Ферментация

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФЕРМЕНТАЦИЯ, метаболический процесс, протекающий с выделением энергии, в результате которого молекулы сахара и крахмала без поступления воздуха разлагаются на углекислый газ и этанол (как при АНАЭРОБНОМ дыхании). Этот процесс катализируется при помощи энзимов. Обычно он протекает в микроорганизмах (прежде всего в дрожжах). Ферментация (иначе называемая брожением) применяется при изготовлении теста для хлеба, в виноделии и пивоваренном деле, а также для выдержки сыра. О том, что размятые фрукты, если их выдержать в теплом месте (благодаря чему начинается процесс брожения), выделяют одурманивающие вещества, было известно, вероятно, еще шесть тысяч лет назад.

Спиртовое брожение

Брожение (ферментация) - процесс разложения органических веществ, преимущественно углеводов, на более простые соединения под влиянием микроорганизмов или выделенных ими ферментов. Освобождающуюся при этом энергию микроорганизмы расходуют для своей жизнедеятельности, а продукты брожения используют для биосинтеза.

Важнейшими типами брожения являются: спиртовое (производство вина, пива, этилового спирта и др.), молочнокислое (производство кефира, кваса, силосование кормов, квашение овощей и др.), маслянокислое (происходит в заболоченных почвах, в испорченных консервированных продуктах), метановое.

Брожение может быть анаэробным (типичным) и аэробным (окислительным). К анаэробным процессам брожения относятся спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, пропионовокислое и другие виды брожений.

Спиртовое брожение вызывается многими дрожжами и некоторыми плесневыми грибами (например, мукоровыми). В результате брожения сахар расщепляется микроорганизмами и превращается в основной продукт - этиловый спирт, при этом выделяется углекислый газ и энергия.

Схема спиртового брожения:

сахар > этиловый спирт + углекислый газ + энергия

В небольших количествах образуются побочные продукты брожения: глицерин, уксусная кислота, уксусный альдегид, ацетальдегид и высшие спирты (бутиловый, изобутиловый, амиловый, изоамиловый и др.), получившие название сивушных масел. Их возникновение связано с разложением аминокислот, используемых дрожжами в качестве источника азота.

Спирт отделяют от сусла перегонкой, а затем очищают путем фракционной дистилляции. Для усиления роста дрожжей сусло вначале аэрируют, а затем создают анаэробные условия, чтобы обеспечить брожение, накопление спирта и предупредить окисление его в уксусную кислоту, а потом в воду и углекислый газ. Большинство дрожжей способно сбраживать моносахариды (глюкозу, фруктозу) и дисахариды (сахарозу, мальтозу).

Наиболее благоприятны для спиртового брожения концентрация сахара от 10 до 15%, рН 4-5, температура около +30 "С. Концентрация менее 10% неблагоприятна для брожения, а при концентрации сахара 30-35% оно приостанавливается.

Спиртовое брожение используется в производстве спирта, вина, пива, кваса, глицерина, в хлебопечении (для разрыхления теста), при получении кефира, кумыса и др. Самопроизвольно возникающее спиртовое брожение может быть причиной порчи сахаросодержащих продуктов: меда, варенья, соков, сиропов, компотов, ягод и др.

Молочнокислое брожение

Молочнокислое брожение вызывается молочнокислыми бактериями. Оно состоит в превращении Сахаров в молочную кислоту. Схема брожения следующая:

САХАР > МОЛОЧНАЯ КИСЛОТА + ЭНЕРГИЯ

При этом выделяется небольшое количество побочных продуктов (пировиноградная кислота и водород).

По характеру брожения различают две группы молочнокислых бактерий. Гомоферментативные (типичные) бактерии превращают приблизительно 90% лактозы в молочную кислоту с ничтожным содержанием побочных продуктов - СO2 или уксусной кислоты.

К типичным возбудителям молочнокислого брожения относятся кокковые и палочковидные бактерии, не образующие спор. К гомоферментативным молочнокислым бактериям принадлежат следующие: молочнокислый стрептококк, сливочный стрептококк, термофильный стрептококк, болгарская палочка, ацидофильная палочка, сырная палочка, дельбрюковская палочка и др.

Гетероферментативные (нетипичные) бактерии образуют примерно 50% молочной кислоты и наряду с ней 25% уксусной кислоты и этилового спирта, 25% углекислого газа. К ним относится кишечная палочка - постоянный обитатель кишечника человека и животных.

Молочнокислые бактерии в качестве источника азота используют аминокислоты или пептоны. Эти бактерии очень требовательны к витаминам и особенно к витамину В2 (лактофлавин). Источником углерода для них служат моносахариды (глюкоза, галактоза, левулоза), дисахариды (лактоза, сахароза, мальтоза), пентозы (арабиноза), многоатомные спирты, многоосновные кислоты и даже белки.

Молочнокислое брожение используется в молочной промышленности для изготовления простокваши, творога, сметаны, кефира, кислосливочного масла, ацидофильного молока и ацидофильной простокваши, сыров, квашеных овощей, при приготовлении хлебных заквасок, молочной кислоты. Молочнокислые бактерии широко применяют также при силосовании кормов, при выделке меховых шкурок и в производстве молочной кислоты.

Молочнокислое брожение может быть и причиной порчи некоторых продуктов: скисания молока, вина, «кислотного брожения» в консервах и др.

Маслянокислое брожение

Маслянокислое брожение вызывается маслянокислыми анаэробными бактериями, которые превращают многие углеводы (сахара, крахмал, декстрины, пектиновые вещества) и высшие спирты (маннит, глицерин) в масляную кислоту, образуя при этом углекислый газ, водород и энергию. Схема брожения следующая:

САХАР > МАСЛЯНАЯ КИСЛОТА + УГЛЕКИСЛЫЙ ГАЗ + ВОДОРОД + ЭНЕРГИЯ

Оптимальная температура для развития маслянокислых бактерий +30...40 °С. Маслянокислое брожение хорошо протекает при нейтральной реакции. Если оно идет в кислой среде, то накапливается бутиловый спирт и ацетон.

Маслянокислым брожением получают масляную кислоту, обладающую горьким вкусом и резким запахом. Она широко применяется в технике. Эфиры масляной кислоты имеют приятный запах цветов или фруктов и используются для приготовления ароматических эссенций в кондитерской промышленности и при производстве газированных напитков, а также в парфюмерной промышленности (например, метиловый эфир с яблочным запахом, этиловый эфир с грушевым запахом, амиловый - с ананасным).

В народном хозяйстве маслянокислое брожение может приносить значительный ущерб. Если маслянокислое брожение развивается в пищевых продуктах, то они приобретают неприятный запах и горький вкус. Часто это брожение вызывает гибель картофеля и овощей, вспучивание сыров, бомбаж консервов, прогоркание молока, творога, сметаны и др.



Другие виды брожения

Пропионовокислое брожение заключается в превращении сахара или молочной кислоты, а также ее солей в пропионовую и уксусную кислоты с выделением углекислого газа, воды и энергии. Это брожение вызывают пропионовокислые бактерии. По некоторым свойствам они близки к молочнокислым бактериям и часто развиваются вместе с ними. Оптимальная температура их развития +30...35 °С, рН не ниже 5.

Пропионовокислое брожение играет важную роль при созревании сыров: присутствие пропионовой и уксусной кислот в сыре обусловливает его своеобразные вкус и аромат. Пропионовая кислота и ее соли являются ингибиторами плесеней и могут быть использованы для защиты продуктов от плесневения.

Метановое брожение начинается с разложения сложных веществ (например, целлюлозы) до одно- или двухуглеродных молекул (СО, НСООН, СНСООН и др.), которое осуществляют микроорганизмы, живущие в симбиозе (сожительстве) с мета- нобразующими бактериями. Последние и синтезируют метан.

Метановое брожение встречается в заболоченных водоемах. Оно используется в промышленности и бытовых очистных сооружениях для обезвреживания органических веществ сточных вод. Образующийся при этом метан в смеси с С02 может применяться в качестве топлива.

К аэробным (окислительным) процессам брожения относятся биохимические реакции, вызываемые микроорганизмами и протекающие с участием кислорода воздуха. Примерами таких брожений может быть уксуснокислое и лимоннокислое.

Уксуснокислое брожение вызывается уксуснокислыми аэробными бактериями, которые превращают спирт (в слабых растворах) в уксусную кислоту, при этом выделяется вода и энергия. Схема брожения следующая:

ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ + КИСЛОРОД ---> УКСУСНАЯ КИСЛОТА + ВОДА + ЭНЕРГИЯ

На уксуснокислом брожении основано промышленное получение уксуса для пищевых целей. Вместе с тем уксуснокислые бактерии могут вызывать прокисание вина, пива, кваса, ягод, салатов и других продуктов.

Лимоннокислое брожение вызывают некоторые плесневые грибы (например, грибы из рода аспергиллюс), способные окислять сахар в растворах в лимонную кислоту, при этом выделяются вода и энергия.

Схема брожения следующая:

САХАР + КИСЛОРОД > ЛИМОННАЯ КИСЛОТА + ВОДА + ЭНЕРГИЯ

Образование грибами лимонной кислоты используется в промышленности (при изготовлении кондитерских изделий, сиропов, газированных напитков, в кулинарии и др.).

Микробиологический синтез - промышленный способ получения химических соединений и продуктов (например, дрожжей), осуществляемый благодаря жизнедеятельности микробных клеток. Иногда к микробиологическому синтезу относят также промышленные процессы, основанные на использовании иммобилизованных клеток, т.е. инженерную энзимологию.

Процессы биосинтеза

Основным этапом в получении продуктов метаболизма микробных клеток является ферментация - совокупность последовательных операций по получению биологически активных и полезных веществ.

Для получения продуктов микробиологического синтеза используются специальные технологии, включающие особенности питательных сред, режимов культивирования, выделения и концентрирования продуктов.

Все процессы биосинтеза можно представить схемой, изображенной на рисунке ниже:

Типовая схема получения микробных биопрепаратов

Культивирование, или выращивание микроорганизмов, осуществляется с целью получения биомассы (общей массы клеток организма) или продуктов метаболизма (ферментов, аминокислот и т.д.).

Выращивание микроорганизмов осуществляется поверхностным (твердофазным) или глубинным (жидкофазным) способами. Выбор способа зависит главным образом от аэрофильности организма, природы образуемого целевого продукта и энергетической целесообразности производства.

Поверхностное выращивание осуществляется на твердых, сыпучих средах, на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды. В качестве основной питательной среды используют увлажненные пшеничные отруби (отходы мукомольного производства), содержащие в определенных соотношениях соли фосфора, магния и кальция, а также основные питательные элементы - углерод и азот в соотношении 7:1, обеспечивающие интенсивное развитие культуры микроорганизма и биосинтез конечного продукта.

На твердых питательных средах с использованием принудительной аэрации и добавок разрыхлителей успешно выращивают, например, мицелиальные грибы.

Наиболее перспективен глубинный способ выращивания, при котором процесс осуществляется в специальных емкостях-ферментаторах, снабженных термостатирующим, аэрирующим, перемешивающим и регулирующим рН среды устройствами.

Клетки микроорганизмов суспендируются в жидкости и находятся во взвешенном состоянии.

Глубинное культивирование на жидких питательных средах находит широкое применение для анаэробных и аэробных продуцентов. Но активность получаемых ферментных препаратов в большинстве случаев ниже, чем при поверхностном культивировании.

Глубинный способ выращивания микроорганизмов может быть как периодическим, так и непрерывным, поверхностный бывает только периодическим. При периодическом способе микроорганизмы выращиваются на какой-либо среде без ее смены, в аппарат загружается весь объем питательной среды и посев материала (инокулят) одновременно. Процесс ведут до определенного количества биомассы или продукта метаболизма. Периодически культура ведет себя как многоклеточный организм с ограниченным ростом.

Ферментация. Типы ферментеров и биореакторов

Основная ферментация

ферментация брожение биосинтез

Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры среду посевного материала и до завершения процесса роста клеток или биосинтеза целевого продукта [49]. По окончании ферментации образуется сложная смесь, состоящая из клеток продуцента, раствора непотребленных питательных компонентов и накопившихся в среде продуктов биосинтеза. Такую смесь называют культуральной жидкостью.

Технологические особенности процессов ферментации

По технологическому оформлению различают следующие микробиологические процессы: аэробное и анаэробное культивирование; твердофазное, поверхностное и глубинное культивирование; периодическое и непрерывное культивирование.

Аэробное культивирование -- аэрация среды -- непременное условие в тех микробиологических процессах, в которых используются аэробные микроорганизмы-продуценты.

Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Для биосинтеза 1 кг дрожжевой биомассы необходимо, например, 0,74-2,6 кг молекулярного кислорода. При интенсивном потреблении субстрата независимо от источника углерода продуцент ассимилирует 0,83-4,0 мг кислорода/1 л среды/мин.

Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов (табл. 1). При давлении 0,1 МПа и температуре 30°С в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода колеблется в интервале 2-5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5-2 мин.

При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость абсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды (табл. 2).

Во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита. Принято говорить о критической концентрации кислорода, при которой наблюдается лимитация дыхания клеток. Для большинства аэробных микроорганизмов, растущих в сахаросодержащих субстратах, критическая концентрация кислорода 0,05-0,10 мг/л, что соответствует 3-8 % от полного насыщения среды кислородом. Лимитация роста и физиологической деятельности клеток наблюдается при более высоких концентрациях кислорода: на средах с глюкозой рост дрожжей лимитируется при рО2 на уровне 20-25 % от полного насыщения.

Оптимальной для роста биомассы считается концентрация кислорода 50-60 % от полного насыщения, для биосинтеза целевых метаболитов -- 10-20 %.

Таблица 1.

Зависимость абсорбции кислорода в воде (мг/л) от концентрации диспергированных компонентов (20°С)

Сахароза	Подсолнечное масло	Биомасса
концентрация, %	абсорбция О2	концентрация, %	абсорбция О2	концентрация, %	абсорбция О2
0	8,2	0	8,9	0	8,0
2,5	7,8	0,05	11,6	3,0	4,1
5,0	7,2	0,10	18,9	6,0	2,4
7,5	6,6	0,15	19,0	9,6	1,5
10,0	5,9	0,20	22,3	16,0	1,2
15,0	4,8	0,25	24,0	32,0	0,8

Таблица 2.

Зависимость скорости абсорбции кислорода в воде от аэрации и перемешивания среды* (мг/л мин)

Количество подаваемого воздуха, м3/(м3*мин)	Частота вращения мешалки, мин-1
	0	500	800	1000	2000
0,35	1,3	4,0	7,5	14,5	15,1
0,65	3,5	7,3	12,1	19,1	22,1
1,00	6,0	10,0	15,0	23,0	24,0
1,30	7,5	13,9	18,0	26,0	28,0
1,60	11,0	15,5	20,0	27,0	29,0

Анаэробные процессы биологического окисления у гетеротрофных микроорганизмов в зависимости от того, что является конечным акцептором водородных атомов или электронов, делят на три группы: дыхание (акцептор -- кислород); брожение (акцептор -- органическое вещество) и анаэробное дыхание (акцептор -- неорганическое вещество : нитраты, сульфаты и др.).

У облигатных анаэробов брожение является единственно возможным способом получения энергии; у факультативных анаэробов оно составляет обязательную первую стадию катаболизма глюкозы, за которой может следовать аэробное окисление образовавшихся продуктов, если в среде присутствует кислород.

Обособленной промежуточной группой являются аэротолерантные микроорганизмы, получающие необходимую для жизнедеятельности энергию в анаэробном процессе, т. е. на уровне субстратного фосфорилирования, и одновременно имеющие дыхательную цепь для поглощения кислорода среды и создания благоприятных анаэробных условий. Данный эффект носит название «эффекта дыхательной защиты».

Примерами облигатно анаэробных процессов являются маслянокислое и метановое брожения. Универсальным для всех микроорганизмов, за небольшими исключениями, является катаболизм глюкозы -- гликолиз до образования пирувата:

Глюкоза + 2АТР + 2 NAD = 2 Пируват + 4АТР + 2NADH + 2Н+

Возбудители спиртового брожения (дрожжи) после декарбоксилирования пирувата и образования ацетальдегида восстанавливают ацетальдегид до этанола. Молочнокислые бактерии гомогенного молочнокислого брожения восстанавливают пируват до молочной кислоты. Гетероферментативные молочнокислые бактерии сбраживают глюкозу по несколько отличающемуся пентозофосфатному пути с образованием молочной кислоты, а также уксусной кислоты, этанола и диоксида углерода.

Анаэробные условия на производстве создают герметизацией аппаратуры, продуванием среды инертными газами, в том числе газообразными продуктами, образовавшимися во время ферментации. Отсутствие необходимости аэрации среды несколько упрощает при анаэробной ферментации конструкцию ферментера (биореактора) и облегчает управление процессом.

Твердофазную ферментацию обычно реализуют в твердой, сыпучей или пастообразной среде, влажность которой составляет 30-80 %.

Различают три типа твердофазных процессов:

*поверхностные процессы: слой субстрата, например соломы, не превышает 3-7 см («тонкий слой»); роль биореактора выполняют большие, площадью до нескольких квадратных метров, подносы из алюминия или культивационные камеры);

*глубинные твердофазные процессы в неперемешиваемом слое («высокий слой»): биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды. Для аэробных процессов разработаны приспособления, обеспечивающие диффузионный и конъюктивный газообмен;

*твердофазные процессы в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата, которая может быть гомогенной или состоять из частиц твердого субстрата, взвешенных в жидкости.

Если субстрат сыпучий, то отдельные твердые частицы его хорошо контактируют с воздухом, рост микроорганизмов в этом случае происходит главным образом на поверхности твердых частиц, а также в порах, заполненных либо водой, либо воздухом. Обеспечение микроорганизмов кислородом затрудняется с увеличением слоя субстрата. Перемешивание слоя не допускается, если культивируются мицелиальные микроорганизмы, например микромицеты, и из-за отсутствия перемешивания рост микроорганизмов происходит по принципу колонизации, поэтому часто возникает локальная нехватка питательных веществ. Другая проблема при твердофазной ферментации -- отвод теплоты и поддержание постоянной температуры во всей ферментационной среде.

Однако твердофазные процессы имеют и преимущества по сравнению с процессами, протекающими в жидкой среде:

* они требуют меньших затрат на Лабораторное оборудование и эксплуатацию;

* характер субстрата облегчает отделение и очистку продукта;

* низкое содержание воды в субстрате препятствует заражению культуры продуцента посторонней микрофлорой;

* твердофазные процессы не связаны со сбросом в окружающую среду большого количества сточных вод.

Управляемый процесс твердофазной ферментации в промышленных условиях осуществлен при производстве ферментов с использованием микромицетов. Сыпучий субстрат с культурой инкубируют в тонком слое (3-7 см) в кюветах, размещенных в камерах, где поддерживают оптимальные температуру и влажность воздуха, обеспечивают принудительную циркуляцию газовой фазы вдоль поверхности ферментируемого субстрата. Воздух в данном случае является и аэрирующим, и теплоотводящим агентом.

Более толстый слой гранулированного крахмалсодержащего субстрата используют для протеинизации (до 20 %) корма при помощи Asp. niger. В данном случае применяют неинтенсивное перемешивание среды.

Поверхностная ферментация на жидких субстратах реализуется в кюветах со средой, помещенных в вентилированные воздухом камеры. Культура микроорганизмов при этом образует биомассу в виде пленки или твердого слоя на поверхности жидкой среды. Культура потребляет кислород непосредственно из газовой фазы -- воздуха. Массообмен в таких условиях малоинтенсивный.

Глубинное культивирование микроорганизмов происходит во всем объеме жидкой питательной среды, содержащей растворенный субстрат. Ферментер должен обеспечивать рост и развитие популяций микроорганизмов в объеме жидкой фазы, подвод питательных веществ к клеткам микроорганизмов, отвод от микробных клеток продуктов их обмена веществ (метаболизма), отвод из среды выделяемого клетками тепла.

Глубинное культивирование можно осуществлять периодическим и непрерывным способами.

Периодическое культивирование. При периодическом способе культивировании в ферментер загружают сразу весь объем питательной среды и вносят посевной материал. Выращивание микроорганизмов проводят в оптимальных условиях в течение определенного времени, после чего процесс останавливают, сливают содержимое ферментера и выделяют целевой продукт.

Этап роста культуры включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, фазу замедления роста, стационарную фазу, фазу отмирания.

Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой. Существует также объемно-доливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентного объема среды (полунепрерывное культивирование).

Непрерывные процессы

При непрерывном способе питательная среда непрерывно подается в ферментер (биореактор), в котором создают оптимальные условия для роста микроорганизмов, а из ферментера (биореактора) также непрерывно вытекает культуральная жидкость вместе с микроорганизмами.

В непрерывных процессах биообъект поддерживается в экспоненциальной фазе роста. При этом существует равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.

Из непрерывных процессов лучше всего изучен метод глубинной ферментации. Процесс может быть гомогенно или гетерогенно-непрерывным.

При гомогенно-непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры постоянны во времени.

При гетерогенно-непрерывном процессе несколько ферментеров соединены вместе. Питательная среда поступает в первый аппарат, готовая культуральная жидкость вытекает из последнего.

При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо предотвратить вымывание культуры из системы, т. е. обеспечить постоянную концентрацию клеток. В стерильных условиях непрерывный, проточный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.

В зависимости от метода, благодаря которому культура поддерживается в состоянии динамического равновесия (когда м = D), различают турбидостатный и хемостатный принципы.

При турбидостате скорость притока среды такова, что концентрация биомассы в системе постоянна; при хемостате в системе ограничивают рост культуры одним элементом питания (углерода, кислорода, соответствующего витамина и др.) при нелимитируемых количествах остальных. Известны также методы управления ростом проточной культуры по рН (рН-стат), по кислороду (оксистат).

В зависимости от цели производства -- получение клеток или продуктов их жизнедеятельности -- способы ведения основной ферментации различаются. Если процесс направлен на получение биомассы, то назначение ферментации -- получить максимально возможный титр клеток, а в случае получения метаболитов их накопление осуществляют одновременно, причем максимумы образования продуцента и целевого продукта всегда сдвинуты по времени. Поэтому продолжительность ферментации в первом случае всегда меньше, чем во втором.

Если целью является получение биомассы промышленного штамма в периодическом процессе, то время культивирования не превышает 24 ч. При производстве первичных метаболитов время биосинтеза составляет 48-72 ч, а вторичных -- 72-144 ч.

При культивировании различных микроорганизмов интервал рабочих температур варьирует в пределах 25-60°С, значения рН -- 2ч9, расход воздуха в аэробных процессах -- 0,15-2,5 м3/1 м3 среды/мин.

Конструкции ферментеров (биореакторов)

В микробиологических производствах в зависимости от особенностей процесса применяют разнообразные ферментеры, или биореакторы.

Аппараты для аэробной поверхностной ферментации широко применяются для производства органических кислот. Поверхностная жидкофазная ферментация протекает в так называемых бродильных вентилируемых камерах, в которых на стеллажах размещены плоские металлические кюветы. В кюветы наливают жидкую питательную среду (высота слоя составляет 80-150 мм), затем с потоком подаваемого воздуха среду инокулируют спорами продуцента. В камере стабилизируется влажность, температура и скорость подачи воздуха. После завершения процесса культуральная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днище штуцеры и поступает на обработку.

При твердофазной ферментации процесс также протекает в вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах размещают лотки, в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10-15 мм. Для лучшей аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит через перфорированное днище лотков.

Аппараты для аэробной глубинной ферментации наиболее сложны как конструкционно, так и с точки зрения их эксплуатации. Главная задача -- обеспечение высокой интенсивности массо и энергообмена клеток со средой.

По структуре потоков ферментеры (биореакторы) могут быть аппаратами полного перемешивания или полного вытеснения.

Конструктивные различия ферментеров (биореакторов) определяются в основном способами подвода энергии и аэрации среды:

*ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к газовой фазе;

*ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к жидкой фазе;

*ферментеры (биореакторы) с комбинированным подводом энергии.

Ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к газовой фазе. В аппаратах этого типа аэрация и перемешивание культуральной жидкости осуществляются сжатым воздухом, который подается в ферментер (биореактор) под определенным давлением. К таким ферментерам (биореакторам) относят:

*барботажные ферментеры (биореакторы), подача воздуха в которых осуществляется через барботажные устройства, расположенные в нижней части аппарата;

*аппараты с диффузором (эрлифтные аэраторы), имеющие внутренний цилиндр-диффузор, который обеспечивает перемешивание поступающих по распределительным трубам в нижнюю часть аппарата субстрата и воздуха;

*трубчатые ферментеры (биореакторы) (газлифтные), состоящие из реактора кожухотрубчатого типа, через который жидкость потоком воздуха перемещается в верхнюю часть аппарата и, попадая в сепаратор, возвращается в реактор, где снова увлекается воздухом, подвергаясь таким образом циркуляции;

*ферментеры (биореакторы) с форсуночным воздухораспределением, оборудованные форсунками для подачи воздуха, расположенными в нижней части аппарата, и находящимся над ними диффузором, который обеспечивает внутреннюю циркуляцию жидкости;

*ферментеры (биореакторы) колонного типа, представляющие собой цилиндрическую колонну, разделенную горизонтальными перегородками (тарелками) на секции; воздух барботирует через слой жидкости каждой тарелки, а перемещение жидкости через кольцевую щель обеспечивает противоточное движение жидкой и газовой фаз.

Ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к жидкой фазе. К таким аппаратам относят:

*аппарат с самовсасывающей турбиной, имеющий цилиндрический диффузор и мешалку с полыми лопастями и валом, при вращении которой за счет создаваемого разрежения происходит самовсасывание воздуха, благодаря чему происходит подъем жидкости в кольцевом зазоре между диффузором и стенками аппарата с последующим ее возвращением в диффузор;

*ферментер (биореактор) с турбоэжекторными перемешивающими устройствами -- аппарат, разделенный вертикальными перегородками на секции, в каждой из которой имеется самовсасывающая мешалка турбинного типа (эжектор) и диффузор; для перемещения жидкости из секции в секцию в перегородках сделаны окна.

Ферментеры (биореакторы) с комбинированным подводом энергии. В этих аппаратах осуществлен подвод энергии к газовой фазе для аэрации и к жидкой фазе для перемешивания. Ферментер (биореактор) представляет собой цилиндрический сосуд, снабженный механической мешалкой и барботером, который устанавливается, как правило, под нижним ярусом мешалки.

Используется также классификация биореакторов по способу перемешивания, в соответствии с которой используются аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием.

Аппараты с механическим перемешиванием имеют механическую мешалку, состоящую из центрального вала и лопастей различной формы. Аэрация может осуществляться путем барботажа. Разбрызгиванию воздуха в виде мелких пузырьков способствует механический вибратор, установленный рядом с барботером.

Аппараты с пневматическим перемешиванием. Перемешивание и аэрация усиливаются с помощью вращающихся дисков с отверстиями, установленных вблизи барботера, или с помощью придонных пропеллеров. Классический эрлифтный аппарат дополнен диффузором, нижний обрез которого находится над барботером. Возможны варианты подачи воздуха как во внутренний, так и во внешний по отношению к диффузору объем среды.

Аппараты с циркуляционным перемешиванием содержат устройства (насосы, эжекторы), создающие направленный ток жидкости по замкнутому контуру. Насос для циркуляции культуральной жидкости может соседствовать с барботером (сочетание пневматического и циркуляционного перемешивания). Существуют разные варианты такого типа аппаратов: аппараты типа «падающей струи», типа «погруженной струи», перемешивание с помощью эжектора. Аппараты циркуляционного типа часто заполняют твердыми частицами (насадкой).

Ферментеры (биореакторы) обычно представляют собой герметические цилиндрические емкости, высота которых в 2-2,5 раза превышает диаметр. Чаще всего их изготовляют из нержавеющей стали. Для поддержания температуры в аппарате имеется двойной кожух или теплообменник типа змеевика.

Главное требование к аппаратам -- сохранение стерильности, поэтому они должны быть герметичными, все линии трубопроводов должны быть доступны для обработки горячим паром. Рабочий объем ферментера (биореактора) обычно не превышает 7/10 общего объема.

Тип ферментера (биореактора) для каждого биотехнологического процесса выбирают с учетом специфики продуцента, свойств среды и экономических соображений. Важное значение для аэробного процесса имеет система аэрации. При этом оценивают, с одной стороны, скорости поступления кислорода с жидкостью и его массопередачи от газовой фазы, с другой -- скорости потребления кислорода микроорганизмами и его удаления с отработавшей жидкостью. Скорость перехода кислорода из газовой фазы в жидкую выражают через объемную скорость абсорбции. Изменение концентрации кислорода в жидкой фазе характеризуется уравнением

dC/dt = KLa (Cp - С),

где KLa -- объемный коэффициент массопередачи на границе газ--жидкость; Сp -- равновесная концентрация кислорода в среде; С -- фактическая мгновенная концентрация кислорода в среде.

Основные факторы среды, определяющие рост и биосинтетическую активность продуцентов

Фактор	Роль при культивировании	Методы управления фактором
Состав и концентрация питательных веществ	Обеспечивает метаболизм	Составление оптимальной композиции; подпитка во время ферментации; непрерывность процесса; многостадийность с учетом потребностей продуцента по фазам развития и др.
Концентрация продуктов и ингибиторов	Замедляет биохимические реакции	Осаждение продукта по мере накопления; ферментация с диализом; ферментация под разрежением с испарением летучего продукта и др.
рН	Оптимизирует скорости биохимических реакций	Регулирование путем добавления кислоты или щелочи
Температура	То же	Охлаждение или подогрев культуральной жидкости при помощи теплообменников или температуры подаваемых в биореактор субстратов
Осмотическое давление или активность воды	Определяет границы жизни (составляет 0,6-0,998)	Составление сред с оптимальной концентрацией питательных веществ или влажностью твердой среды; поддержание на постоянном уровне во время ферментации путем разбавления водой или добавлением отдельных компонентов
Содержание растворенного кислорода	Для аэробов обеспечивает аэробный метаболизм; является акцептором Н+; ингибирует развитие анаэробов	Для аэробных процессов регулируют интенсивностью аэрации или добавлением к газовой смеси кислорода. Анаэробные процессы реализуют в бескислородной среде
Содержание диоксида углерода	Источник углерода для автотрофов; некоторые гетеротрофы нуждаются, а некоторые замедляют метаболизм в присутствии СО2	Продувание в фотосинтезирующих процессах ферментации газовой средой, обогащенной СО2; выделению СО2 из жидкой фазы способствует перемешивание
Перемешивание среды	Равномерное распределение питательных веществ и биомассы по всему пространству среды	Организуют макро- и микроперемешивание при помощи механических мешалок, барботажных, циркуляционных и других систем
Вязкость среды	Определяет диффузию питательных веществ и перемешивание клеток продуцента	Регулирование компонентами питания, характером и концентрацией биомассы, наличием некоторых полимерных продуктов. Вязкость влияет на перемешивание и аэрацию; требуются специальные технические средства



Ферментированные продукты - это искусственное пищеварение

Желудочно-кишечный тракт подвергается действию мощных и постоянных инородных антигенных раздражителей со стороны пищи и микробов. Этот орган должен интегрировать комплексное взаимодействие пищи, внешних патогенов и местных иммунологических и неиммунологических процессов. Происходят защитные иммунные ответные реакции на потенциальные патогены, тогда как реакции гиперчувствительности на пищевые антигены минимизированы. Существует доказательство того, что пищевые ферментированные волокна и вновь описанные пребиотики могут модулировать различные свойства иммунной системы, включая свойства лимфоидной ткани, связанной с кишечником (ЛТСК).

Пищевые компоненты и продукты их переработки находятся в тесном контакте с обширной иммунной системой кишечника (лимфоидной тканью, связанной с кишечником, ЛТСК) и наличие пищи в тонкой кишке может быть необходимо для адекватной функции и развития ЛТСК. Хотя известно, что специфические питательные вещества важны в развитии и функции иммунной системы, потенциал пищевых волокон влиять на иммунную функцию менее изучен. Однако, исследования, показывающие более низкую частоту бактериальной транслокации через барьер кишки при введении пищевого волокна, дают возможность предположить, что это питательное вещество моделирует иммунитет.

Наблюдаемое влияние изменений в содержании ферментированных волокон пищи на состав и функцию ЛТСК, а не периферических иммунных клеток, повышает практическое значение в определении роли пищи в иммунной функции, поскольку периферическая кровь является наиболее часто исследуемой областью при изучении иммунитета человека и крупных животных.

Результаты согласуются с последними исследованиями, показывающими увеличение пропорции Т-клеток CD4+ в брыжеечных лимфоузлах крыс, которых кормили пищей, содержащей 5% w/w пектина, по сравнению с целлюлозой и повышение пропорции интраэпителиальных лимфоцитов (ИЭЛ) CD8+ у крыс, которых кормили пищей с добавлением волокна сахарной свеклы, по сравнению с безволокнистой пищей.

Изменение или добавление волокна к пище оказывало разнообразные другие эффекты на иммунную функцию, включая увеличение в образовании сыворотки, брыжеечного лимфоузла и иммуноглобулина слизистой, повышение количества пееровых бляшек, измененное образование цитокина в брыжеечных лимфоузлах и измененное количество лейкоцитов и лимфоцитов в тканях, таких как селезенка, кровь и слизистая кишечника. Хотя исследование в этой области только началось, исследования на животных четко показали, что тип и содержание пищевого волокна могут модулировать показатели иммунной функции.

Механизмы, с помощью которых пробиотики, потребленные в пище, влияют на иммунную функцию являются предположительными на сегодняшний день. Одним из логических механизмом может быть иммунная стимуляция через прямой контакт микрофлоры толстой кишки с ЛТСК. Небольшое количество бактерий может пройти через эпителиальный барьер кишечника в пееровы бляшки, вызывая активацию или ведя к активации других иммунных клеток. Исследования in vitro подтвердили этот механизм.

Итак, существует предположение, что действие на иммунитет, наблюдаемое при введении пробиотических бактерий, может происходить благодаря иммуногенным пептидам молока, генерированным в результате бактериального гидролиза составляющих молока, находящихся в ферментированных молочных продуктах, используемых для получения пробиотических бактерий. Эта гипотеза оправдывает дальнейшее исследование, поскольку во многих исследованиях вводили пробиотические бактерии в ферментированные молочные продукты. Если это подтверждает иммунностимулирующее действие пробиотических бактерий, вряд ли можно объяснить иммунное действие пищевых пребиотических волокон.

Образование короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) в результате ферментации волокон.

Микрофлора кишечника может модулировать иммунные клетки через ферментацию пищевых волокон к КЦЖК. Установлено, что ферментация инулина и олигофруктозы повышает образование КЦЖК, в первую очередь ацетата, бутирата и пропионата в кишке, но степень, до которой повышаются уровни КЦЖК сыворотки после потребления пребиотиков неизвестна. Тем не менее, ряд исследований подтверждают прямые или косвенные иммуномодуляторные свойства КЦЖК.

Мы показали на модели крысы, что дополнение общего парентеральное питание короткоцепочечными жирными кислотами (КЦЖК) имеет результатом повышенную естественную активность клеток-киллеров. Другие исследования показали антивоспалительные свойства КЦЖК. Бутират подавлял конститутивную и вызванную цитокином экспрессию транскрипционного фактора NFкВ в клеточной линии НТ-29 толстой кишки. Фармакологические дозы ацетата, введенного внутривенно как здоровым людям так и раковым больным, увеличивали образование антител периферической крови, активность клеток-киллеров и аллогенную смешанную реакцию лимфоцитов. Неизвестно, происходит ли это воздействие при концентрациях, наблюдаемых после приема пищи с высоко ферментированным волокном.

Итак, образование КЦЖК, в частности бутирата, в толстой кишке может уменьшить потребность эпителиальных клеток в глютамине, таким образом, оставляя его для других клеток, таких как клетки иммунной системы. Эта гипотеза подтверждается наблюдением, что введение лактулозы может повышать уровни глютамина в сыворотке, и глютамин является существенным источником энергии для иммунных лимфоцитов.

Хотя необходима дальнейшая работа для более глубокого изучения изменений, механизмов иммуномодуляции и предельного влияния на иммунное здоровье, существуют предварительные данные, позволяющие предположить, что потребление пребиотических волокон может модулировать иммунные параметры в ЛТСК, вторичных лимфоидных тканях и периферическом кровообращении.

Дальнейшие исследования по физиологическому влиянию потребления пребиотиков должно включать анализ микрофлоры и физиологии кишки, а также функции и состава различных областей ЛТСК.

Высокоэффективным отечественным препаратом, состоящим из ферментированных пищевых волокон, является Рекицен-РД, энтеросорбционное и иммуномодулирующее действие которого уже используется в повседневной практике.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ (биокатализ), ускорение биохим. р-ций при участии белковых макромолекул, называемых ферментами (энзимами). Ф.к.- разновидность катализа, хотя термин "ферментация"(брожение) известен с давних времен, когда еще не было понятия хим. катализа.

Первое исследование Ф. к. как хим. процесса было выполнено К. Кирхгофом, к-рый в 1814 продемонстрировал фер-ментативную конверсию крахмала в растворимые углеводы.

Заметный вклад в представление о природе Ф. к. внесли работы И. Берцелиуса и Э. Мичерлиха, к-рые включили ферментативные р-ции в категорию хим. каталитич. процессов. В кон. 19 в. Э. Фишер высказал гипотезу о специфичности ферментативных р-ций и тесном стерич. соответствии между субстратом и активным центром фермента. Основы кинетики ферментативных р-ций были заложены в работах Л. Михаэ-лиса (1913).

В 20 в. происходит интенсивное изучение хим. основ Ф. к., получение ферментов в кристаллич. состоянии, изучение структуры белковых молекул и их активных центров, исследование большого числа конкретных ферментативных р-ций и ферментов.

В простейшем случае ур-ние р-ции с участием фермента имеет вид:

где E - фермент, S - субстрат, ES - фермент-субстратный комплекс (т. наз. комплекс Михаэлиса), P- продукт р-ции.

Превращение субстрата в продукт происходит в комплексе Михаэлиса. Часто субстрат образует ковалентные связи с функц. группами активного центра, в т. ч. и с группами кофермента (см. Коферменты ). Большое значение в механизмах ферментативных р-ций имеет основной и кислотный катализ, реализуемый благодаря наличию имидазольных групп остатков гистидина и карбоксильных групп дикарбоно-вых аминокислот.

Важнейшие особенности Ф. к.- эффективность, специфичность и чувствительность к регуляторным воздействиям. Ферменты увеличивают скорость хим. превращения субстрата по сравнению с неферментативной р-цией в 109-1012 раз. Столь высокая эффективность обусловлена особенностями строения активного центра. Принято считать, что активный центр комплементарен (КОМПЛЕМЕНТАРНОСТЬ в химии, пространственное соответствие структур двух молекул (разных или одинаковых), благодаря к-рому возможно образование между ними водородных связей и осуществление межмол. взаимодействий. В широком смысле также взаимное соответствие противоположных электростатич. зарядов на молекулах и энергий сопряженных р-ций. В последнем случае рассматриваются параллельно протекающие р-ции, связанные друг с другом так, что стадия, сопровождающаяся выделением энергии, сопряжена со стадией, для осуществления к-рой необходимо потребление энергии. наиб. распространено, особенно в биохимии и биоорг. химии, понятие структурной К. Благодаря этому виду К., к-рое осуществляется по принципу "ключ - замок", образуются комплексы антиген - антитело, фермент - субстрат, четвертичная структура белков, вторичная и третичная структура нуклеиновых к-т. В последнем случае К. проявляется особенно ярко.) переходному состоянию субстрата при превращении его в продукт. Благодаря этому стабилизируется переходное состояние и понижается активационный барьер реакции.

Большинство ферментов обладает высокой субстратной специфичностью, т. е. способностью катализировать превращение только одного или нескольких близких по структуре веществ. Специфичность определяется топографией связывающего субстрат участка активного центра.

Активность ферментов регулируется в процессе их биосинтеза (в т.ч. благодаря образованию изоферментов , которые катализируют идентичные реакции, но отличаются строением и каталитич. свойствами), а также условиями среды (рН, т-ра, ионная сила р-ра) и многочисленными ингибиторами и активаторами, присутствующими в организме. Ингибиторами и активаторами могут служить сами субстраты (в определенных концентрациях), продукты р-ции, а также конечные продукты в цепи последоват. превращений в-ва (см. Регуляторы ферментов ).

Ферментативные р-ции чувствительны к внеш. условиям, в частности к ионной силе р-ра и рН среды. Влияние т-ры на скорость ферментативной р-ции описывается кривой с максимумом, восходящая ветвь к-рой отражает обычную для хим. р-ций зависимость, выраженную ур-нием Аррениуса. Нисходящая ветвь связана с тепловой денатурацией фермента. Максимум кривой соответствует оптимальной т-ре Tопт, значение к-рой для большинства ферментов лежит в пределах 40-50 0C. Для нек-рых ферментов, особенно ферментов термофильных микроорганизмов, Tопт 80-90 0C. Подробнее о кинетике ферментативных р-ций см. Ферментативных реакций кинетика.

Осн. направления совр. исследований Ф.к.- выяснение механизма, обусловливающего высокие скорости процессов, высокую селективность (специфичность действия ферментов), изучение механизмов контроля и регуляции активности ферментов. Оказалось, в частности, что р-ции Ф. к. включают большое число стадий с участием лабильных промежут. соед., времена жизни к-рых изменяются в нано- и миллисекундном диапазонах. На активных центрах ферментов протекают быстрые (нелимитирующие) стадии, в результате чего понижается энергетич. барьер для наиб. трудной, лимитирующей стадии.

Установлен механизм регулирования ферментативной активности путем действия ингибитора (или активатора) на специфичный центр белковой молекулы с опосредованной передачей воздействия на активный центр фермента через белок. Обнаружены эффекты кооперативного взаимод. неск. молекул субстрата на белковой матрице. Найден способ "жесткого" выведения фермента из процесса посредством индуцированной субстратом необратимой инактивации.

Ф. к.- основа мн. современных хим. технологий, в частности крупномасштабных процессов получения глюкозы и фруктозы, антибиотиков, аминокислот, витаминов и регуляторов, а также тонкого орг. синтеза. Разработаны методы, позволяющие проводить ферментативные р-ции в орг. р-ри-телях, обращенных мицеллах (см. Мицеллообразование ). С Ф.к. связаны перспективы развития иммуноферментного и биолюминесцентного анализа, применения биосенсоров. Созданы методы, позволившие придать каталитич. активность антителам, обнаружена каталитич. активность у рибонуклеи-новой к-ты (абзимы, рибозимы соотв.).



Литература

Березин И.В., Исследования в области ферментативного катализа и инженерной этимологии, M., 1990. См. также лит. к ст. Биотехнология Генетическая инженерия, Ферментативных реакций кинетика, Ферменты.

Размещено на Allbest.ru

...