзалежної ФдДГ і неспецифічної АдДГ (метилотрофи) або активністю АдДГ (неметилотрофні дріжджі). Це служить, ймовірно, формою детоксикації формальдегіду і доповнює вже відомі шляхи забезпечення резистентності клітин дріжджів до формальдегіду. В стресових умовах початкового контакту клітин із метанолом (чи формальдегідом), коли ще не відбулась координована адаптація відповідних метаболічних шляхів, для клітин має першочергове значення зниження внутрішньоклітинного пулу дуже токсичного формальдегіду, що може досягатися шляхом неферментативного зв'язування CH₂O із глутатіоном, подальшим окисленням цього аддукту до мурашиної кислоти в формальдегіддегідрогеназній реакції, безпосереднім окисленням СН₂О за участю альдегіддегідрогенази, зворотнім відновленням формальдегіду до менш токсичного метанолу в формальдегідредуктазній реакції та включенням СН₂О в дигідроксиацетонсинтазний цикл. Вірогідно, що роль останнього циклу в детоксикації формальдегіду в умовах метанольного (або формальдегідного) стресу є незначною (інакше це не супроводжувалось би генерацією НСООН), і провідною стає послідовність реакцій прямого окислення формальдегіду. Утворювана мурашина кислота може окислюватись далі до вуглекислоти в форміатдегідрогеназній реакції або ж викидатись у позаклітинний простір шляхом активного транспорту. В енергетичному плані як NADH-утилізуюча формальдегідредуктазна реакція, так і АТР-залежна екструзія мурашиної кислоти є енергозатратними, що, вірогідно, відображає необхідність “оплати” енергетичною валютою життєво важливої для клітини функції детоксикації формальдегіду та форміату. Ймовірно, що саме енергозалежна детоксикація цих інтермедіатів метилотрофного обміну, поряд із енергетично невигідною алкогольоксидазною реакцією та позамітохондріальною генерацією NADH при подальшому окисленні формальдегіду, є причиною низького коефіцієнту вуглецевої конверсії при метилотрофному рості дріжджів - 0,47-0,50 [Dijken et al., 1981]. З іншого боку, фізіологічна роль системи екструзії НСООН полягає і в необхідності строго контролювати рН цитозолю в межах 7,0-7,4 в умовах активного окислення метанолу до порівняно сильної мурашиної кислоти. Ця обставина, ймовірно, особливо суттєва у випадку метилотрофних дріжджів, в яких цитозольна форміатдегідрогеназа має порівняно малоефективні кінетичні параметри по відношенню до форміату [Тишков и Егоров, 1985]. Як показали недавні теоретичні та експериментальні дослідження транспорту ацетату та лактату на клітинах E. coli [Axe and Bailey, 1995], екструзія обох кислот у позаклітинний простір, навіть при відмінних механізмах, приводить до розсіювання протон-рушійної сили, отже, є енергозатратними процесами.

Розробка нових методів визначення вмісту етанолу, метанолу і формальдегіду за допомогою алкогольоксидази та створення відповідних аналітичних наборів

Незважаючи на високий рівень синтезу АО в клітинах дикого типу, при продукції фермента для практичних цілей залишаються не розв'язаними до кінця дві основні проблеми: 1) отримання дешевих препаратів АО, повністю позбавлених каталазної активності, що особливо актуально при використанні пероксидгенеруючої здатності фермента; 2) забезпечення продуції АО на нетоксичному субстраті, наприклад, глюкозі, яка в нормі викликає катаболітну репресію синтезу АО.

Селекціонований нами мутантний штам H. polymorpha К-105 (gcr1 catX) об'єднав обидві корисні ознаки: порушення регуляції синтезу АО, яке призводить до конститутивного синтезу фермента на глюкозному середовищі, і повну відсутність каталазної активності. За оптимальних умов культивування і використання простої і економічної схеми виділення фермента (руйнування клітин і осадження АО сульфатом амонію при 60%-ному насиченні солі) [Гончар і співавтор., 1991], із 1 л культури можна отримати 1700-1800 од. АО з питомою активністю 7,5 од./мг білка і вартістю приблизно 6 дол. США за 1000 од. (для порівняння, комерційні препарати цього фермента, як правило, мають активність 10 од./мг білка і на порядок вищу ціну).

Ми розробили два нові, захищені авторськими свідоцтвами і патентом [Гончар и др., 1991а; 1991б; Гончар і співавтор., 1996], чутливі методи кількісного оксидазно-пероксидазного визначення різних субстратів-аналітів (наприклад, глюкози, етанолу) в присутності специфічних оксидаз і пероксидази хрону.

Основною відмінністю запропонованих методів від відомих аналогів є або нова комбінація речовин (суміш гваяколу з п-амінодиалкіланіліном), або оптимізація умов проведення реакції з використанням відомої хромогенної системи (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), а також використання АО із селекціонованого мікробного надпродуцента. На основі цих розробок створено аналітичні набори “ДІАГЛЮК”, “ДІАГЛЮК-2” і “АЛКОТЕСТ” для ферментативного визначення глюкози і етанолу в біологічних рідинах (цільній крові і сироватці людей, культурі мікроорганізмів та алкогольних напоях). Ці набори офіційно затверджені Фармакологічним комітетом МОЗ України і впроваджені у промислове виробництво (“ДІАГЛЮК”) або випускаються окремими партіями на замовлення наукових та практичних закладів (“ДІАГЛЮК-2” і “АЛКОТЕСТ”) на базі Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії НАН України [Гончар, 1998; 1999б].

Надійність аналізу етанолу за допомогою набору “АЛКОТЕСТ” перевіряли шляхом порівняння результатів визначення вмісту алкоголю в реальних пробах (цільна кров та сироватка 42 пацієнтів), отриманих за використання даного та двох референтних методів (алкогольдегідрогеназного - з використанням набору фірми “Sigma” та газо-рідинної хроматографії). Підтверджено достовірно високу кореляцію (p0,0001) між результатами всіх трьох методів (рис. 6) [Гончар, 1999а, 1999б].

Крім медичних цілей, набір “АЛКОТЕСТ” може бути використаний для контролю вмісту етанолу в пиві, винах та інших алкогольних напоях, а також для визначення етанолу в культурах при спиртовому бродінні та виробництві хлібопекарських дріжджів.

За відсутності етанолу в пробах, “АЛКОТЕСТ” із оксидазно-пероксидазною детекцією аналіту можна застосовувати і для кількісного визначення метанолу. Нами розроблено також варіант роздільного аналізу метанолу та етанолу при їх сумісній присутності, тестуючи продукти алкогольоксидазної реакції - формальдегід або ацетальдегід - за допомогою реакції із 4-аміно-5-гідразино-3-меркапто-1,2,4-тріазолу (“Пурпальд”), який із вказаними альдегідами утворює спектрально відмінні кольорові продукти [Avigad, 1983].

Слід відмітити, що розроблені аналітичні біотехнологічні продукти (або принципи їх створення) захищено авторськими свідоцтвами та патентом України, мають низьку ціну порівняно із зарубіжними аналогами і можуть мати широкий ринок споживання за умов подолання економічної кризи в Україні і збільшення платоспроможності клінічних, наркологічних, екологічно-контрольних та інших установ.

Розробка біосенсорних методів аналізу метанолу, етанолу та формальдегіду на основі клітин і алкогольоксидази метилотрофних дріжджів

При вивченні шляхів енергозабезпечення та детоксикації інтермедіатів обміну метанолу у дріжджів було показано, що в мутантів із пошкодженнями окремих ланок метаболізму часто спостерігається зміна фізіологічної реакції клітин на присутність метанолу та формальдегіду у формі екструзії мурашиної кислоти, виділення пероксиду водню або поглинання кисню. Ці метаболічні реакції можна розглядати як клітинний відгук на відповідні аналіти і були вибрані за основу при створенні біосенсорних систем для кількісного визначення метанолу, етанолу та формальдегіду. Ми розробили два основні типи мікробних біосенсорів із використанням клітин мутантних штамів метилотрофних дріжджів - потенціометричні (на основі рН-чутливих польових транзисторів - рН-ПТ) та амперометричні (на базі кисневого або перекисно-водневого платинових електродів). У першому випадку аналітичною реакцією служить секреція іонів водню в позаклітинний простір як результат метаболічної конверсії аналіту (метанолу, формальдегіду або етанолу) до відповідної кислоти (мурашиної чи оцтової). У випадку амперометричних сенсорів для моніторингу були використані реакції споживання кисню або продукції пероксиду водню при окисленні клітинами вказаних аналітів в алкогольоксидазній реакції.

Нами проведено скринінг природних штамів різних видів дріжджів та генетичне конструювання мутантів метилотрофних дріжджів із метаболічними порушеннями, що спричинюють скеровану зміну закислювального відгуку клітин на певні субстрати (рис. 7).

Штам метилотрофних дріжджів H. polymorpha 34-19 містить генетичний блок форміатдегідрогенази, у зв'язку з чим дає посилений закислюючий відгук у присутності метанолу або формальдегіду. Мутант P. methanolica 2468 має порушення ацетил-CoA-синтетази, що призводить до блокування метаболічного перетворення оцтової кислоти та її екструзії в позаклітинний простір у присутності етанолу. Мутантний штам H. polymorpha А3-11 із порушенням регуляції синтезу алкогольоксидази та форміатдегідрогенази форміатом зберігає здатність окислювати формальдегід до мурашиної кислоти при втраті цієї здатності щодо метанолу. Клітини дикого типу S. cerevisiae (а також C. maltosa), вирощені на середовищі з етанолом, проявляють високу закислюючу активність у присутності формальдегіду, але не метанолу, завдяки природній відсутності АО та високій активності неспецифічної альдегіддегідрогенази у цих дріжджів. Вказані фізіолого-біохімічні характеристики мутантних штамів використані нами при конструюванні мікробних потенціометричних транзисторних сенсорів, селективних до метанолу (штам 34-19), етанолу (штам 2468), формальдегіду (мутант А3-11 та два штами дикого типу неметилотрофних дріжджів S. cerevisiae і C. maltosa) [Gonchar et. al., 1992; Корпан и др., 1992; Korpan et. al., 1993a, 1993b; Корпан и др., 1994; Гончар и др., 1994; Корпан і співавт., 1995; Gonchar et. al., 1995]. Сконструйовані рН-ПТ-біосенсори на основі інтактних дріжджових клітин є високоселективними, достатньо чутливими (1-100 мМ аналіту), дають добре відтворювальні результати (відносна похибка - 1-5 %), проте їх недоліком є відносно повільний розвиток стаціонарного сигналу (2-5 хв), тривалість відновлення базового стану біосенсора під час промивання та чутливість до ряду факторів, які можуть впливати на цілісність клітинної мембрани.

Для усунення вказаних недоліків нами сконструйовані ензимні рН-ПТ-біосенсори [Korpan et. al., 1997; 2000] на основі як очищених препаратів АО, так і пермеабілізованих клітин метилотрофних дріжджів із високим вмістом цього фермента. Несподівано виявилось, що такі біосенсори виявляють високу селективність до формальдегіду і зовсім не чутливі до метанолу, що контрастує із здатністю алкогольоксидази окислювати метанол. Ми пояснюємо цей феномен двостадійністю алкогольоксидазної конверсії метанолу до мурашиної кислоти, відмінністю кінетичних параметрів АО відносно двох послідовних субстратів і стаціонарними умовами процесу:

Формальдегід (у гідратованій формі) є субстратом АО, проте К_М для нього на порядок вища, ніж для метанолу [Klei van der et al., 1990], що приводить до конкурентного гальмування метанолом наступної стадії реакції - окислення формальдегіду до тестованого продукту - мурашиної кислоти.

Основним недоліком рН-транзисторних біосенсорів є зниження чутливості відгуку за рахунок буферної ємності аналізованих зразків. Несподівано виявилось, що тріс-буфер, на відміну від, наприклад, фосфатного, не пригнічує закислювального відгуку на формальдегід біосенсора на основі алкогольоксидази, іммобілізованої в гелях за присутності ДЕАЕ-декстрану. Ми пов'язуємо це із бар'єрним ефектом позитивного заряду ДЕАЕ-декстранового носія, який сповільнює дифузію тріс-катіонів у біоактивний шар. Крім того, підсилення сенсорного сигналу в присутності тріс-буферу можна пояснити і специфічним “хемосенсорним” ефектом, який, на наш погляд, полягає у звільненні додаткових протонів при хімічній взаємодії формальдегіду з протонованою аміногрупою тріс(гідроксиметил)амінометану:

Хімізм цієї реакції полягає в утворенні в процесі реакції з формальдегідом гідроксиметильної похідної тріс-основи, яка є слабшою основою порівняно з вихідною сполукою, а тому легше відщеплює протони і слабше виявляє буферні властивості. Реакція гідроксиметилювання формальдегідом є добре відомою для первинних і вторинних амінів [Gerberich & Seaman, 1994], а тому не викликає сумнівів і для тріс-основи. Таким чином, використання тріс-буферу дозволяє суттєво підвищити чутливість сенсорного відгуку на формальдегід. Це перший описаний випадок специфічної позитивної дії хемосенсорного ефекту при функціонуванні біосенсора.

Крім закислюючої активності клітин, при конструюванні біосенсорів на спирти ми використали природну здатність клітин поглинати кисень при метаболізмі цих субстратів-аналітів. Генетична модифікація дозволила підсилити цю активність і, крім того, дала можливість сконструювати мутантні штами, здатні до екскреції пероксиду водню. Клітини таких мутантів були апробовані в ролі біочутливих елементів амперометричних сенсорів на основі О₂- і Н₂О₂-електродів. Регуляторна мутація в штамі H. polymorpha 7-4A (gcr1 EAO) приводить до підвищеної експресії АО в клітинах і, завдяки цьому, до збільшення їх кисеньпоглинаючої активності в присутності спирту. Дві мутації, введені в штам H. polymorpha К-105 (gcr1 catX), викликають екструзію пероксиду водню при інкубації клітин із етанолом (або метанолом) як аналітом: перша регуляторна мутація спричинює дерепресію синтезу АО при рості клітин на глюкозі, а друга - порушує каталазу, наслідком чого є генерація мутантними клітинами електрохімічно активного продукту, пероксиду водню. Обробка клітин пермеабілізуючими агентами (дигітоніном, бромідом цетилтриметиламонію) дозволяє зняти неселективний дихальний відгук клітин відносно багатьох вуглецевих субстратів (глюкози, гліцерину тощо), зберігаючи високу кисеньпоглинаючу активність у присутності метанолу або етанолу, а також посилює H₂O₂-секретуючу активність безкаталазних клітин [Gonchar et al., 1998a]. Це, напевно, пов'язано із вимиванням із клітин коферментів і низькомолекулярних ензимів, що беруть участь у вуглецевому катаболізмі, та збереженням внутрішньоклітинної локалізації алкогольоксидази (М. м. 640 кДа). Таким чином, поєднання генетичного конструювання та хімічної пермеабілізації клітин-біоелементів дало особливий ефект, забезпечивши як підсилення дихальної (кисеньпоглинаючої) активності клітин і появу невластивої клітинам дикого типу здатності секретувати в середовище вільний пероксид водню, так і підвищення селективності даних сенсорних відгуків до спиртів. Слід зазначити, що такий тип клітинних біосенсорів описано вперше.

Обидва типи клітинних біосенсорів на основі пермеабілізованих мутантних клітин метилотрофних дріжджів і О₂- та Н₂О₂-електродів продемонстрували високу порогову чутливість - до 0,2-0,4 мМ для етанолу та 0,03-0,05 мМ для метанолу; показали добру відтворюваність і виявляли хорошу операційну стабільність - як при експлуатації, так і за умов зберігання біоелементів у сухому стані. Обидва біосенсори мали подібну селективність відносно спиртів: найвищий відгук спостерігався до метанолу (100%), менший - до етанолу (21%) і формальдегіду (12%) за повної відсутності позитивного сигналу до глюкози та гліцерину. Порівняння сконструйованих потенціометричних біосенсорів на основі рН-чутливих польових транзисторів і амперометричних аналогів на базі О₂- і Н₂О₂-чутливих електродів показало, що більш чутливими є другі, а більш селективними, проте більш вразливими до інтерферуючого впливу різних факторів, є перші.

У кінцевому підсумку, проведені експериментальні дослідження показали плідність конструювання клітинних та ферментних біосенсорів, чутливих до метанолу, етанолу та формальдегіду, на основі клітин метилоторофних і неметилотрофних дріжджів, а також алкогольоксидази метилотрофних дріжджів із застосуванням рН-чутливих польових транзисторів і О₂- та Н₂О₂-чутливих електродів у ролі трансдукторів. Вперше показано, що скерована метаболічна інженерія як комбінація генетичної і хімічної модифікації клітин дозволяє підвищити як чутливість, так і селективність їх закислювального, кисеньпоглинаючого та пероксидгенеруючого відгуку на відповідні аналіти - метанол, етанол, формальдегід. Це розкриває можливості більш цілеспрямованого конструювання мікробних сенсорних елементів з оптимальними аналітичними характеристиками. Враховуючи, що для метилотрофних дріжджів розроблено системи надекспресії гетерологічних білків, у перспективі є можливим введення в ці клітини метаболічних ланок чи навіть нових шляхів, які забезпечать високу сенсорну активність клітин відносно цільового аналіту. Це дозволить поєднати позитивні риси клітинних та ферментних біоелементів в одному сенсорному пристрої.

Висновки

У дисертації наведено теоретично-експериментальне обгрунтування існування у метилотрофних дріжджів нових, не відомих досі додаткових шляхів енергозабезпечення метилотрофного росту і детоксикації інтермедіатів обміну метанолу. Доведено можливість модифікації окремих ланок цих шляхів, що виявляється у цілеспрямованій зміні закислювальної, пероксидгенеруючої і кисеньпоглинаючої активності модифікованих клітин. Показано, що дані явища можуть розглядатись як специфічний фізіологічний відгук клітин на певні субстрати (метанол, етанол, формальдегід) і можуть бути використані у створенні нових біоаналітичних методів і продуктів для кількісного визначення практично важливих аналітів у біологічних рідинах і харчових продуктах.

Головні наукові і практичні результати роботи викладені у наступних висновках:

1. За використання підходів скерованої селекції мутантів, інгібіторного аналізу та вивчення включення радіоізотопної мітки показано, що у метилотрофних дріжджів існує додаткова циклічно-лінійна система енергозабезпечення росту на метанолі, яка включає ксилулозомонофосфатний цикл синтезу дигідроксиацетону з формальдегіду, ланку гліколітичного окислення тріозофосфатів та цикл трикарбонових кислот і доповнює відомий прямий шлях окислення формальдегіду у двох дегідрогеназних реакціях.

2. За допомогою методів селекції специфічних мутантів та їх фізіолого-біохімічного аналізу відкрито додаткові шляхи детоксикації інтермедіатів обміну метанолу у метилотрофних дріжджів, які включають окислення формальдегіду в неспецифічній альдегіддегідрогеназній реакції, енергозалежну екскрецію мурашиної кислоти в середовище та детоксикацію пероксиду водню у цитохром с-пероксидазній реакції.

3. Вперше виявлено та ензимологічно охарактеризовано метанол- і формальдегідзалежну систему закислення середовища у клітин метилотрофних дріжджів. Запропоновано модель функціонування цієї системи, яка включає реакції окислення метанолу і формальдегіду до мурашиної кислоти, енергозалежну екструзію протонів з участю плазмалемної Н⁺-АТРази та вторинно-активне перенесення форміат-аніонів за рахунок генерованого транс-мембранного потенціалу. Обгрунтовано роль реакцій прямого (лінійного) окислення метанолу і формальдегіду в цій детоксикаційній системі. Показано, що клітини неметилотрофних дріжджів (Saccharomyces cerevisiae, Candida maltosa) здатні до активної екструзії мурашиної кислоти в присутності формальдегіду, що, можливо, є проявом універсальної для дріжджів системи детоксикації цієї сполуки у неспецифічній альдегіддегідрогеназній реакції.

4. Вперше виділено із метилотрофних дріжджів у препаративних кількостях цитохром с і цитохром с пероксидазу і вивчено їх фізико-хімічні властивості: молекулярні маси та електронні спектри (для обох білків), спектри ядерного магнітного резонансу, ізоелектричну точку і редокс-потенціал (для цитохрому с).

5. Отримано безкаталазний надпродуцент алкогольоксидази Hansenula polymorpha К-105, здатний конститутивно синтезувати цільовий фермент на глюкозному середовищі. Розроблено економічну схему препаративного отримання алкогольоксидази, її стабілізації та використання в аналітичній біотехнології для кількісного визначення метанолу, етанолу та формальдегіду.

6. Створено перші вітчизняні ферментативні набори для оксидазно-пероксидазного визначення вмісту глюкози (“ДІАГЛЮК”, “ДІАГЛЮК-2”), етанолу і метанолу (“АЛКОТЕСТ”) та затверджено через Фармакологічний комітет МОЗ України науково-технічну документацію для їх серійного випуску. Для їх виробництва використано нові хромогенні системи та спеціально сконструйований безкаталазний надпродуцент алкогольоксидази (для “АЛКОТЕСТу”).

7. Проведено цілеспрямоване генетичне конструювання специфічних мутантів метилотрофних дріжджів, що дозволило підвищити селективність та чутливість аналітичного відгуку клітин (екструзії протонів або пероксиду водню) на метанол, етанол та формальдегід. Ці модифікації включають порушення активності форміатдегідрогенази (підвищення закислювального відгуку), алкогольоксидази (збереження формальдегід-, але не метанолзалежного закислення), ацетил-CoA-синтетази (поява етанолзалежного закислення), каталази (поява здатності до екструзії пероксиду водню).

8. На моделі мікробних елементів О₂- та Н₂О₂-електродних біосенсорів уперше показано, що генетична селекція за ознакою надекспресії алкогольоксидази та хімічна модифікація клітин метилотрофних дріжджів пермеабілізуючими агентами дозволяє суттєво підвищити селективність та швидкодію аналітичного відгуку клітин до метанолу та етанолу.

9. Показано, що найвищу селективність до відповідних аналітів (метанолу, етанолу, формальдегіду) виявляють потенціометричні біосенсори на основі рН-чутливих польових транзисторів і специфічних мутантів метилотрофних дріжджів та алкогольоксидази, а найбільшу чутливість - амперометричні біосенсори на основі О₂- і Н₂О₂-електродів і пермеабілізованих мутантних клітин цих дріжджів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Гончар М.В., Сибирный А.А. О природе индуцируемого метанолом закисления среды метилотрофными дрожжами // Укр. биохим. журн. - 1988. - Т. 60, № 1. - С. 97-100.

Sibirny A.A., Titorenko V.I., Gonchar M.V., Ubiyvovk V.M., Ksheminskaya G.P., Vitvitskaya O.P. Genetic control of methanol utilization in yeasts // J. Basic Microbiol. - 1988. - Vol. 28. - P. 293-319.

Гончар М.В., Титоренко В.И., Гладаревская Н.Н., Сибирный А.А. Явление закисления среды клетками метилотрофных дрожжей и его биохимическая природа // Биохимия. - 1990. - Т. 55. - С. 2148-2157.

Сибирный А.А., Гончар М.В. Влияние цитрата и диоксиацетона на окисление метанола у дрожжей Hansenula polymorpha // Укр. биохим. журн. - 1990. - Т. 62, № 1. - С. 108-112.

Сибирный А.А., Кшеминская Г.П., Убийвовк В.М., Гончар М.В., Капульцевич Ю.Г., Близник К.М. Мутанты метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha с дефектной формальдегидредуктазой // Биотехнология. - 1990. - №. 5. - С. 13-17.

Sibirny A.A., Ubiyvovk V.M., Gonchar M.V., Titorenko V.I., Voronovsky A.Y., Kapultsevich Y.G., Bliznik K.M. Reactions of direct formaldehyde oxidation to CO₂ are non-essential for energy supply of yeast methylotrophic growth // Arch. Microbiol. - 1990. - Vol. 154. - P. 566-575.

Gonchar M.V., Ksheminska G.P., Hladarevska N.M., Sibirny A.A. Catalase-minus mutants of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha impaired in regulation of alcohol oxidase synthesis // Proc. Intern. Conf. “Genetics of Respiratory Enzymes in Yeasts” (July 29 - August 3, 1990, Karpacz, Poland) / Ed. by T.M. Lachowicz. - Wroclaw: Wroclaw University Press. - 1990a. - P. 222-228.

Gonchar M.V., Lachowicz T.M., Sibirny A.A., Witkowska R., Zakowska Z. Genetics, physiology and biochemistry of some Saccharomyces cerevisiae mutants excreting acidic products // Materials of the Internation. Conf. “Genetics of respiratory enzymes in yeasts” / Ed. T.M. Lachowicz. - Wroclaw: Wroclaw University Press. - 1990b. - P. 53-64.

Гончар М.В., Корпан Я.І., Сибірний А.А. Кількісний фотометричний аналіз етанолу з використанням очищеної алкогольоксидази та мутантних клітин метилотрофних дріжджів // Укр. біохім. журн. - 1991. - Т. 63, № 6. - С. 62-67.

Корпан Я.И., Гончар М.В., Солдаткин А.П., Стародуб Н.Ф., Сандровский А.К., Сибирный А.А., Ельская А.В. Клеточные микробиосенсоры на основе рН-чувствительных полевых транзисторов для определения метанола и этанола // Укр. биохим. журн. - 1992. - Т. 64, № 3. - С. 96-100.

Gonchar M.V., Korpan Y.I., Starodub N.F., Sibirny A.A. Formaldehyde-induced acidification of the medium by methylotrophic yeast cells and elaboration of cell biosensor based on this phenomenon // Proc. of 3^rd Internat. Confer. on Role of Formaldehyde in Biological Systems. Methylation and Demethylation Processes. May 1992, Sopron, Hungary / Ed. E. Tyihak. - Hungar. Biochem. Soc., 1992. - P. 203-208.

Korpan Y.I., Gonchar M.V., Soldatkin A.P., Starodub N.F., Shulga A.I., Sibirny A.A., Elskaya A.V. Methylotrophic yeast microbiosensor based on ion-selective field effect transistors for methanol and ethanol determination // Anal. Chim. Acta. - 1993a. - Vol. 271. - P. 203-208.

Korpan Y.I., Gonchar M.V., Starodub N.F., Shul'ga A.A., Sibirny A.A., El'skaya A.V. A cell biosensor specific for formaldehyde based on pH-sensitive transistors coupled to methylotrophic yeast cells with genetically adjusted metabolism // Anal. Biochem. - 1993b. - Vol. 215. - P. 216-222.

Ubiyvovk V.M., Gonchar M.V., Sibirny A.A. Pathways of energy generation during yeast methylotrophic growth // Folia Microbiol. - 1994. - Vol. 39. - P. 552-553.

Корпан Я.И., Гончар М.В., Стародуб Н.Ф., Сибирный А.А., Ельская А.В. Клетки метилотрофных дрожжей как биологически активный материал для создания сенсорных устройств. ІІ. Формальдегидный анализатор на основе рН-чувствительных полевых транзисторов // Биохимия. - 1994. - Т. 59. - С. 201-205.

Гончар М.В., Сибирный А.А., Корпан Я.И., Стародуб Н.Ф., Ельская А.В. Клетки метилотрофных дрожжей как биологически активный материал для создания сенсорных устройств. I. Формальдегид-индуцируемое закисление среды и его биохимическая природа // Биохимия. - 1994. - Т. 59. - С. 967-973.

Корпан Я.І., Гончар М.В., Стародуб М.Ф., Єльська Г.В. Біосенсори на основі клітин мікроорганізмів // Биополимеры и клетка. - 1995. - Т. 11, № 2. - С. 15-45.

Гончар М.В., Сибірний А.А. Методичні вказівки для виконання лабораторних робіт з великого практикуму (розділ - біотехнологія) для студентів IV курсу біол. факультету. - Львів: ЛДУ, 1995. - 23 с.

Gonchar M.V., Maidan M.M., Korpan Y.I., Sibirny A.A., Elska A.V. New approaches for formaldehyde assay based on use of enzymatic kit or pH-sensitive field effect transistor biosensor // Environmental Biotechnology. Principles and Practice / Eds. M. Moo-Young, W.A. Anderson, A.M. Chakrabarty. - Kluwer Acad. Publ. - 1995. - P. 689-700.

Gonchar M.V., Kostryk L.B., Sibirny A.A. Cytochrome c peroxidase from methylotrophic yeast: physiological role and isolation // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1997. - Vol. 48. - P. 454-458.

Майдан Н.Н., Гончар М.В., Сибирный А.А. Окисление экзогенного формальдегида в клетках метилотрофных и неметилотрофных дрожжей // Биохимия. - 1997. - Т. 62. - С. 744-749.

Korpan Y.I., Gonchar M.V., Sibirny A.A., EI'skaya A.V. A novel enzyme biosensor spesific for formaldehyde based on pH-sensitive field effect transistors.- J. Chem. Technol. Biotechnol. - 1997. - Vol. 68. - P. 209-213.

Gonchar M.V., Maidan M.M., Moroz O.M., Woodward J.R., Sibirny A.A. Microbial O₂ - and H₂O₂-electrode sensors for alcohol assays based on the use of permeabilized mutant yeast cells as the sensitive bioelements // Biosens. Bioelectron. - 1998a. - Vol. 13. - P. 945-952.

Gonchar M.V., Strzelczyk M., Maidan M., Bieс J. Sibirny A. Zastosowanie metody enzymatycznej do analizy formaldehydu w roztworach wodnych // Ochrona Њrodowiska. - 1998b. - N3(70). - P. 35-38.

Гончар М.В. Чутливий метод кількісного визначення пероксиду водню та субстратів оксидаз у біологічних об`єктах // Укр. біохім. журн. - 1998. - Т. 70, № 5. - С. 157-163.

Гончар М.В. Традиционные и ферментативные методы определения алкоголя в биологических жидкостях // Лабораторная диагностика. - 1999a. - № 1. - С. 45-49.

Гончар М.В. Оксидазно-пероксидазный метод определения алкоголя в крови с помощью отечественного набора “Алкотест” // Лабораторная диагностика. - 1999б. - № 2. - С. 55-58.

Bieс J., Sybirny W., Sybirny A., Maidan N., Gonchar M. Nowa enzymatyczno-chemiczna metoda oznaczania formaldehydu i metanolu w њciekach przemysіowych // Inїynieria i Ochrona њrodowiska. - 1999. - T. 2, N 3-4. - S. 323-331.

Гончар М.В. Альтернативні механізми детоксикації формальдегіду, форміату та пероксиду водню у метилотрофних дріжджів // Мікробіол. журн. - 2000. - Т. 62, № 1. - С. 30-39.

Korpan Y.I., Gonchar M.V., Sibirny A.A., Martelet C., El'skaya A.V., Gibson T.D., Soldatkin A.P. Development of highly selective and stable potentiometric sensors for formaldehyde determination // Biosens. Bioelectron. - 2000. - Vol. 15. - P. 77-83.

Moroz O.M., Gonchar M.V., Sibirny A.A. Efficient bioconversion of ethanol to acetaldehyde using a novel mutant strain of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Biotechnol. Bioeng. - 2000. - Vol. 68. - P. 44-51.

Borsari M., Dikaya E., Dikiy A., Gonchar M.V., Maidan M.M., Pierattelli R., Sibirny A.A. Isolation and physico-chemical characterisation of a cytochrome c from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Biochim. Biophys. Acta. Protein Structure and Molecular Enzymology. - 2000. - V. 1543, N 1. - P. 174-188.

Способ определения перекиси водорода в биологических объектах: А. с. СССР 1636772, МКИ⁵ G 01 N 33/52 / М.В. Гончар, А.А. Сибирный (СССР). - № 4363857/14; Заявлено 13.01.88; Опубл. 23.03.91. - 1991а. - Бюл. № 11. - 6 с.

Способ определения пероксидазной активности биологических объектов: А. с. СССР 1636773, МКИ⁵ G 01 N 33/52 / М.В. Гончар, А.А. Сибирный (СССР). - № 4363857/14; Заявлено 13.01.88; Опубл. 23.03.91. - 1991б. - Бюл. № 11. - 6 с.

Штамм метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha ВКПМ Y-1345 - продуцент алкогольоксидазы на среде с глюкозой: А. с. СССР 1832128, МКИ⁵ C 12 N 9/04, 1/16 / А.А. Сибирный, Г.П. Кшеминская, М.В. Гончар, Н.Н. Гладаревская (СССР). - № 4865451/13; Заявлено 24.07.90; Опубл. 07.08.93. - 1993. - Бюл. № 29. - 6 с.

Спосіб кількісного визначення перекису водню та субстратів оксидаз у біологічних об'єктах: Пат. 10752 України, МПК⁵ G 01 N 33/48 / М.В. Гончар, М.М. Майдан, А.А. Сибірний. - № 95073201; Заявлено 10.07.95; Опубл. 25.12.96. - 1996. - Бюл. № 4. - 11 с.

Гончар М.В., Титоренко В.І., Сибірний А.А. Характеристика метанолзалежної системи закислення середовища у метилотрофних дріджів // Тези доповідей V Укр. біохім. з`їзду (Івано-Франківськ, вересень 1987 р.). - Част. 1. - Київ. - 1987. - С. 269-270.

Sibirny A.A., Ubiyvovk V.M., Gonchar M.V., Titorenko V.I., Voronovsky A.Y., Bliznik K.M., Kapultsevich Y.G. Formaldehyde and formate dehydrogenases are not essential for methylotrophic growth of yeast // Abstracts of the 6^th International Symposium on Microbial Growth on C₁-Compounds (August 20-25, 1989). - Gцttingen (Germany). - 1989. - P. P448.

Gonchar M.V., Maidan M.M., Pavlishko H.M., Sibirny A.A. Metabolic engineering of methylotrophic yeast cells in construction of recognition elements for biosensors // Abstracts of the Tenth International Symposium on Yeasts “The Rising Power of Yeasts in Science and Industry” (August 27 - September 1, 2000). - Papendal, Arnhem (The Netherlands). - 2000. - P. 114-116.

Анотація

Гончар М.В. Шляхи енергозабезпечення і детоксикації у метилотрофних дріжджів та їх скерована модифікація з метою створення нових ферментативних і біосенсорних аналітичних систем. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2000.

У дисертації розроблено нову концепцію щодо функціонування у метилотрофних дріжджів додаткового циклічно-лінійного шляху дисиміляції метанолу, яка включає ксилулозомонофосфатний цикл синтезу дигідроксиацетону з формальдегіду, ланку гліколітичного окислення тріозофосфатів та цикл трикарбонових кислот. Відкрито додаткові системи детоксикації формальдегіду, форміату і пероксиду водню у метилотрофних дріжджів, які включають окислення формальдегіду в неспецифічній альдегіддегідрогеназній реакції, енергозалежну екструзію мурашиної кислоти в позаклітинний простір та відновлення пероксиду водню у цитохром с-пероксидазній реакції. Вперше показано, що генетична та хімічна модифікація клітин метилотрофних дріжджів дозволяє істотно підвищити селективність та чутливість їх фізіологічного відгуку (екструзії кислот або пероксиду водню, поглинання кисню) на метанол, етанол та формальдегід, що стало основою для розробки нових біосенсорних та ензиматичних методів аналізу вказаних сполук.

Ключові слова: енергетичний обмін, детоксикація, метилотрофні дріжджі, метанол, формальдегід, форміат, пероксид водню, ферментативний аналіз, біосенсори.

Аннотация

Гончар М.В. Пути энергообеспечения и детоксикации у метилотрофных дрожжей и их направленная модификация с целью создания новых ферментативных и биосенсорных аналитических систем. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2000.

В диссертации розработана новая концепция о функционировании у метилотрофных дрожжей дополнительного циклично-линейного пути диссимиляции метанола, которая включает ксилулозомонофосфатный цикл синтеза дигидроксиацетона из формальдегида, гликолитическое окисление триозофосфатов и цикл трикарбоновых кислот. Открыты дополнительные системы детоксикации формальдегида, формиата и перекиси водорода у метилотрофных дрожжей, которые включают окисление формальдегида в неспецифичной альдегиддегидрогеназной реакции, энергозависимую экструзию муравьиной кислоты во внеклеточное пространство и восстановление перекиси водорода в цитохром с-пероксидазной реакции. Впервые показано, что генетическая и химическая модификация клеток метилотрофных дрожжей позволяет существенно повысить селективность и чувствительность их физиологического отклика (экструзии кислот или перекиси водорода, поглощение кислорода) на метанол, этанол и формальдегид, что послужило базой для разработки новых биосенсорных и энзиматических методов анализа указанных соединений.

Ключевые слова: энергетический обмен, детоксикация, метилотрофные дрожжи, метанол, формальдегид, формиат, перекись водорода, ферментативный анализ, биосенсоры.

Summary

Gonchar M.V. Pathways of energy supply and detoxification in methylotrophic yeasts and their directed modification for development of enzymatic and biosensor analytical systems. - Manuscript.

Thesis for Doctor of Science degree on speciality 03.00.04 - biochemistry. - A.V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

A new concept of the dissimilatory metabolism of methanol in yeasts has been proposed which rejects an exclusive role of formaldehyde- and formate dehydrogenases-catalysed reactions in the energy supply of methylotrophic growth. The suggested cyclic dissimilatory pathway includes xylulose monophosphate cycle of formaldehyde fixation, oxidation of triose phosphates to pyruvate in glycolytic reactions, and tricarboxylic acid cycle. Functioning of this additional dissimilatory route has been confirmed by several experimental approaches: analysis of influence of the Krebs' cycle inhibitor, fluoroacetate, on methylotrophic growth, selection of mutants impaired in specific reactions involved in the known or in the suggested pathways (formaldehyde and formate dehydrogenases, citrate synthase, dihydroxyacetone synthase, genetic block of glutathione biosynthesis) and investigation of physiological and metabolic consequences of the corresponding mutations (ability to grow on methanol media, incorporation of radiactive label from [¹⁴C]-methanol into carbon dioxide and biomass), and study of possible competitive “dilution” effect of non-labelled analogs of methanol intermediates of both dissimilation routes (formate, dihydroxyacetone, citrate) on [¹⁴C]-incorporation from labelled methanol into CO₂. An energetic efficiency of both routes for energy supply of methylotrophic growth has been analysed.

By the use of specific mutants as the model systems, the additional pathways of detoxification of methanol intermediates (formaldehyde, formate, and hydrogen peroxide) have been revealed. These pathways include formaldehyde oxidation in non-specific aldehyde dehydrogenase-catalysed reaction, energy-dependent formic acid extrusion into extracellular medium, and reduction of hydrogen peroxide in cytochrome c peroxidase (CcP) reaction.

Functioning of a very active acidification system in yeasts has been confirmed which is dependent on methanol and formaldehyde (methylotrophic yeasts) or only on formaldehyde (non-methylotrophic yeasts). The enzymatic nature, mechanism of action and physiological role of this system in detoxification of formaldehyde and formate in yeasts have been discussed.

Contrary to the opinion that catalase is non-dispensable for methylotrophic growth, it has been shown that the mutation resulting in oversynthesis of CcP can suppress catalase defect and restores ability of the mutant cells to grow on methanol as a sole source of carbon and energy. Homogeneous preparations of CcP and cytochrome c from the selected suppressor strain were isolated in preparative quantities. Some physico-chemical characteristics of cytochrome c (molecular weight, isoelectric point, redox-potential, electronic and ¹H-NMR spectra) were determined for the first time.

A mutant strain of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha devoid of catalase and overproducing alcohol oxidase (AO) in glucose medium has been constructed and used as a source of this enzyme for bioanalytical applications. An economic scheme for isolation and stabilization of AO has been developed. A novel enzymatic kit “ALCOTEST” for alcohol assays in blood and food products based on alcohol oxidase-peroxidase coupled reactions and a very effective chromogenic system has been elaborated.

It has been demonstrated for the first time that directed genetic and chemical modification of yeast cells gives an opportunity to considerably enhance the selectivity and sensitivity of their analytical response (extrusion of acids or hydrogen peroxide, consumption of oxygen) to methanol, ethanol, and formaldehyde. The use of the methods of metabolic engineering allowed us to construct highly selective microbial and enzymatic bioelements of potentiometric and amperometric biosensors, specific for the mentioned above analytes, using pH-sensitive field effect transistors (pH-FET) and O₂- or H₂O₂-selective electrodes as transducers.

Key words: energy supply, detoxification, methylotrophic yeast, methanol, formaldehyde, formate, hydrogen peroxide, enzymatic assay, biosensor.

Размещено на Allbest.ru