Активность свободнорадикальных процессов и макро- и микроскопические изменения в легких у мышей с карциномой легкого льюис на фоне сочетанной терапии циклофосфаном и 3-оксипиридинацетилцистеинатом

Размещено на http://www.allbest.ru/

Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева

Активность свободнорадикальных процессов и макро- и микроскопические изменения в легких у мышей с карциномой легкого льюис на фоне сочетанной терапии циклофосфаном и 3-оксипиридинацетилцистеинатом

Сипров А.В

Инчина В.И

Куликов О.А

Костина Ю.А

Кузнецова В.А.

Окислительный стресс, в основе которого лежит интенсификация свободнорадикальных процессов в тканях на фоне недостаточности антиоксидантной системы, является универсальным механизмом клеточных повреждений, приводящих к развитию различных патологических состояний, включая злокачественные новообразования. Согласно кислородно-перекисной концепции онкогенеза многие противоопухолевые мероприятия можно разделить на две группы. Воздействия первой группы направлены на снижение уровня свободнорадикального окисления. Воздействия второй группы связаны с еще большей интенсификацией свободнорадикального окисления в опухолевых клетках. В связи с этим, из средств первой группы могут быть использованы препараты с антиоксидантным действием.

Целью работы явилось исследование активности свободнорадикальных процессов и макро- и микроскопических изменений в легких у мышей с карциномой легкого Льюис (LLC) на фоне сочетанной терапии циклофосфаном и антиоксидантом 3-оксипиридинацетилцистеинатом (3-ОПЦ).

Таблица 1. Динамика МДА, Fe-МДА, каталазы и СОД в легких экспериментальных мышей на фоне сочетанной терапии ЦФ и 3-ОПЦ

Примечание: достоверность различий р1 рассчитана по отношению к интактной группе; р2 - к группе I (LLC); р3 - к группе II (LLC+ЦФ); р4 - к группе III (LLC+ЦФ+3-ОПЦ 25); р5 - к группе IV (LLC+ЦФ+3-ОПЦ 50)

свободнорадикальный ткань метиленовый синий

Материалы и методы: опыты с карциномой легкого Льюис (LLC) проводились на мышах-самках линии C57Bl/6 массой 20-22 г. Суспензию клеток LLC вводили в/м в область бедра (по 106 клеток в растворе Хенкса). Животные были разделены на интактную группу, мышей с LLC, которые не подвергались лечению, животных с LLC, получавших монотерапию циклофосфаном (ЦФ) в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно 2 раза с интервалом 96 часов, начиная с 7-х суток эксперимента. В следующих группах животные с LLC получали ЦФ в сочетании с 3-ОПЦ в дозах 25 и 50 мг/кг соответственно, который вводился внутримышечно, начиная с 7-х суток после имплантации опухолевых клеток в течение 14 дней. В качестве препарата сравнения для 3-ОПЦ использовался ?-токоферол в дозе 50 мг/кг, который вводился по той же схеме, что и 3-ОПЦ. На 22-е сутки после трансплантации опухолевых клеток животные подвергались эвтаназии под эфирным наркозом. Материалом исследования явились легкие мышей, которые фиксировались в жидкости Карнуа, затем подсчитывали число поверхностных метастазов. В гомогенатах легких определяли содержание МДА, Fe-МДА, активность каталазы и СОД. Гистологическую структуру легких исследовали светооптическим методом. Для этого их фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Фиксированные образцы после промывки в проточной воде подвергались обезвоживанию путем помещения исследуемого материала в спирты возрастающей концентрации. После дегидратации материал по общепринятой методике заливали в парафин, а затем на санном микротоме получали срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином и просматривали при увеличении от 250 до 500 на микроскопе «Микмед 2». При статистической обработке результатов исследования использовали критерий t Стьюдента.

Как показали исследования, на 22-е сутки эксперимента в ткани легких у не леченных животных с LLC содержание МДА, Fe- МДА и активность каталазы не отличались от уровня интактных животных, а активность СОД возрастала в 4 раза (р<0,05). Монотерапия циклофосфаном приводила к уменьшению активности каталазы и СОД в 1,8 раза по сравнению с нелеченными животными (р<0,05, табл. 1).

Введение 3-ОПЦ в дозах 25 и 50 мг/кг сопровождалось достоверным увеличением уровня МДА в 1,5 и 1,67 раза и снижением концентрации Fe-МДА в 2 и 1,76 раза соответственно (р<0,05) по сравнению с группой с монотерапией ЦФ. При этом в серии с 3-ОПЦ 25 мг/кг активность каталазы увеличивалась в 5,57 раза по отношению к группе с введением одного ЦФ, что было достоверно выше и интактного показателя, а в серии с 3-ОПЦ 50 мг/кг - в 2,4 раза по сравнению с группой с монотерапией ЦФ, что не отличалось от такового показателя у интактных животных (табл. 1). При этом 3-ОПЦ в дозах 25 и 50 мг/кг повышал активность СОД в 1,48 и 1,67 раза соответственно по отношению к группе с введением одного ЦФ. В группе с ?-токоферолом у животных в легких содержание МДА было в 1,4 раза меньше, а Fe-МДА в 1,8 раза больше, чем в серии с 3-ОПЦ в дозе 50 мг/кг (р<0,05) при отсутствии различий с группой с монотерапией ЦФ. Активность каталазы при этом восстанавливалась до интактного уровня, а активность СОД в 1,5 раза снижалась по отношению к здоровым животным (табл. 1).

При макроскопическом исследовании легких количество поверхностных метастазов на 22-е сутки у животных с LLC достигло 95,7±8,2. Монотерапия ЦФ приводила к достоверному сокращению числа метастатических узлов до 5,0±1,2. В группе с сочетанной терапией ЦФ и 3-ОПЦ в дозе 25 мг/кг количество метастазов достоверно снизилось до 1,33±0,56 по сравнению с серией с введением одного ЦФ. При совместном введении ЦФ и 3-ОПЦ в дозе 50 мг/кг число метастазов не отличалось от группы с монотерапией ЦФ и составило 1,67±0,5. В группе с сочетанным введением ЦФ и ?-токоферола количество метастазов не отличалось от такового в группе с монотерапией ЦФ (5,2±1,2), но было достоверно выше, чем в группах с 3-ОПЦ в обеих исследуемых дозах.

При гистологическом исследовании в ткани легких интактных животных отмечались гемодинамические изменения в виде выраженных гипостазов крови, связанные с механизмом смерти: просветы альвеол заполнены эритроцитами, межальвеолярные перегородки с расширенными полнокровными сосудами.

В легких опухоленосителей без лечения отмечались мелкие очаги ателектазов, альвеолярного отека, расширение межальвеолярных перегородок за счет отека и разрастания мелковолокнистой соединительной ткани. Бронхиальные артерии и вены расширены, просветы пустые. Бронхи свободны. На выше описанном фоне отмечались множественные разного размера очаги опухолевого роста от нескольких клеток до узлов с некрозом в центральных участках. Опухоль растет периваскулярно, перибронхиально и вне связи с сосудами. Опухоль без четкой капсулы. Клетки опухоли в метастазах полиморфные, крупные, встречаются атипичные митозы.

На фоне монотерапии ЦФ в легочной ткани при гистологическом исследовании отмечается единичный мелкий метастаз, расположенный субплеврально. Альвеолы свободны, отмечаются мелкие очаги интерстициальной эмфиземы, слабовыраженное периваскулярное разрастание соединительной ткани. Бронхи без особенностей.

В группе с совместным применением ЦФ и 3-ОПЦ в дозе 25 мг/кг эпителий бронхов с явлениями пролиферации. Встречаются очаги интерстициальной эмфиземы. Субплеврально - единичный мелкий метастаз. При сочетанном введении ЦФ и 3-ОПЦ в дозе 50 мг/кг в легких встречаются очаги интерстициальной эмфиземы. Метастазы не обнаружены. В группе с введением ЦФ и ?-токоферола в легочной ткани субплеврально мелкий метастаз. Отмечаются мелкие очаги интерстициальной эмфиземы, очаги дистелектаза.

Таким образом, 3-ОПЦ способствует увеличению уровня МДА и снижению концентрации Fe-МДА в сочетании с ростом активности антиоксидантных ферментов в ткани легких при совместном введении с циклофосфаном.

Сочетанное применение 3-ОПЦ в дозе 25 мг/кг с циклофосфаном оказалось более эффективным в предупреждении развития метастазов, по сравнению с терапией одним цитостатиком.

Для количественного определения метиленового синего может быть использован йодометрический метод.

Согласно данным литературы метиленовый синий вступает в реакцию с йодом с образованием тетрайодпроизводных комплексов, что соответствовало бы стехиометрическому составу продукта реакции 1:4.

Однако проведенная нами серия экспериментов йодометрического титрования метиленового синего показала наличие большой систематической ошибки. Поэтому представляло интерес уточнить стехиометрический состав образующегося при титровании полииодидного комплекса метиленового синего. Предварительно нами было проведено изучение свойств, образующегося в виде осадка, комплекса метиленового синего с йодом, в частности, его отношение к различным растворителям. Оказалось, что осадок хорошо фильтруется, не растворяется в спирте и хлороформе, хорошо растворяется в ацетоне, медленно разрушается раствором натрия тиосульфата. В связи с этим, для определения состава продукта взаимодействия метиленового синего с йодом нами была использована его способность разрушаться стандартным раствором натрия тиосульфата после растворения осадка в ацетоне. Массу связавшегося с метиленовым синим йода рассчитывали, как произведение титра тиосульфата натрия по йоду на объем натрия тиосульфата, пошедшего на разрушение полииодидного комплекса (), а мольное отношение компонентов определяли в соответствии со схемой уравнения реакции.

Результаты представлены в таблице.

Таблица 2. Результаты определения стехиометрического состава комплекса метиленового синего с йодом

Примечание: приведенные в таблице данные представляют собой среднее арифметическое трех-пяти определений.

Как показали результаты представленные в таблице, стехиометрический состав продуктов реакции не изменяется в зависимости от величины навески метиленового синего и соответствует отношению, реагирующих между собой метиленового синего и йода 1:5,5.

Изучение стехиометрического соотношения и постоянства состава продуктов реакции позволило нам пересчитать титр йода по метиленовому синему и предложить методику количественного йодометрического титрования метиленового синего.

Размещено на Allbest.ur