Размещено на http://allbest.ru

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

УО «Витебский государственный медицинский университет»

Фармацевтический факультет

Кафедра фармакогнозии с курсом ФПК и ПК

Курсовая работа

Хроматография в анализе лекарственного растительного сырья, содержащего алкалоиды

Малахова

Полина Сергеевна

студентка 3 курса 8 группы

Витебск, 2013



Оглавление

Введение

1. Основные понятия в хроматографии

1.1 Хроматографические характеристики, используемые для идентификации веществ (характеристики удерживания)

1.2 Хроматографические характеристики, используемые для количественного определения веществ

2. Хроматография как метод исследования объектов окружающей среды

3. Классификация видов хроматографии

4. Преимущества использования хроматографических методов в изучении природных соединений

5. Практическое применение хроматографических методов в изучении природных соединений на примере алкалоидов

5.1 Тонкослойная хроматография

5.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография

Заключение

Список используемых источников

Приложение



Введение

Современная медицина располагает широким ассортиментом готовых лекарственных средств отечественного и зарубежного производства.

Одна из главных задач, направленных на развитие здравоохранения в нашей стране - улучшение качества выпускаемых химико-фармацевтической промышленностью лекарственных средств. В связи с этим все большее значение в контроле производства приобретают современные физико-химические методы. Во многих случаях целесообразно использование современных хроматографических методов, позволяющих совместить стадии разделения, идентификации и количественного определения. Возникновение хроматографии как научного метода связано с именем русского ученого М. С. Цвета, который в 1903 году осуществил разделение смеси растительных пигментов и заложил теоретические основы хроматографии. Значительным вкладом в развитие хроматографического анализа явились работы Н. A. Измайлова, М. С. Шрайбер, Е. Н. Гапона, Ю. М. Шемякина, К. В. Чмутова, A. Мартина, Р. Синджа и других ученых.

Цель работы: изучения литературных источников по теме «Хроматография в анализе лекарственного растительного сырья, содержащего алкалоиды».

Для достижения поставленной цели мною будут решены следующие задачи:

· раскрыть понятие «хроматография», изучить принципы ёё работы, дать полную классификацию хроматографических методов анализа, показать основные достоинства использования хроматографии;

· рассмотреть примеры практического применения хроматографии в анализе лекарственного растительного сырья на примере алкалоидов;

· дать характеристику алкалоидам как группе физиологически активных соединений.



1. Основные понятия в хроматографии

Хроматография - метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе, состоящей из несмешивающихся и движущихся друг относительно друга фаз.

Хроматография - гибридный метод анализа, включающий разделение веществ и их последующее определение при помощи специальных устройств - детекторов.

В качестве неподвижной фазы в хроматографическом процессе выступает твёрдое вещество (сорбент) или плёнка жидкости, нанесённая на твёрдый носитель, а в качестве подвижной фазы - жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу.

В отличие от статических методов разделения - сорбции и экстракции хроматография является динамическим процессом.

При перемещении через неподвижную фазу подвижная фаза встречает на своём пути всё новые и новые слои сорбента, что сопровождается многократными повторениями актов сорбции и десорбции разделяемых веществ. Хроматографическое разделение обладает большей эффективностью по сравнению со статическими методами.

Расположение разделяемых веществ в виде отдельных зон вдоль колонки называют внутренней хроматограммой, а графическое изображение состава элюата (подвижной фазы, содержащей разделённые вещества), выходящего из колонки, получаемое, например, с помощью самописца - внешней хроматограммой.

Часть хроматограммы, соответствующая выходу из колонки элюента вместе с компонентом разделяемой смеси, называется пиком. [1]



1.1 Хроматографические характеристики, используемые для идентификации веществ (характеристики удерживания)

Время от момента ввода пробы до момента регистрации максимума пика называется временем удерживания (tR):

tR = tm + ts, tm - mobile (1)

ts - stationary

Время удерживания вещества зависит от упаковки сорбента и поэтому может изменяться при переходе от одной колонки к другой.

Более надёжной характеристикой является исправленное время удерживания (tR'), которое равно разности между временем удерживания данного вещества и несорбируемого компонента (t0).

Поскольку

t0 = tm, то tR'=ts (2)

Объём подвижной фазы, который необходимо пропустить через колонку с определённой скоростью для того, чтобы элюировать вещество, называется удерживаемым объёмом (VR).

Аналогично понятию исправленное время удерживания существует понятие исправленный удерживаемый объём (VR').

(3)

(4)

где F - объёмная скорость подвижной фазы (см³ /мин).

Отношение равновесной концентрации вещества в неподвижной фазе (Cs) к его равновесной концентрации в подвижной фазе (Сm) называется коэффициентом распределения (D):

(5)

Удерживаемый объём связан с коэффициентом распределения уравнением, называемым основным уравнением хроматографии:

VR= Vm + DVs (либо VR'=DVs) (6)

Произведение коэффициента распределения на соотношение объёмов неподвижной и подвижной фазы называется коэффициентом ёмкости колонки (k'):

(7)

(8)

Фактор удерживания (подвижности Rf ), используемый в плоскостной хроматографии, представляет собой отношение расстояния от точки нанесения пробы до центра пятна и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки нанесения пробы:

(9)

где b - расстояние, пройденное веществом, a - расстояние, пройденное фронтом растворителя. [2]



1.2 Хроматографические характеристики, используемые для количественного определения веществ

В качестве аналитического сигнала в хроматографии используют высоту или площадь хроматографического пика, которые пропорциональны содержанию вещества в хроматографической зоне.

(10) (11)

где часть основания пика, заключённая между точками пересечения касательных, проведённых к точкам перегиба на сторонах пика , с нулевой линией ;

расстояние от вершины пика до его основания, измеренное параллельно оси ординат;

ширина пика на половине высоты. [1]



2. Хроматография как метод исследования объектов окружающей среды

Хроматография относится к современным методам химического анализа . Значение этого метода очень велико.

Хромотография позволяет изучать круговорот веществ в природе, идентифицировать загрязнения в атмосфере и природных водных бассейнах, широко используется в исследовании и производстве лекарственных средств, а также в изучении метаболизма веществ в организме человека.

Развитие хроматографии связано с разработкой все новых и новых методик, отражающих новые достижения в этой области аналитической химии. [3]

Без хроматографического метода сейчас не обходится химическая, фармацевтическая, текстильная, цветная металлургия и другие отрасли промышленности. Хроматографический метод положен в основу многих химико-технологических процессов производства.

На его принципе основан ряд простых переносимых приборов для определения состава природных газов при разведке нефти и газовых месторождений, а также для установления степени продуктивности нефтяных и газовых пластов. Хроматография интенсивно используется для анализа различных ископаемых в полевых условиях, почвенно-мелиоративных исследованиях. [4]

Метод ТСХ благодаря бесспорным преимуществам перед другими видами хроматографии (быстрота, простота, экономичность) находит все большее применение в науке и промышленности. Большой вклад дал метод ТСХ при изучении природных соединений животного и растительного происхождения.

Этот метод незаменим при анализе фармацевтических препаратов, исследовании промежуточных и конечных продуктов синтеза, определении устойчивости лекарств. Широко применяется этот метод в пищевой промышленности как для определения микроэлементов (Co, Ni, Cu, Zn), так и при идентификации липидов и жиров, а также стабильности витаминов и т.д. [3,4]В сельском хозяйстве и в биологической химии он применяется для разделения аминокислот, сахаров, нуклеиновых кислот, стероидов. Этот метод позволяет быстро и точно анализировать пестициды, особенно в сельскохозяйственных культурах, а также состав растений, почв и удобрений.

В настоящее время хроматографический метод анализа широко применяется при анализе воды и воздуха. ТСХ в сочетании с другими методами была использована для анализа магнитной фракции космической пыли.

Методом ТСХ удается быстро и четко разделить и идентифицировать очень малые количества смесей неорганических веществ (от десятых, а иногда и сотых долей микрограмма до нескольких десятков мкг). Разделению методом ТСХ подвергались представители практически всех групп элементов - щелочных, щелочноземельных, переходных, непереходных, лантаноидов и актиноидов. [4]



3. Классификация видов хроматографии

Существует более 50 различных хроматографических методов и вариантов. В основу их классификации могут быть положены:

1) агрегатное состояние подвижной и неподвижной фазы.

По агрегатному состоянию подвижной фазы - газовая, жидкостная;

По агрегатному состоянию неподвижной фазы - газотвёрдофазная, газожидкостная, жидкость-жидкостная, жидкость-твёрдофазная, жидкость-гелевая ( в названии хроматографического метода первым указывается агрегатное состояние подвижной фазы, а вторым - неподвижной ).

2) геометрическая форма неподвижной фазы.

Колоночная - хроматографический процесс проходит в пределах протяжённого цилиндрического пространства;

Капиллярная - диаметр проходного сечения пространства соизмерим с диаметром частиц неподвижной фазы, которая нанесена на стенки капилляра в виде тонкой плёнки;

Плоскостная - хроматографический процесс проходит в тонком слое.

3) преобладающий механизм разделения.

Адсорбционная - различная адсорбируемость разделяемых веществ неподвижной фазой;

Адсорбционно-комплексообразовательная - образование (в подвижной фазе или на поверхности неподвижной фазы) различных по устойчивости комплексных соединений;

Аффинная - различная способность разделяемых веществ к биоспецифическим взаимодействиям;

Ионообменная - различная способность разделяемых веществ к ионному обмену;

Осадочная - образование осадков, различающихся по растворимости;

Распределительная - различная растворимость разделяемых веществ

в неподвижной фазе или в подвижной и неподвижной фазах;

Эксклюзионная - различия в размерах и форме молекул разделяемых веществ.

4) цель проведения.

Информационная - получение информации о составе объекта (аналитическая хроматография) либо о его физико-химических свойствах (физико-химическая хроматография);

Технологическая - целью является само разделение. Применяется для выделения целевого компонента из смеси либо для его очистки.

5) способ получения хроматограммы.

Элюентная (проявительная). Сорбент, находящийся в хроматографической колонке, вначале промывают подвижной фазой (элюентом), обладающей меньшим сродством к неподвижной фазе, чем любое из разделяемыхвеществ. Затем в колонку вводят исследуемую смесь веществ и продолжают непрерывно пропускать элюент. Самый эффективный и в настоящее время практически единственный способ получения хроматограммы в количественном анализе.

Рисунок 1. Хроматограмма элюентной хроматографии.

Вытеснительная. Вначале в колонку вводят некоторое количество разделяемых веществ, которые распределяются в ней в порядке их сродства к неподвижной фазе. Затем в поток подвижной фазы вводят вещество-вытеснитель, которое имеет большее сродство к неподвижной фазе, чем любой из компонентов разделяемой смеси. Фронт вытеснителя движется по колонке, вытесняя ранее сорбированные вещества, которые, в свою очередь, вытесняют друг друга. Используется, в основном, для разделения макроколичеств веществ в препаративных целях.

Рисунок 2. Хроматограмма вытеснительной хроматографии

Фронтальная. В колонку непрерывно вводят раствор разделяемых веществ. Из колонки вначале будет выходить чистый растворитель, затем растворитель вместе с компонентом смеси, наименее прочно

удерживаемым неподвижной фазой, затем смесь растворителя, наименее прочно удерживаемого компонента и следующего по удерживанию компонента и т.д. Метод использовался на ранних стадиях развития хроматографии. [1]

Рисунок 3. Хроматограмма фронтальной хроматографии



4. Преимущества использования хроматографических методов в изучении природных соединений

Преимущество хроматографического метода перед другими физико-химическими методами анализа состоит в том, что в ряде случаев он применим тогда, когда другие методы разделения смеси оказываются непригодными. Метод дает возможность разделить малые количества веществ с очень близкими химическими свойствами. Хроматографический метод прост в выполнении и поэтому находит широкое применение для разделения самых разнообразных смесей неорганических и органических веществ.

Преимущество хроматографического метода перед химическим в том, что он дает не только количественную, но и качественную информацию и позволяет, в случае необходимости, определить любой компонент смеси газов, образующейся при разложении неорганического продукта.

Ещё один преимуществом является то, что этот метод при сравнительной простоте даёт большую производительность и может быть использован в непрерывных технологических процессах.

В настоящее время четко определилось еще одно преимущество хроматографического метода. Если вновь открываемые вещества присутствуют в исследуемом объекте в количествах, не позволяющих применять общеупотребительные аналитические приемы, то с помощью хроматографии возможно описать эти вещества, пользуясь их специфическими хроматографическими свойствами. К числу этих свойств относятся прежде всего: относительная скорость движения хроматографической полосы или зоны данного вещества на колонке адсорбента, а также положение, занимаемое исследуемым веществом в определенном месте адсорбционного ряда, установленного Цветом. [6]



5. Практическое применение хроматографических методов в изучении природных соединений на примере алкалоидов.

Среди физиологически активных соединений растительного происхождения алкалоиды занимают особое место. Первые алкалоиды были выделены из растений еще в XIХ веке.

В настоящее время налажен химический синтез некоторых из них, хотя, по-прежнему значительное большинство алкалоидов получают из растительного сырья. Алкалоиды - группа природных азотсодержащих соединений разнообразных по химическому строению.

Свое название эти вещества получили от арабского слова "алкали" (щелочь) и греческого "ейдос" (подобный).

Первый алкалоид был выделен из опийного мака (морфин). Затем из различных растений были выделены такие высокоактивные алкалоиды, как стрихнин, бруцин, кофеин, никотин, хинин, атропин и др., которые до сих пор широко используются в медицинской практике в качестве основных фармацевтических лечебных препаратов .

Выделение и унификация алкалоидов в начале XX века имели для практической медицины чрезвычайно большое значение. Лекарственные препараты, содержащие алкалоиды, фактически занимают одно из самых значительных мест в системе управления физиологическими процессами, протекающими в организме здорового и больного человека, и играют ведущую роль в лечении различных недугов. Биологическое действие алкалоидов настолько разнообразно, что нет необходимости перечислять их детально .

Интерес к алкалоидам среди исследователей велик и не подвержен влиянию моды. Для практического использования алкалоидов важно не только установить их наличие в растениях, но и получить очищенный препарат. В этом плане возможны различные подходы, однако такие препараты обязательно должны анализироваться по качественному составу и биологической активности. [7]

5.1 Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой метод разделения, в котором используется неподвижная фаза, состоящая из подходящего материала, нанесенного в виде тонкого слоя и зафиксированного на подложке (пластинке) из стекла, металла или пластмассы.

Перед хроматографированием растворы анализируемых веществ наносят на пластинку. Разделение основано на процессах адсорбции, распределения, ионного обмена или на их комбинации и осуществляется посредством перемещения в тонком слое (неподвижной фазе) исследуемых веществ, растворенных в растворителе или соответствующей смеси растворителей (подвижной фазе) [2]

Процесс подобен бумажной хроматографии, но его преимуществом является большая скорость анализа, более высокое качество разделения, и возможность выбора одной из неподвижных фаз, обладающей наиболее подходящими свойствами. В настоящий момент тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из основных методов анализа смесей органических веществ в научных лабораториях и полностью вытеснил бумажную хроматографию. [8]

Сорбенты. Как и для других органических соединений, для алкалоидов чаще всего используют силикагель. Ввиду слабого кислотного характера силикагеля алкалоиды адсорбируются на нем довольно прочно, поэтому следует пользоваться либо подщелоченным силикагелем, либо - что оказывается удобнее - вводить в систему растворителей компонент основного характера. Подщелачивание силикагеля чаще всего осуществляют 0,5 н КОН; иногда, однако, достаточно подвергнуть его действию паров аммиака. Некоторые слабоосновные алкалоиды можно разделять и на обычном силикагеле в более полярных проявляющих системах растворителей. Удобным также является окись алюминия.

Для разделения некоторых групп алкалоидов получает все большее распространение распределительная хроматография, обычно на слоях целлюлозы, пропитанной формамидом.

Этот способ имеет значительное преимущество главным образом при разделении структурно близких веществ, которые оказывается невозможно делить с помощью адсорбционной хроматографии. Изредка применяется в качестве сорбента крахмал.

Системы растворителей. Для хроматографирования алкалоидов на тонких слоях силикагеля большей частью пользуются системами с добавлением компонента основного характера, чаще всего органического основания, например диэтиламина или пиридина, а также системами, в которые входит аммиак. Обычной составной частью систем, применяемых на силикагеле, служит хлороформ, как правильно в смеси с низшими спиртами, например метанолом, этанолом или изопропанолом. Для слоев окиси алюминия помимо хлороформа часто пользуются бензолом, также в смеси с низшим алифатическим спиртом. [3]

Системы расворителей:

ХЛОРОФОРМ-АЦЕТОН-ДИЭТИЛАМИН (5:4:1);

ХЛОРОФОРМ-МЕТИЛОВЙ СПИРТ-УКСУСНАЯ КИСЛОТА (18:1:1);

БЕНЗОЛ-МЕТИЛОВЫЙ СПИРТ (19:1);

ХЛОРОФОРМ - ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ и др. [4]

Принимая во внимание высокую чувствительность и разделяющую способность метода ТСХ, указанный метода был использовандля идентификации теобромина и кофеина при их совместном присутствии.

Это обусловлено тем, что существующие методики обнаружения пуриновых алкалоидов на дают объективной информации и довольно трудоемки, а использование ТСХ основано на применении систем растворителей, содержащих высокотоксические вещества ( бензол, хлороформ, метанол и др.). Указанные выше недостатки явились одной из главной причин изучения возможности применения нетоксических систем растворителей для решения поставленной задачи.

Исходи из физико-химических свойств изучаемых веществ, выбор сорбента и систем растворителей основывался на возможности использования специфического взаимодействия между сорбентом и определяемыми веществами, а также между последними и растворителями, с целью их разделения. В качестве сорбента использовали силикагель, а разделение производили на пластинках Силуфол УФ 254, размером 6,5*15 см.

Методика. На стартовую линию хроматографической пластинки в виде точки наносят 0,01-0,02 мл 0,1% раствора изучаемых веществ - теобромина и кофеина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают в сушильном шкафу при 100^о С в течении 3-5 минут, затем помещают в камеру, предварительно насыщенную парами растворителей и хроматографируют восходящим методом. Длина пробега 10 см. После хроматографирования пластинку вынимают и высушивают при 100^о С до полного удаления растворителей. Последующее детектирование осуществляют путем помещения пластинки в камеру, насыщенную парами йода. При этом в зонах обнаружения веществ на хроматограмме появляются желтые пятна круглой или овальной формы. Результаты исследования приведены в таблице 1 и 2.

Таблица 1. Результаты хроматографического исследования теобромина.

Система растворителей	Вещества	Значение Rf	Проявитель
1.Спирт этиловый 96% - 0,1 М Раствор серной кислоты 9:1	теобромин	0,81-0,83	Пары йода
2.Спирт этиловый 96% - 0,1 М Раствор серной кислоты 7:3	теобромин	0,87-0,89	Пары йода
3.Спирт этиловый 96% - 0,1 М Раствор хлороводородной кислоты 7:3	теобромин	0,84-0,86	Пары йода



Таблица 2. Результаты хроматографического исследования кофеина. [9]

Система растворителей	Вещества	Значение Rf	Проявитель
1.Спирт этиловый 96% - 0,1 М Раствор серной кислоты 9:1	кофеин	0,60-0,62	Пары йода
2.Спирт этиловый 96% - 0,1 М Раствор серной кислоты 7:3	кофеин	0,59-0,61	Пары йода
3.Спирт этиловый 96% - 0,1 М Раствор хлороводородной кислоты 7:3	кофеин	0,62-0,64	Пары йода

Обнаружение. Наиболее употребляемым реактивом для обнаружения алкалоидов является реактив Драгендорфа, обычно в модификации Мюнье (раствор йодвисмутата калия в уксусной кислоте). Недостатком способа является одинаковая окраска пятен исследуемых алкалоидов ( оранжевые или оранжево-красные пятна). Получил большое распространение йодоплатинат калия, который образует пятная характерных цветов с рядом алкалоидов; пользуются также сернокислым церием. Ряд алкалоидов обнаруживает флуоресценцию в ультрафиолетовом свете. Это явление известно главным образом для алкалоидов спорыньи, для некоторых алкалоидов раувольфии. Для обнаружения алкалоидов можно использовать пары йода (образуются бурые пятна). К универсальным неспецифическим реактивам также относятся N-2,6-трихлор-п-бензохинонимин, флуорескамин. Прочие реактивы будут специфическими на отдельные группы алкалоидов. [3,4]

Некоторые группы алкалоидов:

Алкалоиды спорыньи.

Алкалоиды спорыньи подразделяются на несколько основных групп - группы эрготамина, эрготоксина, эргометрина и менее важную группу клавина. В медицине спорынья сама по себе из-за нестабильного содержания действующих веществ не применяется. Зато стандартизированные препараты и лекарственные средства из действующих веществ спорыньи прописывают для лечения различных нервных расстройств, состояний возбуждения и страха, а также мигрени. Но еще важнее их действие на матку: препаратами спорыньи останавливают кровотечения, а путем воздействия на вегетативную нервную систему побуждают матку к сокращению. [3,10]

Рисунок 4. Спорынья на ржи

Хроматографии этих веществ посвящено значительное число работ; в частности, это касается диэтиламида лизергиновой кислоты (ЛСД). Благодаря слабоосновному характеру алкалоидов спорыньи можно работать на немодифицированном силикагеле, применяя системы растворителей средней полярности без компонентов основного характера. Пятна можно локализовать визуально в ультрафиолетовом свете.

Описаны и другие способы обнаружения, например опрыскивание раствором тетрацианоэтилена в ацетонитриле (этот способ рекомендуется для обнаружения галлюциногенов), или обнаружение аммиачным раствором сернокислой меди.

Пептидные основания можно обнаруживать также нингидрином.

Хроматографией алкалоидов спорыньи занимались такие ученые, как:

· Шталь (подвергал разделению главные вещества эргометриновый, эготаминовой и эрготоксиновой групп на силикагеле G в системе хлороформ-метанол (95:5));

· Грегер и Эрге;

· Тейхерт (для успешного разделения близкородственных эрготоксиновых оснований, которые невозможно разделить адсорбционной хроматографией, применил принцип распределения на тонких слоях целлюлозы, обработанной формамидом);

· Рейхельт и Кудрнач (хроматографировали 16 алкалоидов спорыньи на силикагеле, обработанном формамидом, в системах диизопропиловый спирт-тетрагидрофуран-толуол-диэтиламин (70:15:15:0,1) );

· Карачоньи и Сарвадь (определяли алкалоиды на окиси алюминия венгерского производства в системах хлороформ-этанол (97:3) или эфир-этанол в том же соотношении );

· Многие работы были посвящены идентификации и определения содержания ЛСД в различных запрещенных материалах ( Прохазка, Нивагути и Иноуэ, ШперлингКрист и др.) [3]

Алкалоиды опия. Алкалоиды опия еще называются опиатами. К этим веществам относят морфин, папаверин, кодеин. Все три вещества очень часто используют для лечения различных заболеваний. Одним из веществ этой группы является и героин - это полусинтетический алкалоид. По своему строению все эти вещества довольно разнообразны.

Но их объединяет похожее действие на организм, все они влияют на опиоидные рецепторы центральной нервной системы.

Лечение подобными веществами разрешается только по назначению и под контролем врача.[11]

Хроматографическое разделение этой фармацевтически чрезвычайно важной группы алкалоидов явилось предметом многочисленных исследований. В последнее время усилилось внимание, уделяемое их анализу с позиции токсикологии, а так же обнаружения препаратов с содержанием наркотиков.



Рисунок 5. Мак опийный

Алкалоиды опия можно подвергать разделению во многих системах на различных сорбентах, причем широко применяются готовые слои. Их материалов следует упомянуть силуфол, материал на основе целлюлоз люцефол квик, обработанный формамидом или трис(оксиметил)метиламином, которыми пользовались при хроматографировании большого числа алкалоидов и местных анестетиков.

За рубежом существуют в продаже и чрезвычайно простые устройства, позволяющие хроматографировать лекарственные препараты прямо с поверхности, например коробочки из пластмассы, служащие в качестве миниатюрных проявительных камер, готовые микропластинки и т.д. Пользуются также электрофорезом на тонких слоях целлюлозы в кислых или щелочных электролитах при 500 или 3000 В.

Разделение простейших смесей веществ можно осуществить и на микропластинках, приготовленных их щелочного силикагеля в системе ацетон-бензол (1:1). Морфин подвергали анализу на слоях полиамида или на готовых пластинках силикагеля, разрезанных на квадраты размером 3*3 см. Для фармацевтических целей пригоден также тальк (2 г талька, 0,3 гипса, 4 мл метанола); на нем определяли кодеин, дионин и папаверин в присутствии новокаина в системах вода-ацетон-этанол-аммиак (30:1:10:5). Описаны и другие сорбенты.

Специфический способ обнаружения морфина в таблетках, экстрактах и т.д. основан на хроматографическом разделении на силикагеле в системах хлороформ-пропано-2- диэтиламин (18:20:10) или метанол- 20%-ный аммиак (100:1). После 1-2-часового нагревания в ультрафиолетовом свете можно наблюдать пятна со слабой голубой флуоресценцией. Морфин затем идентифицируют, опрыскивая 5%-ным раствором иодноватокислого натрия в 1%-ном аммиаке.

Спустя несколько минут появляется серовато-зеленое флуорецирующее пятно при длине волны 365 нм. После полного высыхания слоя окраска изменяется на серовато-голубую, при легком смачивании водой опять становится зеленой. [3]

5.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ -- один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз.

Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии.

Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элюент).

Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3--5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).

По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делитсяна адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, лигандообменную и другие. Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно.

Нормально-фазовая ВЭЖХ - неподвижная фаза более полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента преобладает неполярный растворитель.

· Гексан-изопропанол = 95:5 (для малополярных веществ)

· Хлороформ-метанол = 95:5 (для среднеполярных веществ)

· Хлороформ-метанол = 80:20 (для сильнополярных веществ)

Обратно-фазовая ВЭЖХ - неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента почти всегда присутствует вода. В этом случае всегда можно обеспечить полное растворение БАС в подвижной фазе, почти всегда возможно использовать УФ-детектирование, почти все подвижные фазы взаимно смешиваются, можно использовать градиентное элюирование, можно быстро переуравновесить колонку, колонку можно регенерировать.

· Ацетонитрил-вода

· Метанол-вода

· Изопропанол-вода [12]

Разработана простая и экспрессная методика определения теобромина, теофиллина и кофеина в чае, кофе и какао методом ВЭЖХ. Определение алкалоидов производится на обращенно-фазовой колонке (Zorbax SB C-18, 250*4,6 мм, 5 мкм) с изократическим режимом элюирования ПФ (вода и ацетонитрил 90:10 по объему)

Алкалоиды, производные пурина ( теобромин, теофиллин, кофеин), широко применяются в медицине как психомоторные стимуляторы (кофеин) и спазмолитические средства (теобромин, теофиллин), содержатся в растительном сырье ( листья чая, семена кофе, бобы какао), применяемом для приготовления напитков.

Целью настоящего исследования была разработка методики количественного определения пуриновых алкалоидов методом обращено-фазовой ВЭЖХ, позволяющем определять данные вещества в сырье растительного происхождения в условиях изократического элюирования без применения ион-парных реагентов.

Экспериментальная часть. Работа выполнялась на жидкостном хроматографе Agilent HP 1100, в комплекте с системой подачи и дегазации на четыре растворителя G1311A, диодноматричным детектором G1315B, термостатом колонок G1316A, устройством для автоматического ввода образцов (автосэмплер) G1313A. Сбор данных, обработка хроматограмм проводилась с помощью программы Agilent ChemStation for LC 3D.

Разделение проводилось на хроматографической колонке Zorbax StableBond C-18 250*4,6 мм, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза: вода и ацетонитрил 90:10, скорость подачи подвижной фазы 1мл/мин, объём пробы 10 мкл. Рабочая длина волны 272 нм выбрана на основании анализа спектров поглощения в области максимумов пиков определяемых веществ с помощью фотодиодноматричного детектора Diode-array detector Agilent HP 1100 G1315B и программы Agilent ChemStation for LC 3D.

Разделение проводилось при температуре колонки 30^о С, давление в системе около 100 bar. В качестве стандартов использовали образцы теобромина, теофиллина, кофеина фармакопейной чистоты (ГФ Х). Вещества считали идентифицированными при совпадении времен удерживания и спектров поглощения со стандартами.



Таблица 3. Хроматографические параметры разделяемых веществ

		Время удерживания(tR)	Эффективность разделения (N)	Коэффициент ассимметрии пика (As)	Селективность разделения (б)	Кэффициент разрешения пиков (Rs)
1	Теобромин	4,56	~11000	0,69
2	Теофиллин	6,46	~13000	0,68	6,3 (1 и 2)	9,2 (1 и 2)
3	Кофеин	12,22	~12000	0,58	12,0	16,6

Рисунок 6. Хроматограмма модельной смеси теобромина (1), теофиллина (2) и кофеина (3).

Методика. Около 1 г чая или кофе (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 250,0 мл, прибавляют 150,0 мл очищенной воды и выдерживают на водяной бане при температуре 855^о С в течении 30 минут, периодически втряхивая. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 200,0 мл, охдаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до метки водой очищенной.

Полученный раствор фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм, отбрасываю первые 10 мл фильтрата. Полученный раствор хроматографируют на жидкостном хроматографе, получая не менее 5 хроматограмм для каждого раствора.

Рисунок 7. Хроматограмма образца чая Greenfield Black Tea (Россия) (теобромин (1) и кофеин (3)).

Рисунок 8. Хроматограмма образца какао быстрорастворимого Тикли (Россия) (теобромин (1) и кофеин (3)).



Расчет количественного содержание алкалоидов.

Расчет количественного содержания теобромина, теофиллина и кофеина осуществляют по градуировочным графикам зависимости концентрации вещества в пробе от площади пика.

Содержание каждого алкалоида равно:

(12)

где С - концентрации, определенные из градуировочных графиков для каждого из веществ: для теобромина С=0,0341S (R=1), для теофиллина С=0,0359S (R=1), для кофеина С=0,0321S (R=0,9999)площадь пика рассчитывается как среднее арифметическое для пяти определений; m - масса вещества в навеске в граммах.

Таблица 4. Количественное содержание пуриновых алкалоидов в некоторых образцах

Содержание, %	Greenfield Black Tea	Greenfield Green Tea	Greenfield Herbal Tea summer bouqet	Золотая чаша	Lipton taste of London	Dilmah Ceylon Orange	Nadin
Теобромин	0,30	0,18	-	0,18	0,16	0,24	0,04
Кофеин	2,74	2,86	-	2,46	2,48	2,32	1,56

[13]



Заключение

В ходе написания данной работы были изучены ключевые вопросы темы, а полученные знания найдут широкое применение в практической деятельности. Были рассмотрены все преимущества хроматографии и возможность её применении не только в медицине и фармации, но и в различных отраслях народного хозяйства.

Можно сделать вывод о том, что в фармации и фармакологии основное направление использования хроматографии -- это идентификация лекарственных веществ, количественное определение биологически активных компонентов в растительном сырье, в полупродуктах, в сложных лекарственных смесях. Хроматография служит для контроля производства лекарств, для изучения стабильности лекарственных форм, для выбора метода оценки стабильности их, а также для контроля качества препаратов.

Обобщая всё выше сказанное, можно отметить, что вопрос применения хроматографии обладает широким потенциалом для дальнейших исследований и практических изысканий.

хроматография алкалоид сорбент химический



Список использованных источников

1. Жерносек, А.К. Аналитическая химия для будущих провизоров, часть1/ А.К. Жерносек, Е.В. Талуть, Витебск, 2003. -362 с.

2. Государственная Фармакопея Республики Беларусь. Т. 1: Общие методы контроля качества лекарственных средств / Центр экспертиз и испытаний в здравоохр.; под общ. ред. Г.В. Годовальникова. - Минск: Минск. гос. ПТК полиграфии, 2006. - 1345 с.

3. Шаршунова М. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии, часть 2 / Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч., издательство «Мир». Москва, 1980. - 607с.

4. Применение хроматографии.Дата доступа: 28.12.2013 Режим доступа:

http://www.e-ope.ee/_download/euni_repository/file/809/PDF.rar/PDF/410.pdf .

5. Коноплева, М.М. Фармакогнозия: природные биологически активные вещества / М.М.Коноплева, Витебск, 2013. - 407с.

6. Большая Энциклопедия Нефти и Газа. Преимущества хроматографии. Режим доступа: http://www.ngpedia.ru/id306900p1.html, http://www.ngpedia.ru/id306752p2.html. Дата доступа : 6.12.2013

7. Кудряшов, А.П. Выделение и очистка алкалоидов из NICOTIANA TABACUM И CHELIDONIUM MAJUS / А.П. Кудряшов, О.А. Кирштейнер, О.Д. Бондарук // Труда БГУ. - 2011 - Т.6, Ч.2. - с. 87-92

8. Википедия. Свободная энциклопедия. Тонкослойная хроматография. Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/Тонсколслойная хроматография Дата доступа: 28.13.2013

9. Куликов, В.А. Применение нетоксических систем растворителей для идентификации теобромина и кофеина с помощью тонкослойной хроматографии. / В.А. Куликов, В.А. Куликов // Достижения фундаментальной, клинической медицины и фармации. - 2013 - 68 научная сессия. - с.355-356.

10. Энциклопедия лекарственных растений. Спорынья. Режим доступа: http://medgrasses.ru/sporyniya.html. Дата доступа: 28.12.2013.

11. Аптека тяньши: Здоровый образ жизни, альтернативная медицина, БАДы./Алкалоиды опия -27 апреля 2010 . Режим доступа:

http://www.tiensmed.ru/news/post_new6077.html. Дата доступа: 28.12.2013.

12. Википедия. Свободная энциклопедия. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/ВЭЖХ. Дата доступа: 28.12.2013.

13. Моисеев, Д.В. Определение некоторых пуриновых алкалоидов в чае, кофе и какао методом ВЭЖХ / Д.В. Моисеев, А.И. Жебентяев, П.Т. Петров //

14. Вестник фармации. - 2005. - №4(30). С. 18-24.



Приложение

Перечень условных обозначений

ВЭЖХ - высоко эффективная жидкостная хроматография

БАС - биологически активное соединение

ПФ - подвижная фаза

ТСХ - тонкослойная хроматография

Размещено на Allbest.ru

...