ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В.Н. КАРАЗІНА

СОКОЛІК ВІКТОРІЯ ВАСИЛІВНА

УДК 577.044:546(492+732)

ВПЛИВ ХЛОРИДІВ КОБАЛЬТУ І РТУТІ НА ЛАНЦЮГОВЕ ПЕРЕОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ, СИСТЕМУ ТІОЛІВ ТА АКТИВНІСТЬ ГЛУТАТІОНЗАЛЕЖНИХ АНТИОКСИДАНТНИХ ФЕРМЕНТІВ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Харків - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (м. Харків)

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Каліман Павло Авксентійович,

Харківський національний університет

ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Петренко Олександр Юрійович,

Інститут проблем кріобіології та кріомедицини

НАН України, завідувач відділу біохімії

кандидат біологічних наук

Овсяннікова Тетяна Миколаївна,

Харківський національний університет

ім. В.Н. Каразіна,

старший науковий співробітник кафедри

молекулярної та прикладної біофізики

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса

Шевченка (кафедра біохімії), м. Київ

Захист відбудеться “ 12 ” вересня 2001 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім.В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, м. Свободи, 4, ауд. III-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім.В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, м. Свободи, 4.

Автореферат дисертації розісланий “ 26 ” липня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Забруднення навколишнього середовища не є лише екологічною проблемою, а стає об'єктом актуального дослідження як біологів, так і медиків. Поміж забруднювачів навколишнього середовища токсичність важких металів (насамперед кобальту і ртуті) проявляється в індукції оксидативного стресу, до того ж метали відіграють роль не менш активних прооксидантів, у порівнянні з, наприклад, іонізуючою радіацією або радіонуклідами [Иванова Л.А., Нижарадзе М.З. 1982; Каліман П.А., Нікітченко И.В. 2001; Sunderman F.W.Jr. 1986]. Зсув рівноваги в системі ланцюгове переокислення ліпідів (ЛПЛ) антиоксидантний захист (АОЗ) у напрямку прооксидантів викликає формування адаптивної відповіді шляхом активації антиоксидантного захисту клітин від уражуючої дії вільних радикалів та перекисних сполук. Особлива роль у антирадикальній системі притаманна відновленому глутатіону та пов'язаній з ним ферментній системі: глутатіонпероксидаза -- глутатіон-редуктаза -- глутатіонтрансфераза [Барабой В.А. 1991; Кулинский В.И., Колес-ниченко Л.С. 1990]. Зв'язуючою ланкою в системі ЛПЛ АОЗ виступає збала-нсована система внутрішньоклітинних та зовнішньоклітинних тіолів [Klatt P., Lamas S. 2000; Павловская Т.Е., Харченко Л.И. 1983].

Важкі метали здатні викликати розвиток чисельних захворювань під назвою “мікроелементози” [Авцын А.П., Жаворонков А.А. 1991]. Припускають, що в основі їх токсичної дії лежить вплив на компоненти мембранних структур клітин [Трахтенберг И.М., Иванова Л.И. 1984], насамперед на ненасичені жирнокислотні залишки ліпідів та сульфгідрильні групи білків.

Проте, механізми інтоксикації іонами кобальту і ртуті вивчені недостатньо [Авцын А.П., Жаворонков А.А. 1991; Ларский Э.Г. 1990]. Дуже часто у реакції відповіді не диференцюють індукцію ранішніх універсальних механізмів регуляції метаболізму і специфічний вплив металу, як хімічного елементу з унікальними властивостями. Зважуючи на те, що важкі метали та метали зі змінною валентністю індукують ЛПЛ [Sunderman F.W.Jr., Zaharia O. 1988; Huang Y.L., Cheng I.L., Lin T.H. 1996], а також впливають на стан тіолової системи, важливо було вивчити ефекти кобальту і ртуті на функціонально різні органи (печінку та нирки) у динаміці експозиції металів, а також в умовах впливу екзогенного глутатіону та блокади -адренорецепторів анаприліном.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась на кафедрі біохімії і є фрагментом наукової тематики кафедри: “Клітинні та молекулярні механізми адаптації метаболізму при окисному стресі” (НДР № ДР 0197 U008188).

Мета і задачі дослідження. Метою цієї роботи стало вивчення впливу хлоридів кобальту і ртуті на ланцюгове переокислення ліпідів, систему внутрішньоклітинних тіолів та активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів. Відповідно до мети поставлено такі завдання:

Дослідити вплив хлоридів кобальту і ртуті на динаміку активації ЛПЛ, вміст білкових і небілкових тіолів та активність АО ферментів глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, глутатіонтрансферази у печінці та нирках щурів.

Дослідити вплив хлориду кобальту на динаміку вивчених показників за умов блокади анаприліном -адреноренорецепторів, з метою відокремлювання прооксидантного впливу кобальту та стресорного рівня катехоламінів.

Вивчити вплив відновленого глутатіону на динаміку ефектів хлориду кобаль-ту у печінці та нирках щурів.

Наукова новизна одержаних результатів полягає у тому, що:

вперше було з'ясовано різні шляхи регуляції активності глутатіонза-лежних антиоксидантних ферментів за умов оксидативного стресу хлоридом кобальту у печінці і нирках щурів: глутатіонпероксидаза і глутатіонтрансфераза печінки активуються шляхом фосфорилювання сАМP-залежними протеінкіназами, а у нирках активність цих ферментів, а також глутатіон-редуктази в обох органах, залежить від вмісту субстратів реакції;

вперше узагальнено, що навіть ранішні ефекти важких металів (0,5 - 2 год) на ланцюгове переокислення ліпідів залежать від специфічної взаємодії цих металів з тіолами білкової і небілкової природи: хлорид кобальту індукує підвищення концентрації небілкових сульфгідрильних груп у печінці, а хлорид ртуті викликає виснаження системи тіолів (зниження концентрації небілкових і білкових сульфгідрильних груп) як у печінці, так і у нирках;

встановлено прооксидантний ефект -адреноблокатору анаприліну; показано, що одним з механізмів активації вільно-радикальних реакцій під впливом анаприліну є зниження активності антиоксидантних ферментів (глутатіонпероксидази і глутатіонтрансферази) у печінці щурів;

встановлені шляхи протекторної дії відновленого глутатіону за умов оксидативного стресу хлоридом кобальту: збільшення ємкості системи тіолів і активація ферментної антиоксидантної системи надлишком одного із субстратів (GSH); показано, що зв'язування іонів кобальту у тритіоловий комплекс з глутатіоном не запобігає активації вільно-радикальних реакцій.

Теоретичне і практичне значення роботи. Результати, що отримані у роботі, свідчать про спрямованість дії хлоридів кобальту і ртуті на різні ланки рівноваги ланцюгове переокислення ліпідів антиоксидантний захист. Вивчення ємкості глутатіонзалежної антиоксидантної системи печінки та нирок за умов оксидативного стресу, а також регуляція активності антиоксидантних ферментів стресорним рівнем гормонів, дає змогу керувати захисними системами організму під час інтоксикації важкими металами.

Практичне значення роботи полягає у тому, що завдяки з'ясуванню механізмів антиоксидантної дії відновленого глутатіону, цей антиоксидант можна використовувати як протектор оксидативного стресу.

Особистий внесок здобувача. Всі результати отримані пошукачем самостійно. Дисертантом особисто поставлені методики вимірювання біохімічних показників (вміст вторинних продуктів ланцюгового переокислення ліпідів у фракціях нейтральних ліпідів і фосфоліпідів; концентрація ТБК-позитивних продуктів; вміст білкових і небілкових тіолів; активність глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази і глутатіонтрансферази; вміст загальних ліпідів та загального білку), проведені всі серії експериментів та аналіз літературних джерел за темою дослідження, обговорені досліджені результати.

Апробація роботи. Основні положення та результати дисертаційної роботи були представлені на науковій конференції “Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии”, С.- Петербург, 1998 р., на VII Українському біохімічному з'їзді, Київ, 1997, на засіданнях кафедри біохімії та на науковій конференції молодих учених-біологів ХНУ, Харків 1996 р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 друкованих праць, з яких 3 статті надруковано у фахових виданнях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з огляду літератури, методичної частини, результатів досліджень та їх обговорення (3 розділи), висновків та списку використаних літературних джерел (171 джерело). Робота викладена на 116 сторінках машинописного тексту, має 14 таблиць та 8 рисунків (2 таблиці і 1 рисунок винесено на окремі сторінки).

ОБ'ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У роботі були використані білі щури (самці і самиці) лінії Wistar 3-місяч-ного віку, вагою 180-220 г. Об'єктом дослідження були гомогенати тканин печінки і нирок. Вивчали: вміст ТБК-позитивних продуктів [Minara M. 1980], загальних ліпідів [за допомогою стандартного набору Eagle Diagnostics (США)], білкових і небілкових сульфгідрильних груп [Фоловеев В.Ф. 1981], у фракціях нейтральних ліпідів і фосфоліпідів окремо визначали вміст сполук з ізольованими подвійними зв'язками, дієнових кон'югатів, кетодієнів і сполучених трієнів [Волчегорский И.Ф. 1989], а також активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів: глутатіонпероксидази [Ланкин В.З., Тихазе А.Н., Ковалевская А.Л. 1981], глутатіонредуктази [Герасимов А.М., Королева Л.А., Брусов О.С. 1976] і глутатіонтрансферази з 2,4 ДНХБ 2,4 ДНХБ -- 1-хлор-2,4-динитробензол [Лемешко В.В. 1987]. Статитистичну обробку даних здійснювали з використанням непараметричних методів (крітерій Вілкоксона - Манна - Уітні).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

Порівняльний аналіз впливів хлоридів кобальту і ртуті на активацію ЛПЛ, стан системи внутрішньоклітинних тіолів та активність глутатіон-залежної антиоксидантної системи. Тварин декапітували через 30 хв., 2 та 24 год після одноразової ін'єкції фізіологічного розчину (для контрольних тварин) або розчину солі відповідного металу: CoCl2 - у дозі 3 мг CoCl2 . (H2O)6 [Maines M.D., Kappas A. 1976] та HgCl2 -- у дозі 0,7 мг солі [Maines M.D., Kappas A. 1977] на 100 г ваги. Дані, що наведені у табл. 1 і 2, вочевидь свідчать, що хлориди кобальту і ртуті здатні посилювати процеси ЛПЛ на початкових етапах свого впливу у печінці та нирках щурів. Слід зазначити, що активація переокислення ліпідів хлоридом ртуті, у порівнянні з впливом хлориду кобальту, носила опосередкований вторинний характер. Якщо хлорид кобальту

Таблиця 1

Вплив хлориду кобальту на вміст продуктів ланцюгового переокислення ліпідів у печінці та нирках щурів (M m; n = 6 - 7)

Параметр, що вимірювався	ПЕЧІНКА	НИРКИ
	К	30 хв	2 год	24 год	К	30 хв	2 год	24 год
ТБК- позитивні продукти a	17,00 0,50	25,00 1,30*	24,00 1,50*	15,00 0,70	28,00 1,55	33,00 2,27	32,50 2,22	34,30 1,38*
	Нейтральні ліпіди b
сполуки з ізольован. подвійними зв'язками	11,35 0,41	9,20 0,55*	9,30 0,42*	8,90 0,38*	7,15 0,26	7,20 0,63	6,50 0,30	7,85 0,43
дієнові кон'югати	2,44 0,13	2,97 0,18*	2,90 0,13*	2,79 0,17	1,10 0,04	1,75 0,19*	1,85 0,16*	1,39 0,05*
	Фосфоліпіди b
сполуки з ізольован. подвійними зв'язками	38,84 2,57	41,60 4,52	28,20 0,76*	43,50 3,40	56,50 4,04	70,50 6,80*	65,50 7,60	57,50 3,40
дієнові кон'югати	17,40 1,72	18,55 2,23	12,85 1,03	20,30 1,53	23,35 1,50	34,00 2,36*	36,65 1,44	31,10 3,15

Примітки. a - 10-2 MDA нмоль / мг білку, b - E / г тканини,

*- вірогідно відносно до контролю (p 0,05)

у сублетальній дозі призводив до утворення становища супервідновленості у клітинах на фоні підвищеного утворення метаболітів кисню, то хлорид ртуті являє собою менш безпосередній індуктор вільнорадикальних процесів.

Таблиця 2.

Вплив хлориду ртуті на вміст продуктів ланцюгового переокислення ліпідів у печінці та нирках щурів (M m; n = 6 - 7)

Параметр, що вимірювався	ПЕЧІНКА	НИРКИ
	К	30 хв	2 год	24 год	К	30 хв	2 год	24 год
ТБК- позитивні продукти a	12,00 0,20	17,00 0,20*	12,00 0,30	14,00 0,30*	28,00 3,00	34,00 2,00	26,00 1,66	16,00 4,00*
	Нейтральні ліпіди b
сполуки з ізольован. подвійними зв'язками	16,30 1,01	16,10 1,94	17,35 2,01	19,00 0,56	8,40 1,31	8,05 1,06	9,95 1,44	12,45 1,56
дієнові кон'югати	4,58 0,41	3,62 0,67	4,39 0,28	4,13 0,21	1,61 0,44	1,85 0,33	2,41 0,70	1,44 0,14
	Фосфоліпіди b
сполуки з ізольован. подвійними зв'язками	36,30 0,93	31,70 0,48*	56,50 8,35*	37,00 2,00	46,25 6,90	43,75 1,82	54,50 7,35	38,80 1,00
дієнові кон'югати	12,15 1,20	9,25 2,00	10,25 0,98	8,60 1,70	24,80 1,05	41,70 3,60*	52,20 9,30*	29,80 1,58*

Примітки. a - 10-2 MDA нмоль / мг білку, b - E / г тканини,

* - вірогідно відносно до контролю (p 0,05)

Зв'язуючи доступні білкові та небілкові сульфгідрильні групи (рис. 1), ртуть в організмі призводила до порушення динамічної рівноваги ЛПЛ АОЗ шляхом виснаження тіолової ланки антиоксидантної системи. У нирках хлорид ртуті не викликав зменшення вмісту небілкових SH-груп в інтервалі 0,5 - 2 год, завдяки високій активності ниркового ізоферменту -глутамілтранспептидази [Tamano T., Yostda H., Kuronuma Y., Harada T. 1990].

Кобальт викликав збільшення вмісту небілкових та зниження білкових сульгідрильних груп на протязі першої доби у печінці і нирках щурів, що водночас свідчить про адаптивну роль небілкових тіолів в умовах оксидативного стресу (рис. 2).

Зниження вмісту сульфгідрильних груп білків супроводжується зменшенням вмісту загального білку у печінці щурів і є наслідком руйнування лізосомальних мембран і активації протеолізу білків у печінці щурів.

У відповідь на активацію ЛПЛ зростала активність АО системи: зокрема підвищувалась активність глутатіон-пероксидази и глутатіонтрансферази через 0,5 год у печінці та глутатіон-пероксидази в інтервалі 0,5 - 24 год і глутатіонтрансферази через 0,5 год введення хлориду кобальту у нирках щурів (рис. 3). Хлорид ртуті впливав на активність лише ГТ у печінці щурів: протягом доби активність цього ферменту була збільшена (рис. 4).

Таким чином, хлориди кобальту і ртуті, впливаючи на різні ланки дина-мічної системи ЛПЛ АОЗ, призводять до індукції універсальної реакції клітин, яка полягає в активації вільнорадикальних процесів та антиоксидантної системи.

Вплив хлориду кобальту на стан динамічної системи ЛПЛ АОЗ в умовах блокади -адренорецепторів анаприліном.

Для з'ясування, специфічної реакції відповіді, що спостерігалася в експериментах з введенням хлориду кобальту, було проведено серію дослід-жень за умов блокади -адренорецепторів. Для цього за 30 хв. до ін'єкції мета-лу, вводили розчин анаприліну у дозі 0,15 мг на 100 г ваги [Bassukevitz Y., Chen-Zion M., Beitner R. 1989]. Для з'ясування впливу самого анаприліну простежували динаміку його дії через 1, 2.5 та 24.5 години у печінці і нирках щурів. Встановлено, що на відміну від відомого протекторного впливу анаприліну стосовно адренергічної активації ЛПЛ у серці при емоційному стресі [Меерсон Ф.З., Пшеников М.Г. 1988], анаприлін в умовах оксидативного стресу кобальтом ні в печінці, ні в нирках не виявив захисного ефекту (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив хлориду кобальту за умов блокади -адренорецепторів анаприліном на вміст продуктів ЛПЛ у печінці та нирках щурів (M m; n =6-7)

Параметр, що вимірювався	ПЕЧІНКА	НИРКИ
	К	30 хв	2 год	24 год	К	30 хв	2 год	24 год
ТБК- позитивні продукти a	17,00 0,50	25,00 1,70*	29,00 2,10*	19,00 0,60*	28,00 1,55	34,80 1,59*	35,30 2,81*	38,4 1,69*
	Нейтральні ліпіди b
сполуки з ізольован. подвійними зв'язками	11,35 0,41	12,20 0,27	8,20 0,47*	8,90 0,61*	7,15 0,26	7,00 0,47	7,90 0,42	5,85 0,44
дієнові кон'югати	2,44 0,13	4,22 0,26*	2,17 0,08	2,19 0,09	1,10 0,04	1,30 0,09*	1,67 0,19	1,14 0,20
	Фосфоліпіди b
сполуки з ізольован. подвійними зв'язками	38,85 2,57	31,75 1,55*	38,85 2,35	43,55 2,42	56,50 4,01	69,50 6,45	59,50 6,20	50,50 3,81
дієнові кон'югати	17,40 1,72	10,05 0,99*	16,35 1,47	17,95 1,71	25,35 1,50	29,60 3,00	34,10 1,50*	24,40 2,19

Примітки. a - 10-2 MDA нмоль / мг білку, b - E / г тканини,

* - вірогідно відносно до контролю (p 0,05)

Навпаки, була з'ясована прооксидантна дія самого анаприліну у досліджених органах (табл. 4).

Таблиця 4

Вплив анаприліну на вміст продуктів ланцюгового переокислення ліпідів у печінці та нирках щурів (M m; n = 6 - 7)

Параметр, що вимірювався	ПЕЧІНКА	НИРКИ
	К	1 год	2,5 год	24,5 год	К	1 год	2,5 год	24,5 год
ТБК- позитивні продукти a	17,00 0,50	22,00 0,90*	19,00 0,80*	23,00 0,60*	28,00 1,55	35,30 1,93*	32,50 0,99*	35,5 2,40*
	Нейтральні ліпіди b
сполуки з ізольован. подвійними зв'язками	11,35 0,41	12,45 0,92	12,80 0,68	13,25 0,98	7,15 0,26	6,15 0,71	8,00 0,64	7,25 0,60
дієнові кон'югати	2,44 0,13	4,04 0,16*	3,58 0,26*	2,74 0,33	1,10 0,04	2,05 0,10*	2,48 0,17*	1,35 0,03*
	Фосфоліпіди b
сполуки з ізольован. подвійними зв'язками	38,85 2,57	40,85 4,33	39,00 2,83	27,40 0,78*	56,50 4,04	53,50 0,73	81,50 1,50*	65,50 7,00
дієнові кон'югати	17,40 1,72	16,20 2,00	19,60 1,61	13,45 0,93*	25,35 1,50	23,80 2,48	37,40 3,28	28,10 2,73

Примітки. a - 10-2 MDA нмоль / мг білку, b - E / г тканини,

* - вірогідно відносно до контролю (p 0,05)

Активація ЛПЛ анаприліном, ймовірно, пов'язана з активацією метаболітами анаприліну мікросомального окислення за участю цитохрому Р450 . Про це свідчить високий рівень ТБК-позитивних продуктів як у печінці, так і у нирках щурів, при відносно невеликих окиснювальних пошкодженнях у фракції мембранних ліпідів (насамперед фосфоліпідів). Нами встановлено (рис. 2, 5), що підвищення вмісту небілкових тіолів, зумовлене розвитком оксидативного стресу під впливом хлориду кобальту, є гормон-незалежним, бо анаприлін не викликав зниження цього показника у печінці щурів (рис. 6).

Дослідження з анаприліном дало змогу з'ясувати органспецифічний характер регуляції активності глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів. Результати наших експеріментів свідчать про те, що у печінці глутатіонпероксидаза і глутатіонтрансферази активуються стресорним рівнем катехоламінів (табл. 5). Тобто, блокування анаприліном -адренорецепторів запобігало фосфорилювання молекул ферментів глутатіонпероксидази та глутатіон-трансферази сАМР-залежними протеінкіназами у печінці щурів і у такий спосіб пригнічувало їх активність.

Таблиця 5

Вплив хлориду кобальту за умов блокади -адренорецепторів анаприліном та самого анаприліну на активність глутатіон-залежних антиоксидантних ферментів у печінці щурів (M m; n = 6 - 7)

Параметр, що вимірювався	К	АНАПРИЛІН + СоСl2	АНАПРИЛІН
		30 хв	2 год	24 год	1 год	2,5 год	24,5 год
Глутатіонпероксидазаа	124,0 7,97	135,0 10,70	90,30 10,50*	90,40 8,80*	109,0 12,40	92,70 8,01*	67,00 8,68*
Глутатіонредуктазаa	49,6 6,25	82,60 6,76*	45,90 6,00	42,76 4,71	54,60 4,97	48,20 4,47	56,00 6,46
Глутатіонтрансферазаb	130,0 4,16	146,0 9,11	96,30 6,46*	99,90 3,80	142,0 12,90	125,0 11,30	130,0 13,20

Примітки. a - нмоль NADPH / мг білку / хв, b - мкмоль 2,4ДНХБ / мг білку / хв,

* - вірогідно відносно до контролю (p 0,05)

Вплив відновленого глутатіону на розвиток оксидативного стресу.

Як відомо, індукція вільнорадикального окислення ліпідів метаболітами кисню зумовлює адаптивну відповідь клітин у формі гіпоксії [Бурлакова Е.Б., Иваненко Г.Ф., Шишкина Л.Н. 1983]. Ключова роль у відтворенні гіпоксичного становища в організмі належить сульфгідрильним сполукам, насамперед відновленому глутатіону та іншим низькомолекулярним тіолам. Тому актуально було дослідити вплив іонів важких металів, зокрема кобальту, на живі організми на тлі введення відновленого глутатіону. Виходячи з цього, ми використали такі умови експерименту: за 15 хв до ін'єкції хлориду кобальту щурам одноразово внутрішньочеревно вводили розчин відновленого глутатіону у дозі 50 мг на 100 г ваги, рН 7.0 [Конвай В.Д., Лукошин А.В., Поспелов В.С. 1988]. Вплив власне GSH вивчали через 15хв, 45хв та 2 год 15 хв після ін'єкції. Також був досліджений вплив тритіолового комплексу кобальту [3GS-Co3+] [Maines M.D., Kappas A. 1976]. Встановлено, що ефект іонів кобальту на 0,5 год у складі хлориду, у складі хлориду на тлі введення екзогенного відновленого глутатіону, а також у складі тритіолового комплексу з глутатіоном, полягав у підвищенні вмісту ТБК-позитивних продуктів у печінці щурів. Проте при сумісній дії відновленого глутатіону і хлориду кобальту спостерігалося підвищення вмісту сполук з ненасиченими подвійними зв'язками в обох фракціях ліпідів до 30 хв експозиції металу, за рахунок ліпід-мобілізуючого ефекту відновленого глутатіону. В нашому спостереженні були виявлені суттєві зміни у стані тіолової системи печінки під впливом відновленого глутатіону (табл. 6).

Необхідно звернути увагу на те, що підвищення рівню одного з субстратів реакції, а саме відновленого глутатіону у складі небілкових сульфгідрильних груп, викликає активацію глутатіон-залежної антиоксидантної системи печінки (табл. 7).

Таблиця 6

Вплив GSH, хлориду кобальту на тлі введення GSH та кобальту у складі тритіолового комплексу на вміст білкових та небілкових тіолів у печінці щурів, (M m; n = 6 - 7)

	К	[3GS+Со3+]	GSH	GSH+СоСl2
		30 хв	15 хв	45 хв	2 год 15 хв	30 хв	2 год	24 год
SH-групи білківа	253,00 30,80	215,00 29,22	511,00 42,91*	787,00 21,00*	477,05 55,20*	215,07 50,54	464,00 29,60*	326,08 26,20*
Небілкові SH-групиa	46,85 7,75	147,21 20,80*	161,50 23,55*	74,50 8,90*	224,50 18,70*	83,90 19,90*	75,20 8,80	71,70 3,10*

Примітки. a - ммоль / г тканини, * - вірогідно відносно до контролю (p 0,05)

Хлорид кобальту і відновлений глутатіон при окремому введенні зумовлюють протилежні зміни в концентрації загальних ліпідів: хлорид кобальту - знижував вміст загальних ліпідів, тоді як відновлений глутатіон - викликав підвищення цього показника. Таким чином, у печінці щурів відновлений глутатіон виявив антиоксидантні протекторні властивості за умов оксидативного стресу не шляхом зв'язування надміру металу (як у випадку з ртуттю), а за рахунок збільшення ємкості тіолової системи та активації глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів.

Таблиця 7

Вплив відновленого глутатіону, хлориду кобальту на тлі введення відновленого глутатіону та кобальту у складі тритіолового комплексу на активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів (ГП - глутатіон-пероксидази, ГР - глутатіонредуктази, ГТ -- глутатіонтрансферази) у печінці щурів, (M m; n = 6 - 7)

ферменти	К	[3GS+Со3+]	GSH	GSH+СоСl2
		30 хв	15 хв	45 хв	2 год 15 хв	30 хв	2 год	24 год
ГПа	115,80 7,16	271,52 14,85*	125,85 13,90	147,17 8,84*	106,80 15,62	262,50 14,85*	111,11 7,38	145,60 23,09
ГРa	43,70 2,80	77,00 5,68*	53,00 4,09	94,40 9,80*	41,90 4,14	59,40 2,51*	44,40 3,43	42,00 3,82
ГТb	65,80 6,20	147,21 20,80*	114,00 7,30*	153,00 12,60*	82,80 3,90	83,90 19,90*	75,20 8,80	71,70 3,40

Примітки. a - нмоль NADPH / мг білку / хв, b - мкмоль 2,4ДНХБ / мг білку / хв,

* - вірогідно відносно до контролю (p 0,05)

У нирках відновлений глутатіон посилював ланцюгове переокислення ліпідів, що ймовірно пов'язано з активацією -глутамілтранспептидази [Stark A.A. 1993]. Збільшення вмісту небілкових сульфгідрильних груп у цьому органі (табл. 8) і субстрат-опосередкована активація глутатіон-залежних антиоксидантних ферментів (табл. 9), теж є наслідком такої активації.

Існує гіпотеза [Hochachka P.W., Buck L.T., Doll C.J., Land S.C. 1996], що кобальт здатний викликати гіпоксичне становище в організмі шляхом зниження спорідненості гемопротеінів крові до кисню за умов їх стабілізації у дезоксіконформації. Таким чином, кобальт-залежна гіпоксія зумовлена зниженням доступу кисню до органів. З іншого боку, розвиток гіпоксії на початкових етапах оксидативного стресу є універсальною відповіддю організму на ряд прооксидантів різноманітної природи, а не тільки хлориду кобальту. Були отримані дані про необхідність відновленого глутатіону у клітинах для реалізації ефекту гіпоксії [Константинова М.М., Минин А.А., Некрасова И.В. 1981]

Таблиця 8

Вплив GSH, хлориду кобальту на тлі введення GSH та кобальту у складі тритіолового комплексу на вміст білкових та небілкових тіолів у нирках щурів (M m; n = 6 - 7)

	К	[3GS+Со3+]	GSH	GSH+СоСl2
		30 хв	15 хв	45 хв	2 год 15 хв	30 хв	2 год	24 год
SH-групи білківа	167,50 14,45	166,00 27,40	105,50 10,25*	244,00 27,55*	186,50 8,25	185,50 9,55	209,00 26,10	171,50 16,90
Небілкові SH-групиa	103,00 11,25	145,00 21,35	311,00 25,00*	185,00 15,35*	306,50 6,55*	87,50 9,65	92,00 10,75	62,50 5,00*

Примітки. a - ммоль / г тканини, * - вірогідно відносно до контролю (p 0,05)

Таблиця 9

Вплив відновленого глутатіону, хлориду кобальту на тлі введення відновленого глутатіону та кобальту у складі тритіолового комплексу на активність глутатіон-залежних антиоксидантних ферментів (ГП - глутатіон-пероксидази, ГР - глутатіонредуктази, ГТ -- глутатіонтрансферази) у нирках щурів (M m; n = 6 - 7)

ферменти	К	[3GS+Со3+]	GSH	GSH+СоСl2
		30 хв	15 хв	45 хв	2 год 15 хв	30 хв	2 год	24 год
ГПа	67,60 6,05	135,00 7,10*	89,90 6,90*	30,70 1,25*	51,20 3,50	80,80 5,20*	63,80 5,74	98,40 5,70*
ГРa	97,30 9,40	97,00 8,20	173,00 11,90*	163,00 5,50*	68,00 7,06*	118,00 3,96	129,00 5,35*	167,00 9,73*
ГТb	43,20 2,99	43,30 3,30	52,90 7,73	44,50 2,50	48,30 2,60	37,20 2,40	35,00 2,70	50,90 2,40

Примітки. a - нмоль NADPH / мг білку / хв, b - мкмоль 2,4ДНХБ / мг білку / хв,

* - вірогідно відносно до контролю (p 0,05)

Проте, біологічна сутність гіпоксійного становища полягає у тому, що утворені у ланцюгових реакціях радікали макромолекул без кисню рекомбінують і відтворюють початковий стабільний стан. У присутності кисню гасіння вільних радикалів відбувається з утворенням нестабільних пероксидних радикалів і хімічне пошкодження закріплюється. Ще один різновид антиоксидантної, протекторної дії відновленого глутатіону саме і полягає в утворенні гіпоксійного становища у клітинах шляхом взаємодії з киснем.

Узагальнюючи вищевикладене, можна відзначити, що введення тваринам сублетальних доз кобальту або ртуті викликає активацію ланцюгового переокислення ліпідів, системи глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів, водночас зі змінами у системі внутрішньоклітинних тіолів. З'ясований прооксидантний вплив анаприліну та антиоксидантний - вільного глутатіону.

ВИСНОВКИ

Сублетальні дози хлоридів кобальту і ртуті викликають переважну активацію різних ланок глутатіонзалежної антиоксидантної системи: хлорид кобальту активує глутатіонпероксидаза-глутатіонредуктаза редоксцикл, хлорид ртуті -- глутатіонтрансферазу.

Відсутність статевих відмін у активації ЛПЛ хлоридом кобальту свідчить про єдиний універсальний механізм активації та сигнальну роль метаболітів вільно-радикальних процесів на ранніх етапах стресу.

Виявлено, що накопичення ТБК-позитивних продуктів під впливом хлориду ртуті носить вторинний характер в результаті зсуву рівноваги ЛПЛ АОЗ у напрямку активації окислення ліпідів в умовах ртуть-залежного виснаження тіолової ланки антиоксидантної системи.

З'ясована протилежно спрямована дія хлоридів кобальту і ртуті на систему тіолів печінки і нирок щурів.

Прооксидантний ефект анаприліну в печінці і нирках щурів не дає змоги використовувати його у якості захисного агенту при інтоксикації хлоридом кобальту.

Одержані результати про різноманітний вплив анаприліну на активність фер-ментів антиоксидантного захисту в печінці і нирках щурів, що пов'язано з органспецифічними засобами регуляції їх активності в умовах оксида-тивного стресу.

Виявлено протекторний антиоксидантний вплив відновленого глутатіону у печінці, тоді як у нирках екзогенний глутатіон активував ЛПЛ.

З'ясовано, що відновлений глутатіон підвищує ємкість тіолової системи і активність глутатіон-залежних антиоксидантних ферментів у печінці щурів.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Калиман П.А., Загайко А.Л., Шаламов Р.В., Ганусова Г.В., Баранник Т.В., Скрипник Э.В., Соколик В.В., Шаби Б.К. Содержание и состав липопротеи-нов крови и печени крыс и некоторые показатели окислительного стресса при введении хлорида кобальта // Укр. біохім. журн. - 1997. - Т.69, №5. - С.112-121.

Соколик В.В., Баранник Т.В. Активность глутатион-зависимых ферментов антиоксидантной защиты и НАДФН-генерирующих дегидрогеназ в условиях окислительного стресса, вызванного хлоридом кобальта // Биологический вестник. - 1998. -- №1. - С.51-56.

Соколік В.В. Вплив хлориду ртуті на ланцюгове переокислення ліпідів та антиокислювальну систему глутатіонового захисту у печінці та нирках щурів // Медична хімія - 1999. - Т.1, №1. - С.33-37.

Калиман П.А., Соколик В.В., Шаби Бони Кристоф. Перекисное окисление липидов и система глутатионовой защиты в печени и почках крыс при введе-нии хлорида кобальта // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. - Труды научной конференции, С.-Петербург. - 1998. - Т.1. - С.294-299.

Соколік В.В. Вплив кобальту на перекисне окислення ліпідів і систему антиоксидантного захисту у печінці та нирках щурів // Тези доповідей VII Укр. біохім. з'їзду (Ч. 1). - Київ. - 1997. -- С.113-114.

АНОТАЦІЯ

Соколік В.В. Вплив хлоридів кобальту і ртуті на ланцюгове переокислення ліпідів, систему тіолів та активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2001 р.

Дисертацію присвячено проблемі активації вільнорадикального окислення ліпідів і антиоксидантного захисту під впливом важких металів (кобальту і ртуті). Встановлено, що кобальт і ртуть діють на різні ланки динамічної системи ЛПЛ АОЗ. Хлорид кобальту виступає безпосереднім індуктором оксидативного стресу в організмі та активатором ланцюгового переокислення ліпідів. Накопичення ТБК-позитивних продуктів в умовах виснаження тіолової ланки антиоксидантної системи хлоридом ртуті носить вторинний характер. Показано, що сублетальна доза хлориду кобальту викликає активацію глутатіонового редоксциклу, а сублетальна доза хлориду ртуті активує пул глутатіонтрансфераз. У печінці та нирках щурів виявлено прооксидантний ефект блокатору -адренорецепторів анаприліну та його органспецифічний вплив на активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів. Знайдено, що екзогенний відновлений глутатіон, збільшуючи ємкість тіолової системи та активуючи GSH-залежні антиоксидантні ферменти, захищає ліпіди печінки в умовах індукованого хлоридом кобальту оксидативного стресу. У нирках показана активація процесів ЛПЛ під впливом відновленого глутатіону. Обговорюється роль у цій активації ниркової ізоформи -глутамілтранспептидази.

Ключові слова: кобальт, ртуть, ланцюгове переокислення ліпідів, тіолова система, глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза, глутатіонтрансфераза, печінка, нирки.

АННОТАЦИЯ

вільнорадикальний окислення ліпідів оксидативний

Соколик В.В. Влияние хлоридов кобальта и ртути на перекисное окисление липидов, систему тиолов и активность глутатион-зависимых антиоксидантных ферментов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2001 г.

Диссертация посвящена проблеме активации свободнорадикального окис-ления липидов и антиоксидантной защиты под действием тяжелых металлов (кобальта и ртути). Установлено, что кобальт и ртуть действуют на разные участки динамической системы ПОЛ АОЗ. Хлорид кобальта является непос-редственным индуктором оксидативного стресса в организме и активатором перекисного окисления липидов. Накопление ТБК-активных продуктов в усло-виях истощения тиолового звена антиоксидантной системы хлоридом ртути носит вторичный характер. Показано, что сублетальная доза хлорида кобальта приводит к активации глутатионового редокс-цикла, а сублетальная доза хлорида ртути активирует пул глутатионтрансфераз. В печени и почках крыс выявлен прооксидантный эффект блокатора -адренорецепторов анаприлина и его органспецифическое влияние на активность глутатион-зависимых анти-оксидантных ферментов. Обнаружено, что экзогенный восстановленный глута-тион, увеличивая емкость тиоловой системы и активность GSH-зависимых антиоксидантных ферментов, оказывает протекторное действие на липиды пе-чени в условиях индуцированного хлоридом кобальта оксидативного стресса. В почках показана активация процессов ПОЛ под действием восстановленного глутатиона, обусловленная активностью почечной изоформы -глутамил-транспептидазы.

Ключевые слова: кобальт, ртуть, перекисное окисление липидов, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, глутатионтрансфераза, печень, почки.

SUMMARY

Sokolik V.V. Cobalt and mercury chlorides effects on lipid peroxidation, system of thiols and activity of glutathione defense antioxodant enzymes. - Manuskript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological by speciality 03.00.04 -- biochemistry. -- Kharkiv National University, Kharkiv, 2001.

The thesis is devoted to the investigathion of the lipid peroxidathion under oxidative stress development, caused by cobalt chloride, and intoxication, caused by mercury chloride. Lipid peroxidathion has been identified as a basic deteriorative reaction involved in the aging processes, cancer initiation and promothion, alkoholic liver diseases and several degenerative diseases. Increased lipid peroxidathion is responsible for hepatic damage and atherosclerosis in humans. Injection of havy metals ions and hepatotoxic agents including CCl4 and other xenobiotics lead to a rapid increase in hepatic lipid peroxide products. This process is accompanied by damagy of the main classes of biological macromolecules and its complexes including biological membranes also by decrease of macroergs contents. There are a numder of enzymatic and noenzymatic factors that contribute to the protection of aerobic ordanisms from on expreaa of free radicals. These factors are collectively referred to as the antioxidant defense system and include the glutathion peroxidase (GP), glutathion reductase (GR), glutathion S-transferase (GT), reduced glutathione (GSH) and other factors. So lipid peroxidathion, thiols status and antioxidant GSH-dependent system in liver and kidney in Wistar rats (weight 180-220 g) in various terms after single injection of cobalt chloride, mercury chloride, propranolol or GSH have been inveatigated in present work. The dissertation consists on the introduction, the review of the literature on the closen theme, the description of the main methods of the investigation, 3 parts of experimental results with their discussion, conclusions and literature cited. Approximately liver and kidney homogenates (20%) was used fresh, for analysis of thiobarbituric acid reaction substances (TRABS production), levels of diene-conjugated and other lipid peroxidation products. A portion was freeze-clamped, frozen in lijuid nitrogen and stored dt -70oC until thiols grups consentrathions and GP, GR, GT activities were determined. In the experiments it has been shown that onetime administration of cobalt chloride or mercury chloride in doses near to LD50 leads to increased products of lipid peroxidation of hepatic lipids. Activation of free-radical oxidation is accompanied by changes in system of thiols and activaty of glutathione defense antioxidant system in cobalt-treatment animals. On the other hand, it was found, that mercury chloride influence on the system lipid peroxidation antioxydant defence is indyrect. HgCl2 not only enhances lipoperoxidation but also complexes with sulphydryl-containing amino asids and peptides such as cysteine and reduced glutathione, resulting is depleted GSH, a substrate for glutathion peroxidase (GP) and glutathion S-transferase (GT) in cells. Co-administration cobalt chloride and by propranolol, blocators of the -adrenoreseptors) resulted in higher TBARS production in liver and kidney homogenates. The increased products of lipid peroxidation of propranolol may be explained by an altered cellular membrane structure or to induce of cytochrome P-450. In kidney the increases in GP, GR and GT activity may be in response to the generation of lipid peroxides following propranolol metabolism. So the data obtained also show that the oxidative stress caused by one-time cobalt-chloride injection leads to hormone defence activation hepatic GP and GT, in contrast to kidney. Our results showed that in vivo antioxodant reduced glutathione limit free radical-mediated chain reaction of hepatic cellular lipids. In the liver, the effects of co-administration reduced glutathione and cobalt chloride of the lipid peroxidation were less demonstrative than in the case of CoCl2. This could be explained by a prevention of activation GP, GR and GT. In contrast to liver, GSH administration had no effect on kidney under oxidative stress development, caused by cobalt chloride. This could be explained by the increases in gamma-glutamyl transpeptidase activity of kidney.

It has been concluded that lipid peroxidation and glutathione defense antioxodant system in the organism is activated under oxidative stress conditions.

Key words: cobalt, mercury, lipid peroxidation, system of thiols, glutathion perocsidase, glutathion reductase, glutathion S-transferase, liver, kidney.

Размещено на Allbest.ru

...