Синтез та дослідження фізико-хімічних властивостей гомо-n-мерних монометинціанінових барвників – високоефективних флуоресцентних зондів для детекції нуклеїнових кислот

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

УДК 577.336+57.08.088.5+542.95

Синтез та дослідження фізико-хімічних властивостеЙ

гомо-n-мерних монометинціанінових барвників - високоефективних флуоресцентних зондів

для детекції нуклеїнових кислот

02. 00. 10 - біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

КОЧЕШЕВ ІГОР ОЛЕКСАНДРОВИЧ

Київ-2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі структури і функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Наукові керівники:доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Мацука Генадій Харлампійович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, директор інституту, завідувач відділу структури і функцій нуклеїнових кислот

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник Ярмолюк Сергій Миколайович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу структури і функцій нуклеїнових кислот

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Броварець Володимир Сергійович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, провідний науковий співробітник,

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Говорун Дмитро Миколайович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу молекулярної біофізики Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, хімічний факультет

Захист дисертації відбудеться 25травня 2001 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1)

Автореферат розісланий 23 квітня 2001 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М.Федоряк



Кочешев І.О. Синтез та дослідження фізико-хімічних властивостей гомо-n-мерних монометинціанінових барвників - високоефективних флуоресцентних зондів для детекції нуклеїнових кислот. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2001.

Запропоновано три нові варіанти синтезу гомо-n-мерних монометинціанінових барвників. Вперше синтезовано низку нових гомодимерних ціанінів та гомотримерні монометинціанінові барвники. Спектрально-люмінесцентними методами досліджено особливості взаємодії отриманих гомо-n-мерних ціанінів з ДНК. Вивчено вплив агрегаційних процесів на спектрально-люмінесцентні властивості комплексів гомо-n-мерних ціанінових барвників з НК. Показано, що наявність агрегаційних процесів значно підвищує чутливість флуоресцентної детекції на довжині хвилі випромінювання мономерної форми барвника за рахунок зростання співвідношення сигнал/шум. Проведено комп'ютерне моделювання геометричної структури агрегатів гомо-n-мерних монометинціанінів та розрахунки електронних переходів останніх. Квантово-хімічними розрахунками підтверджено можливість існування міжмолекулярних агрегаційних комплексів, утворених взаємодією трьох хромофорів, два з яких належать одній молекулі. Показано, що досліджені ціанінові барвники можуть бути використані як флуоресцентні зонди для визначення НК в розчині та при електрофорезі в агарозному гелі.

Ключові слова: гомо-n-мерні ціанінові барвники, флуоресцентні зонди для детекції нуклеїнових кислот, агрегація, комп'ютерне моделювання, спектрально-люмінесцентні методи.



Кочешев И.А. Синтез и исследование физико-химических свойств гомо-n-мерных монометиновых цианиновых красителей - высокоэффективных флуоресцентных зондов для детекции нуклеиновых кислот. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2001.

Предложено три новых варианта синтеза гомо-n-мерных монометиновых цианиновых красителей. Первый вариант базируется на реакции взаимодействия пирилиевых солей с первичными аминами. С помощью этой реакции были ситнезированы новые гомодимерные красители с линкерами короткой и средней длинны. Попытки получить гомодимеры с линкером, который содержал бы менее 5 атомов углерода не увенчались успехом, что можна обьяснить наявностью пространственных затруднений. Второй вариант основывается на взаимодействии карбоксильных производных красителя с аминами. В качестве конденсирующих реагентов использованы ДЦГК и КДИ. С помощью этого метода впервые синтезированы гомотримерные монометинцианины К-Т и К-СТ. Третий вариант базируется на взаимодействии изоцианатов с аминами. С его помощью синтезирован гомодимерный краситель К-10 с конфигурационно жестким линкером. С помощью предложенных вариантов синтеза можно получить широкий спектр разнообразных гомо-n-мерных цианиновых красителей. флуоресцентний барвник нуклеїновий кислота

Проведены спектрально-люминесцентные исследования полученных гомо-n-мерных красителей в свободном состоянии и изучены особенности взаимодействия монометинцианинов с нуклеиновыми кислотами (НК). Установлено, что гомодимерний краситель К-6, а также гомотримерные цианины К_Т и К-СТ являются перспективными флуоресцентными зондами для детекции НК в растворе. Проведено исследование влияния длины и природы линкера на флуоресцентные свойсва комплексов красителей с НК. Установлено, что для гомодимеров с коротким линкером (К_1-К_5) в комплексах с дсДНК интенсивность флуоресценции намного ниже, чем для мономерного красителя Cyan 40. Это, скорей всего, обусловлено тем, что короткие линкеры красителей К-1-К-5 не позволяют образовывать бисинтеркаляционные комплексы с дсДНК. Касательно влияния химической природы линкера на свойства комплексов красителей с НК установлено, что присутствие аминогруппы в линкере приводит к увеличению интенсивности излучения комплексов. Для исследованных гомо-n-мерных цианинов с длинным линкером (К-6, К-7, К-8, К-9, К-Т, К_СТ) излучение увеличивается в 450-2600 раз для ДНК и в 600-2300 раз для РНК на длине волны излучения мономерной формы.

Проведено ряд спектральных исследований по установлению возможного механизма взаимодействия синтезированных n-мерных красителей с НК. Данные флуоресцентной титровки нуклеиновыми кислотами гомо-n-мерных цианиновых красителей, исследование спектров линейного дихроизма комплексов краситель-НК и изучение спектрально-люминесцентных свойств гомо-n-мерных цианиновых красителей в присутствии синтетических полинуклеотидов poly(dA/dT) и poly(dGC/dGC), говорят о том, что превалирующим механизмом взаимодействия исследованных красителей с НК является “подобный к интеркаляционному механизм фиксации красителя в ДНК”.

Изучено влияние агрегационных процессов на спектрально-люминесцентные свойства комплексов гомо-n-мерных цианиновых красителей с НК. Показано, що прохождение агрегационных процессов значительно увеличивает чувствительность детекции за счет повышения соотношения сигнал/шум при флуоресцентной детекции на длине волны излучения мономерной формы красителя. Исходя из полученных данных, в ряду мономер-гомодимер-гомотример прослеживается прямая зависимость увеличения интенсивности флуоресценции при взаимодействии с НК от увеличения способности к агрегатооброзованию в свободном состоянии. Использование красителей с высокой способностью к агрегатообразованию в свободном состоянии позволяет достичь очень высоких показателей увеличения интенсивности флуоресценции при взаимодействии с НК. Таким образом, для конструирования новых флуоресцентных зондов для детекции НК в гомогенных системах можно использовать красители со средней интенсивностью излучения в свободном состоянии, но с увеличенной способностью к агрегатробразованию.

Проведено компьютерное моделирование геометрической структуры и расчеты электронных переходов агрегатов гомо-n-мерных монометиновых цианинов. Квантово-химическими рассчетами подтверждена возможность существования межмолекулярных агрегационных комплексов, образованых взаимодействием трех хромофоров, два из которых принадлежат одной молекуле. Исследования показали, что полученные гомо-n-мерные монометинцианины, при использовании их для визуализации НК в условиях гель-электрофореза производят меньшее размывание полос ДНК в сравнении с широко используемым бромистым этидием, обеспечивая при этом практически одинаковую чувствительность детекции. Таким образом, исследованные цианиновые красители могут быть с успехом использованы в качестве флуоресцентных зондов для определения НК в растворе и при електрофорезе в агарозном геле.

Ключевые слова: гомо-n-мерные цианиновые красители, флуоресцентные зонды для детекции нуклеиновых кислот, агрегация, компьютерное моделирование, спектрально-люминесцентные методы.



Kocheshev I.O. Synthesis and study of physics-chemical properties of homo-n-mer monomethyne cyanine dyes - highly efficient fluorescent probes for nucleic acids detection.- Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) in Chemistry, speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. - Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

Three new methods of synthesis of homo-n-mer monomethyne dyes were proposed. The series of new homodimeric cyanines and homotrimeric monomethyne cyanines were first synthesized. The peculiarities of the interaction of the obtained homo-n-meric cyanine dyes with DNA were studied with spectral-luminescent methods. The influence of aggregation processes on spectral-luminescent properties of complexes of homo-n-meric cyanine dyes with NA was investigated. It was shown that the aggregation processes significantly increase the sensitivity of detection due to the enhance in the signal-to-noise ratio when the fluorescent detection is performed at the wavelength of the dye monomer form emission. The computer simulation of the geometry structure of aggregates of homo-n-meric monomethyne cyanine dyes and the calculations of the electronic transitions in these aggregates were carried out. The quantum-chemical calculations confirmed the possibility of existence of intermolecular aggregate complexes formed by the interaction of three chromophores two of which belong to the same molecule. It was shown that the studied cyanine dyes can be successfully used as fluorescent probes for the NA detection in solution and in electrophoresis in agarose gel.

Key words: homo-n-meric cyanine dyes, fluorescent probes for nucleic acids detection, aggregation, computer simulations, spectral-luminescent methods.



Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Розвиток існуючих та розробка нових спектральних методів детекції нуклеїнових кислот (НК) вимагає створення флуоресцентних зондів з високими константами зв'язування та специфічністю. Відомо, що використання хімічно кон'югованих n-мерних поліінтеркаляторів значно підвищує стабільність їхніх комплексів з НК та квантовий вихід флуоресценції. Серед ціанінових поліінтеркаляторів відомі лише димерні похідні. Найбільш широковживаними в лабораторній практиці є бісінтеркалюючі гомодимерні монометинціанінові барвники TOTO (1,1^/-(4,4,7,7-тетраметил-4,7-діазоундекаметилен)-біс-4-[3-метил-2,3-дигідро-(бензо-1,3-тіазол)-2-метиліден]- хінолін тетрайодид) та YOYO (1,1^/-(4,4,7,7-тетраметил-4,7-діазоундекаметилен)-біс-4-[3-метил-2,3-дигідро-(бензо-1,3-оксазол)-2-метиліден]- хінолін тетрайодид). Чутливість визначення НК за допомогою гомодимерів асиметричних ціанінів практично зрівнялася з чутливістю радіоізотопних методів та набагато перевищує чутливість детекції з використанням традиційного гомодимеру бромистого етидію. Таким чином, синтез нових гомо-n-мерних ціанінових барвників з метою одержання нових ефективних флуоресцентних зондів для детекції НК є актуальним завданням.

Для синтезу гомодимерних похідних монометинціанінових барвників використовувався тільки метод алкілування N,N,N^/,N^/-тетраметилдіаміноалканів йодалкільними похідними ціанінових барвників. Тому існує необхідність пошуку та розробки нових, більш простих та ефективних методів отримання гомо-n-мерних ціанінових барвників. Необхідно також відмітити, що систематичні дослідження впливу природи лінкера на спектральні властивості комплексів гомо-n-мерних барвників з НК практично не проводились.

Ціанінові барвники, як правило, утворюють молекулярні асоціати як у вільному стані, так і в присутності НК. Традиційно вважається, що агрегація барвників є процесом, який негативно впливає на спектрально-люмінесцентні властивості зондів, що використовуються для детекції та мічення біомолекул. Однак вплив агрегації на флуоресцентні властивості димерів у комплексах з НК практично не вивчався. Тому дослідження цих процесів із залученням сучасних фізико-хімічних методів вкрай необхідне для розуміння загальних закономірностей впливу агрегатоутворення на взаємодію барвників з НК, а відтак - цілеспрямованого конструювання високоефективних зондів для кількісного та якісного визначення НК.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках державної бюджетної теми ІМБіГ НАН України “Синтез та вивчення механізму взаємодії ціанінових флуоресцентних зондів з нуклеїновими кислотами” № 2.2.4.16 за 1997-99 рр. ( № держ. реєстрації: 0197U004292).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала в синтезі нових гомо-n-мерних монометинціанінових барвників, вивченні їхньої взаємодії з НК за допомогою спектрально-люмінесцентних методів та з'ясуванні впливу процесів агрегації гомо-n-мерних ціанінів на флуоресцентні властивості їхніх комплексів з НК.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

· розробити нові методи синтезу гомо-n-мерних монометинціанінових барвників;

· синтезувати нові гомодимерні та гомотримерні монометинціанінові барвники з різними за довжиною та хімічною природою лінкерами;

· вивчити спектрально-люмінесцентні характеристики синтезованих барвників у вільному стані та в присутності НК;

· вивчити агрегацію гомо-n-мерних монометинціанінових барвників, яка супроводжує утворення комплексів барвників з ДНК;

· провести комп'ютерне моделювання геометричної структури агрегатів гомо-n-мерних монометинціанінових барвників та розрахувати електронні переходи, що виникають в цих агрегатах;

· вивчити можливості візуалізації НК в агарозних гелях за допомогою гомо-n-мерних ціанінових барвників.

Наукова новизна одержаних результатів. Запропоновано нові методи синтезу гомо-n-мерних монометинціанінових барвників. Синтезовано низку нових гомодимерних монометинціанінових барвників. Вперше синтезовано гомотримерні монометинціанінові барвники. Досліджено агрегаційні процеси гомо-n-мерних монометинціанінових барвників у вільному стані та в присутності НК за допомогою спектрально-люмінесцентних методів. Вперше показано, що агрегація гомо-n-мерних монометинціанінових барвників є фактором, що суттєво підвищує чутливість детекції НК. За допомогою комп'ютерних розрахунків проведено моделювання геометричної структури агрегатів гомо-n-мерних монометинціанінових барвників та розрахунок електронних переходів, що виникають в цих агрегатах. Проведено апробацію найбільш перспективних барвників для візуалізації НК в агарозних гелях.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновані варіанти синтезу гомо-n-мерних монометинціанінових барвників дають змогу отримувати широкий ряд нових флуоресцентних зондів для детекції біомолекул. Висновок щодо підвищення чутливості флуоресцентної детекції за рахунок агрегації є важливим при конструюванні нових чутливих зондів для кількісного та якісного визначення НК. Встановлено, що гомодимерний монометиновий ціаніновий барвник К-6 та гомотримерні монометинціанінові барвники К-Т та К-СТ є високочутливими флуоресцентними зондами для детекції НК і мають перспективу практичного застосування.

Особистий внесок здобувача. Основний об'єм експериментальної роботи, обробка і аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані здобувачем одноосібно. Частину експериментальних досліджень проведено у співпраці з науковим співробітником відділу структури і функцій нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України к.б.н. Ковальською В.Б., інженером кафедри експериментальної фізики фізичного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка Огульчанським Т.Ю. та аспірантом Лосицьким М.Ю. В постановці задачі і обговоренні результатів дослідження брали участь наукові керівники.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідалися на Міжнародній конференції з органічної хімії (Харків, 1995), на 8 Європейській конференції з спектроскопії біологічних молекул (Holland, Enschede 1999), на XV Науковій конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, 2000), а також на наукових семінарах відділу структури і функцій нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті в наукових фахових журналах та 6 тез доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 145 сторінках друкованого тексту. Вона складається зі вступу, основної частини (огляд літератури, матеріали і методи, обговорення результатів) та підсумкових висновків. Перелік цитованої літератури налічує 108 найменувань. Робота містить 34 рисунки, 15 схем та 9 таблиць.

Основний зміст роботи

В першому розділі дисертації представлено огляд літератури про особливості взаємодії різноманітних поліінтеркаляторів (біс- та полі- акридинів, фенантридинів, антрациклінових препаратів) з НК. Розглянуто відомі механізми взаємодії барвників з НК та вплив природи і структури хромофору барвника на властивості утвореного комплексу. Описано дослідження щодо впливу довжини лінкера поліінтеркаляторів на механізм взаємодії барвника з НК. Вважається, що взаємодія відбувається за інтеркаляційним механізмом згідно з принципом виключення сусідніх пар основ, а лінкер, що має більше 12 атомів вуглецю, є оптимальним для бісінтеркаляції.

Взаємодія поліінтеркаляторів з НК супроводжується різноманітними процесами, такими як кріпінг (переміщення поліінтеркалятора вздовж ДНК), інтрамолекулярне зв'язування (“зшивка” двох молекул ДНК димерними барвниками) та агрегація. Традиційно вважається, що вищезгадані процеси негативно впливають на властивості барвників як зондів для детекції НК.

За даними літератури синтез димерних похідних до цього часу проводився, в основному, за допомогою алкілування аліфатичних діамінопохідних галогеналкільними похідними барвника. Як альтернатива нами запропоновано декілька перспективних реакцій, що можуть бути використані для синтезу гомодимерних ціанінових барвників. Серед них реакція пірилоціанінів з первинними амінами; реакції з використанням активованих ефірів або імідазолільних похідних ціанінових барвників для кон'югації похідних ціанінових барвників до біомолекул.

Другий розділ присвячено опису матеріалів та методів досліджень. Наведено методики синтезу та умови проведення спектральних експериментальних досліджень. Проведено аналіз похибок вимірювань.

В третьому розділі наведено синтез гомо-n-мерних монометинціанінів, аналіз спектрально-люмінесцентних досліджень, обговорення особливостей впливу агрегаційних процесів на флуоресцентні властивості комплексів гомо-n-мерних барвників з НК та результати комп'ютерних розрахунків і апробації барвників як зондів для детекції ДНК в умовах гель-електрофорезу.

Синтез гомо-n-мерних ціанінових барвників.

Як правило, димери ціанінових барвників синтезують одним методом - алкілуванням N,N,N^/,N^/-тетраметилдіаміноалканів йодалкільними похідними ціанінових барвників, отримуючи гомодимер з лінкером довжиною 10-16 вуглецевих атомів з двома позитивно зарядженими четвертинними атомами азоту в ланцюзі. Пошук нових підходів для отримання гомодимерних ціанінів, лінкери яких суттєво відрізняються за хімічним складом та будовою, був одним з предметів нашого дослідження. Ми використали три нові методики, що дозволили синтезувати низку гомо-n-мерних піридинієвих ціанінових барвників з лінкерами, що різняться хімічною природою та довжиною.

Перший використаний нами метод синтезу ціанінових гомодимерів полягав у застосуванні реакції пірилієвих солей з первинними амінами. За допомогою цієї реакції було синтезовано гомодимерні барвники з короткими та середньої довжини лінкерами. Реакцію проводили кип'ятінням ціанінового барвника Cyan 39 з діаміном в ДМФА протягом 1-2 год. Продукт осаджували спиртом і перекристалізовували із суміші ДМФА-спирт (1:2). Вихід становив від 40 до 60%. Синтез барвників з гетероатомами в аліфатичному ланцюгу вимагає більше часу в порівнянні з синтезом гомодимерів з аліфатичним лінкером та проходить з меншими виходами. Спроби отримати гомодимери з лінкером, що містив менше 5 атомів вуглецю не увінчалися успіхом.

В реакціях етилендіаміну, 1,3-діамінопропану та 1,4-діамінобутану з 10-кратним надлишком Cyan 39 нами було отримано лише монопохідні. На нашу думку, такі результати можна пояснити наявністю просторових ускладнень. В той же час первинні діаміни, між аміногрупами яких знаходиться більше п'яти атомів вуглецю, реагують з пірилієвим ядром Cyan 39 з утворенням піридинієвих ціанінових гомодимерів навіть при надлишку діаміну (барвники К-1 та К-2).

Другий підхід полягав у використанні реакції ацилювання поліамінів карбоксильним похідним ціанінового барвника Cyan 39 - барвником CyanAcp. Як конденсуючі реагенти були використані ДЦГК та КДІ. Спочатку в ДМФА отримували активований ефір барвника CyanAcp, після чого додавали відповідний поліамін і перемішували реакційну суміш протягом доби. Як правило, продукт висаджували водою і перекристалізовували із суміші ДМФА зі спиртом. Виходи гомодимерних барвників знаходяться в межах 56-61%. З допомогою ДЦГК та КДІ нами було вперше синтезовано гомотримерні ціанінові барвники К-Т та К-СТ з виходами 59 та 65% відповідно. Реакція ацилювання з використанням конденсуючого реагенту КДІ в практичному плані є зручнішою, ніж реакція з використанням ДЦГК з ОБТ, проте за допомогою цієї реакції вдалося отримати тільки барвник К-СТ. У випадку синтезу К-8 та К-9 вихід продукту був мізерним, і його не можна було очистити від домішок вихідної речовини. Спроба отримати за допомогою КДІ барвник К-Т була теж невдала.

Схема 1. Синтез гомодимерних піридинієвих ціанінових барвників реакцією амінів з ізоціанатами

Третій метод полягав у використанні реакції діізоціанатів з амінопохідними барвників (Схема 1). За його допомогою було синтезовано гомодимерний барвник К-10 з конфігураційно жорстким лінкером. Амінопохідне ціанінового барвника - CyanPh та діізоціаніт розчиняли в сухому ДМФА та залишали на добу при кімнатній температурі. Продукт осаджували водою та перекристалізовували із суміші ДМФА-спирт (1:2). Вихід становив 63%.

Варто зауважити, що за допомогою запропонованих нами методів можна отримати широкий спектр різноманітних гомо-n-мерних ціанінових барвників.

Спектрально-люмінесцентні властивості гомо-n-мерних монометинціанінових барвників.

Досліджено спектрально-люмінесцентні властивості синтезованих гомо-n-мерних монометинціанінових барвників та їхніх комплексів з ДНК та РНК. Їхні спектральні характеристики подано в Таблиці 1. Всебічно досліджений мономерний барвник Cyan 40 наводиться для порівняння.

Максимуми поглинання барвників в апротонному ДМФА розташовані на 445-449 нм. В більш полярному водному буфері ціаніни утворюють агрегати, про що свідчить поява додаткових короткохвильових смуг в спектрах поглинання вільних барвників на 409-430 нм. Причому, необхідно відмітити, що інтенсивність додаткових смуг поглинання перевищує інтенсивність основної (молекулярної) смуги поглинання.

Максимуми в спектрі флуоресценції вільних гомо-n-мерів, як і мономерного Cyan 40 в апротонному ДМФА розташовані в інтервалі 480-486 нм. При переході до водного буфера максимуми випромінювання гомо-n-мерних барвників зсуваються в довгохвильову область і розташовуються в районі 515-591 нм. У мономерного Cyan 40 максимум випромінювання залишається в області 480 нм. Такі дані пояснюються тим, що у водному буфері у гомо-n-мерних барвників спостерігається випромінювання агрегатних форм на іншій довжині хвилі порівняно з мономерною формою.

Таблиця 1 - Спектрально-люмінесцентні характеристики гомо-n-мерних монометинціанінових барвників та їхніх комплексів з НК в буфері 50mM Tріс-HCl, pH 7,5

Назва	Структура барвника*	В буфері	В присутності ДНК	В присутності РНК
		ем,нм	абс,нм	ем,нм	І, в.о.	абс,нм	ем,нм	вв.о.
К-1		515	401 424 447	485	6,0	410 431 450	485	11,7
К-2		591	402 420 448	482	4,7	402 419 450	484	17,6
К-3		554	424 451	496	6,1	423 451	498	3,1
К-4		531	403 430 455	495	32,1	400 433 451	489	12,2
К-5		540	428 455	493	12,2	402 438 452	493	49,3
К-6		578	401 429 450	484	108	411 429 445	485	40,3
К-7		575	427 449	484	60,1	415 445	486	18,3
К-8		570	404 432 454	483	83,6	427 452	483	50,3
К-СТ		552	403 431 447	484	64,5	428 444	486	23,1
К-Т		565	404 434 447	485	50,8	411 425 448	487	24,4
К-9		570	409 434 447	483	43,8	433 440	484	16,5
К-10		580	409 434 448	484	20,5	409 433 449	485	11,0
Cyan 40		478	437	480	59,8	437	482	67,3

Встановлено, що для гомодимерів з коротким лінкером (К_1-К_5) в комплексах з ДНК інтенсивність флуоресценції набагато нижча, ніж для мономерного ціанінового барвника Cyan 40. На нашу думку, короткі лінкери барвників К-1-К-5 не дозволяють утворювати бісінтеркаляційні комплекси з дсДНК. Згідно з бісінтеркаляційним механізмом взаємодії лінкери гомодимерів, що мають довжину меншу ніж 12 атомів вуглецю, не дозволяють утворювати бісінтеркаляційні комплекси з ДНК. На відміну від дсДНК значне підвищення інтенсивності флуоресценції для РНК досягається при довжині лінкера 5 атомів. Це узгоджується з моделлю “взаємодії, подібної до часткової інтеркаляції” ТОТО в односпіральну ДНК, запропонованою A.Глайзером.

Гомодимерний барвник з жорстким в конформаційному сенсі лінкером К-10 має досить низьку інтенсивність флуоресценції в комплексах з НК у порівнянні з гомодимерними барвниками з менш “жорсткими” ланцюгами - К-6 та К-9, та барвниками з довгим аліфатичним лінкером К-7, К-8. Очевидно, занадто жорсткий лінкер цього барвника, що має ароматичну природу, утруднює реалізацію бісінтеркаляційного механізму зв'язування з НК. Хоча досить широке і детальне дослідження акридинових гомо-n-мерних барвників з жорсткими ароматичними лінкерами показало, що вони теж можуть взаємодіяти з НК за бісінтеркаляційним

механізмом. Тому ми не відкидаємо ймовірність того, що агрегати, утворені даним барвником, дуже стійкі і при взаємодії з ДНК руйнується тільки незначна їхня частина з утворенням вільної флуоресцентної форми барвника. Барвник К-9, в лінкері якого знаходиться фенольний фрагмент, також має рівень інтенсивності випромінювання комплексів з НК нижчий за К-7 та К-8. Можна було б стверджувати, що жорсткість лінкера негативно відображається на інтенсивності випромінювання комплексу барвник-НК, але барвник К-6, в лінкері якого знаходиться фрагмент піперазину, виявив найвище зростання інтенсивності флуоресценції при взаємодії з НК. Слід додати, що природа лінкера К-6 не сприяє агрегації барвника на відміну від ароматичної природи лінкерів барвників К-9 та К_10.

Стосовно впливу хімічної природи лінкера на властивості комплексів барвників з НК ми встановили, що аміногрупа в лінкері підвищує інтенсивність випромінювання комплексів з НК. Це може бути пояснено тим, що аміногрупи, вступаючи в електростатичну взаємодію з негативно зарядженими фосфатними групами НК, підвищують стабільність комплексу барвник-НК.

Проведено також ряд спектральних досліджень щодо встановлення можливого механізму взаємодії синтезованих n-мерних барвників з НК. Флуоресцентне титрування нуклеїновими кислотами гомодимерного барвника з довгим гнучким лінкером (К-8), гомодимерного барвника з довгим, але більш жорстким в конформаційному сенсі лінкером (К-6) та гомотримерного барвника (К-Т) показали, що насичення інтенсивності флуоресценції комплексів К_6, К-Т з ДНК настає при співвідношенні одна молекула барвника на 20 пар основ, а для барвника К_8 - на 16 пар основ. Оскільки при титруванні барвників НК максимуми насичення інтенсивності флуоресценції для гомодимерних та гомотримерного ціанінів практично збігаються, то можна припустити, що гомотримерний барвник К-Т зв'зується з НК тільки двома хромофорами.

Дослідження спектрів лінійного дихроїзму гомотримерного барвника К-Т, гомодимерного барвника К-6 та мономерного Cyan 40 (Рис.1.) та їхній аналіз показали, що площини молекул хромофорів барвників у комплексах з дсДНК розташовані перпендикулярно до довгої осі дсДНК, яка у даному випадку грає роль макроскопічної осі орієнтації (величина LD^r є від'ємною). Таке розташування хромофорів свідчить про наявність подібного до інтеркаляційного механізму фіксації барвника в ДНК.

В літературі існують дані про можливість борозенкового механізму фіксації ціанінових барвників на НК. Відомо, що при взаємодії з НК інтеркалятори проявляють більшу специфічність до GC-збагачених ділянок, а речовини, що взаємодіють за борозенковим механізмом - до АТ_збагачених ділянок відповідно. Нами було вивчено спектрально- люмінесцентні властивості гомодимеру К-6 та гомотримеру К-СT у присутності синтетичних полінуклеотидів poly(dA/dT) та poly(dGC/dGC). Отримані дані продемонстрували, що гомо-n-мерні ціанінові барвники практично однаково взаємодіють з обома полінуклеотидами. Таким чином, ми не можемо повністю виключити можливість борозенкового зв'язування для синтезованих гомо-n-мерних ціанінів, хоча переконливих доказів існування такого механізму взаємодії ми не знайшли.

Агрегація гомо-n-мерних ціанінових барвників у присутності НК та її вплив на флуоресцентні властивості.

Відомо, що наявність додаткових короткохвильових максимумів у спектрах поглинання барвників свідчить про утворення агрегатів, що включають в себе різну кількість молекул мономерного барвника. В спектрах поглинання гомо-n-мерних барвників крім максимуму поглинання мономера барвника спостерігаються два додаткових максимуми в короткохвильовій області, що на нашу думку, свідчить про утворення Н-агрегатів двох типів. Більш короткохвильовій смузі відповідає агрегат, в якому взаємодіють три і більше хромофорів, а менш короткохвильовій смузі поглинання - агрегат, в якому взаємодіють тільки два хромофори.

Дослідження спектрів флуоресценції та збудження флуоресценції гомодимерних ціанінів показали, що у водному розчині у вільному стані спостерігається сумарне випромінювання агрегатів з різною кількістю хромофорів і практично відсутнє випромінювання мономерної форми барвників. При взаємодії з НК агрегати руйнуються і в спектрах випромінювання спостерігається інтенсивний мономерний максимум. Чутливість детекції визначається співвідношенням інтенсивностей випромінювання зв'язаної до незв'язаної форми барвника. Процеси агрегації значно знижують рівень флуоресценції вільного барвника і, як наслідок, підвищують співвідношення сигнал/шум. Різниця між положеннями максимумів випромінювання агрегованого і вільного барвника становить близько 100 нм (Таблиця 1). Таким чином, для досліджених гомодимерних ціанінів з довгим лінкером (К-6, К-7, К-8, К-9, К-Т, К_СТ) підвищення випромінювання становить 450-2600 разів для ДНК та 600-2300 разів для РНК на довжині хвилі випромінювання мономерної форми.

Загальноприйнято, що надзвичайно висока чутливість детекції НК гомодимерними ціаніновими барвниками в порівнянні з мономерними ціанінами зумовлена трьома факторами: більше ніж 1000-кратним підвищенням квантового виходу флуоресценції при взаємодії з НК, практично відсутньою флуоресценцією у вільному стані та високим коефіцієнтом зв'язування з НК. Нами вперше показано, що суттєвий внесок у високу чутливість детекції вносить саме наявність агрегаційних процесів.

Ми синтезували гомотримерні монометинціаніни для того, щоб мати в своєму розпорядженні барвник з вищою, ніж у димерних похідних, здатністю до агрегатоутворення. Дійсно, спектроскопічні дані свідчать про те, що барвники К-Т та К-СТ більше схильні до утворення міжмолекулярних асоціатів у порівнянні з мономерними та гомодимерними барвниками. На Рис.3 для порівняння наведено спектр випромінювання мономерного та гомотримерного ціанінових барвників. Здатність до агрегації у мономерного барвника набагато нижча, ніж у тримера, і у вільному стані у водному буфері ми спостерігаємо досить інтенсивний мономерний пік, в той час, як у тримерного барвника спостерігається випромінювання агрегаційних структур. При взаємодії з НК в спектрах випромінювання обох барвників спостерігається інтенсивний молекулярний пік, але саме за рахунок агрегатоутворення величина підвищення інтенсивності випромінювання у гомотримера на порядок перевищує ту ж величину для мономерного барвника.

В Таблиці 2. представлено результати флуоресцентних досліджень мономерного ціаніновго барвника Cyan 40, гомодимерного ціаніну К-6 та гомотримера К-Т. Не важко побачити, що хоч інтенсивність флуоресценції комплексу гомодимер-НК набагато перевищує інтенсивність випромінювання комплексу гомотример-НК, проте величина підвищення інтенсивності флуоресценції у гомотримерного барвника при взаємодії з НК майже в два рази перевищує ту ж величину для гомодимера. Таким чином, просліджується пряма залежність підвищення інтенсивності флуоресценції при взаємодії з НК від збільшення здатності до агрегатоутворення в ряду мономер-димер-тример (Cyan 40 - К-6 - К-Т).

Отже, можна стверджувати, що наявність агрегаційних процесів сприяє підвищенню чутливості детекції НК. Використання барвників з високою здатністю до агрегації у вільному стані дозволяє досягати найвищих показників підвищення інтенсивності флуоресценції при взаємодії з НК. Таким чином, для конструювання нових флуоресцентних зондів для детекції НК в гомогенних системах можна використовувати барвники з середньою інтенсивністю випромінювання у вільному стані, але з підвищеною здатністю до утворення агрегатів.

Комп'ютерне моделювання геометричної структури агрегатів гомо-n-мерних монометинових ціанінів та квантово-хімічні розрахунки електронних спектрів

Для підтвердження адекватності запропонованих структур агрегаційних комплексів нами проведено квантово-хімічні розрахунки електронних переходів для агрегатів, що складаються з двох та трьох молекул бензтіазолпіридинієвого ціаніну Cyan 40, що є базовим для серії представлених гомо-н-мерних барвників.

Відомо, що утворення агрегату супроводжується розщепленням енергетичних рівнів і відповідною зміною електронних переходів. За результатами розрахунків ми одержали картину, подібну до тієї, яку спостерігали у відповідних експериментально отриманих спектрах: смуги поглинання агрегату мали гіпсохромний зсув порівняно зі смугою вільного барвника (Рис.4). Відомо, що розрахункові величини довжин хвиль електронних переходів, отримані за допомогою квантово-хімічного методу ZINDO/S, реалізованого в пакеті програм Hyperchem 5.01, є дещо заниженими, що спричинено тим, що при розрахунках не береться до уваги вплив середовища. Але ці величини корелюють з експериментальними даними з урахуванням коефіцієнту, який для ціанінових барвників знаходиться в межах від 1,15 до 1,25. Для розрахованих максимумів агрегаційних (=360нм, =341нм, =335нм) та мономерної (=384 нм) смуг серії гомо-н-мерних ціанінових барвників цей коефіцієнт знаходиться в межах від 1,15 до 1,17, а для їхніх комплексів з ДНК варіював від 1,18 до 1,22. Таким чином, коефіцієнт кореляції між розрахованими та експериментальними довжинами хвиль електронних переходів знаходиться в межах, характерних для цього класу барвників, що підтверджує коректність проведених розрахунків.

Суттєвим фактором, що зумовлює формування того чи іншого типу агрегатів, є гнучкість та рухомість лінкера, який з'єднує хромофори барвника. Особливо це важливо при утворенні міжмолекулярних агрегаційних структур, що включають в себе два хромофори однієї молекули барвника та один хромофор іншої (Рис.2). Тому ми вважали за необхідне визначити, чи достатньо лабільним є лінкер з “жорстким” фрагментом для формування потрійних міжмолекулярних асоціатів. Для моделювання подібного комплексу ми використали гомодимерний ціаніновий барвник К-6, що містить у лінкері досить жорсткий піперазиновий фрагмент. На Рис.5. наведено геометричну структуру потрійного комплексу барвника К-6, геометрія якої була оптимізована методом ММ+. Розраховані відстані між хромофорами знаходяться в межах від 3,75 A до 3,87 A. Виходячи з отриманих результатів, ми вважаємо вірогідним можливість формування гомодимерними та гомотримерними ціаніновими барвниками міжмолекулярних агрегаційних комплексів, утворених взаємодією трьох хромофорів, два з яких належать одній молекулі.

Проведені розрахунки модельних структур добре узгоджуються з експериментальними даними, що і дає змогу говорити про адекватність запропонованих нами агрегаційних структур з реально існуючими асоціатами гомо-n-мерних ціанінових барвників.

Використання гомо-n-мерних ціанінових барвників для візуалізації НК в умовах гель_електрофорезу.

Для візуалізації НК в агарозному гелі нами було вибрано найефективніші гомо-n-мерні ціаніни K-T та K_6. Ці барвники утворюють з НК комплекси, що мають флуоресцентне забарвлення зеленого кольору. Для порівняння використовувався широковживаний в лабораторній практиці бромистий етидій (EtBr), комплекс якого з ДНК має флуоресцентне забарвлення червоного кольору.

Фарбування НК проводили двома способами: витримуванням гель-пластини після проведення електрофорезу протягом 30 хвилин в окремих ванночках в розчинах ціанінових барвників або EtBr та безпосередньо додаючи барвник в агарозний гель при його приготуванні, проводячи електрофорез НК у забарвленому гелі.

Як при процедурі інкубації геля в розчині барвника, так і при безпосередньому додаванні барвників до агарозного гелю при його приготуванні характер забарвлення НК був схожий. Детекція з використанням як джерела опромінення трансілюмінатора з довжиною хвилі 312 нм показала, що досліджені ціанінові барвники та EtBr приблизно з однаковою інтенсивністю забарвлюють НК. Ціанінові барвники однаково ефективно забарвлюють кільцеву плазмідну дволанцюгову ДНК (Рис.6., доріжки 1-3), лінійну дволанцюгову ДНК (доріжки 4-6), а також РНК (доріжки 7-9). Проведені дослідження показали, що гомо-n-мерні ціанінові барвники спричинюють менше розмивання смуг ДНК порівняно з бромистим етидієм, забезпечуючи при цьому практично однакову чутливість. Окрім того, фонова флуоресценція агарозної пластини, забарвленої ціаніновими барвниками, є помітно нижчою в порівнянні з аналогічною фоновою флуоресценцією бромистого етидію.

Відомо, що деякі гомо-n-мерні ціанінові барвники утворюють стійкі в умовах електрофорезу комплекси з НК, але при попередньому фарбуванні спричиняють подвоєння смуги ДНК під час її електричного фракціонування. Логічно було б припустити, що отримані нами гомо-n-мерні ціанінові барвники мають подібні властивості. Проте після попереднього фарбування, інкубації та проведенні електрофорезу при опромінюванні гелю ультрафіолетом флуоресцентно забарвленої ДНК виявлено не було. Отже, отримані нами барвники не утворюють стабільних комплексів з ДНК, які могли б залишатися інтактними під час електрофорезу.

На жаль, відсутність належного обладнання, а саме - інтенсивного джерела світла з довжиною хвилі ~450нм , що дало б змогу проводити збудження флуоресценції власне на довжині хвилі поглинання отриманих барвників, не дозволило провести детального дослідження поведінки останніх при детекції НК в агарозному гелі та визначити поріг її чутливості. Але навіть з використанням існуючого обладнання досліджені ціанінові барвники можуть бути успішно використані для загальних робіт по візуалізації НК в агарозному гелі.

Дані щодо визначення порога чутливості детекції ДНК в розчині, проведені методом послідовних розведень суміші барвник-НК в буфері 50mM Tріс -HCl, pH 7,5 при співвідношенні один хромофор на 6 пар основ ДНК, показали, що для базового мономерного барвника Cyan40 поріг чутливості становить 510^-5, для гомодимерного К-6 - 7,510^-9 , а для гомотримеру К-СТ - 1,210^-7 моль ДНК.



ВИСНОВКИ

Запропоновано три нові варіанти синтезу ціанінових гомо-n-мерних барвників: на основі реакції пірилієвих солей з первинними амінами, реакції ацилювання ді- та триамінів карбоксильним похідним ціанінового барвника та взаємодії амінопохідних ціанінового барвника з діізоціанатом. Отримано дванадцять нових гомо-n-мерних монометинових ціанінів. Вперше синтезовано гомотримерні ціанінові барвники.

Досліджено спектрально-люмінесцентні характеристики всіх синтезованих барвників у вільному стані та в присутності НК. Вивчено особливості агрегації гомо-n-мерних ціанінових барвників при взаємодії з нуклеїновими кислотами.

Показано, що агрегаційні процеси не заважають флуоресцентній детекції нуклеїнових кислот, а навпаки, є суттєвим фактором, що зумовлює високу чутливість детекції ДНК гомо-n-мерними монометинціаніновими барвниками.

На основі квантово-хімічних розрахунків запропоновано сендвічеву модель агрегаційних структур гомо-n-мерних ціанінових барвників. Теоретичні розрахунки електронних спектрів поглинання на основі побудованих моделей узгоджуються з експериментально отриманими даними.

Встановлено, що барвники К-6, К-Т та К-СТ мають високу чутливість визначення ДНК в розчині та в гель-електрофорезі на агарозному гелі і можуть бути рекомендовані для практичного застосування.



ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ

ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кочешев І.О., Ковальська В.Б., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 11. Синтез та спектральні властивості нових 2,6-диметил-4-[(3-метил-1,3-бензтіазол-3-іум-2-їл)метилен]-1,4-дигідро-1-піридинієвих гомодимерних ціанінових барвників// Біополімери і клітина. - 1999. - 15, №5. - С.449-455.

2. Кочешев І.О., Ковальська В.Б., Ярмолюк С.М., Акерман Б., Мацука Г.Х. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 15. Спектрально-люмінесцентні властивості нових бензотіазолметилен-2,6-диметилпіридинієвих гомодимерних та гомотримерних ціанінових барвників та їхніх комплексів з нуклеїновими кислотами// Біополімери і клітина. - 1999. - 15, №6. - С.557-567.

3. Ogulchansky T. Yu. , Yashchuk V. M. , Losytsky M. Yu. , Kocheshev I. O. , Yarmoluk S.M. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. XVII. Towards an aggregation of cyanine dyes in solution as a factor facilitating nucleic acid detection// Spectrochim. Acta, Part A: Biomol. Spectroscopy. - 2000. - 56. - P.805-814.

4. Кочешев І.О., Криворотенко Д.В. Криворотенко та С.М. Ярмолюк. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. ХIII. Синтез 2,6-диметил-4-[2-(3-метилбензотіазоліден)метил]-1-піридинієвих гомодимерних та гомотримерних ціанінових барвників// УХЖ. - 2001. - Т.67, №2. - С.43-45.

5. Kovalska V.B., Kocheshev I.A., Yarmoluk S.M. Synthesis and spectral properties of fluorescent homotrimere cyanine dye // Post-deadline papers 8^th European Conf. On the Spectroscopy of Biol. Mol. (ECSBM) - University of Twente - The Netherlands. - 1999. - P.19-20.

6. Kovalska V.B., Kocheshev I.A., Yarmoluk S.M. Possible aggregate structures formed by homodimeric cyanine dyes in nucleic acids presence // Post-deadline papers 8^th European Conf. On the Spectroscopy of Biol. Mol. (ECSBM) - University of Twente - The Netherlands. - 1999. - P.11-12.

7. Kocheshev I.A., Kovalska V.B., Yarmoluk S.M. Spectral properties of novel cyanine homodimere dyes as possible fluorescent probes for nucleic acids detection // Spectroscopy of biological molecules: new directions. 8^th ECSBM - Kluwer Academic Publishers. - Dordrecht/Boston/London. - 1999. - P.623-624.

8. Кочешев І.О., Ковальська В.Б., Ярмолюк С. М. Нові гомо-n-мерні монометинові ціанінові барвники для флуоресцентної детекції нуклеїнових кислот // Міжнародна конференція “Хімія азотовмісних гетероциклів”. Тези доповідей. - Харків : ХНУ, 2000. - С.231.

9. Kovalska V.B., Kocheshev I.O., Yarmoluk S.M. Studies and computer simulation of the aggregate structures of novel homo-n-mere benzothiazolopyridinium cyanine dyes // Biotechnology and environment scientific conference. Final program - Zagreb, Croatia. - 2001. - P.56-57.

10. Kocheshev I.O., Kovalska V.B. and Yarmoluk S.M. Using of homo-n-mere cyanine dyes for the visualization of nucleic acids in agarose gels // Biotechnology and environment scientific conference. Final program - Zagreb, Croatia. - 2001. - P.58-59.

Размещено на Allbest.ru

...