Тритерпенові глікозиди плюща канарського Hedera Canariensis willd

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ім. О.В. БОГАТСЬКОГО

УДК 547.918:543.422

ТРИТЕРПЕНОВІ ГЛІКОЗИДИ ПЛЮЩА КАНАРСЬКОГО

HEDERA CANARIENSIS WILLD.

02.00.10 - біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Яковішин Леонід Олександрович

Одеса - 2001

АНОТАЦІЇ

Яковішин Л.О. Тритерпенові глікозиди плюща канарського Hedera canariensis Willd. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, Одеса, 2001.

Дисертація присвячена вилученню та встановленню будови тритерпенових глікозидів листя, стеблів та кореня плюща канарського Hedera canariensis. Встановлено, що глікозиди плюща є глікозиди олеанолової та ехіноцистової кислот, хедерагеніну, 30-нор-хедерагеніну та каулофілогеніну. Глікозиди двох останніх агліконів уперше знайдені у роді плющ (Hedera) та родині аралієвих (Araliaceae). З сорока вилучених глікозидів вісім є новими сполуками. Будову глікозидів встановлено комплексом хімічних методів та спектроскопії ЯМР. Виявлена залежність гемолітичної та іхтіотоксичної активностей вилучених глікозидів від будови їх агліконних та вуглеводних частин.

Ключові слова: тритерпенові глікозиди, Araliaceae, Hedera canariensis Willd., ¹Н- та ¹³С-ЯМР, гемолітична та іхтіотоксична активності.

Яковишин Л.А. Тритерпеновые гликозиды плюща канарского Hedera canariensis Willd. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Физико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса, 2001.

Диссертация посвящена выделению и установлению строения тритерпеновых гликозидов листьев, стеблей и корней плюща канарского Hedera canariensis. Установлено, что гликозиды плюща представляют собой гликозиды олеаноловой и эхиноцистовой кислот, хедерагенина, 30-нор-хедерагенина и каулофиллогенина. Гликозиды двух последних агликонов впервые обнаружены в роде плющ (Hedera) и семействе аралиевых (Araliaceae). Из сорока выделенных гликозидов восемь являются новыми соединениями. К ним относятся гликозиды L-E₂, L-G₁', L-G_1b и L-H₃, представляющие собой, соответственно, 3-O--L-рамнопиранозил-(12)-О--L-арабинопиранозид и 3-О--L-арабинопиранозил-28-О--L-рамнопиранозил-(14)-О--генциобиозиловый, 3-O--L-рамнопиранозил-(12)-О--L-арабинопиранозил-28-О--L-рамнопиранозил-(14)-О-(6-О-ацетил--D-глюкопиранозил)-(16)-О--D-глюкопиранозиловый и 3-O--L-рамнопиранозил-(12)-О--L-арабинопиранозил-28-О--L-рамнопиранозил-(16)-О--генциобиозиловый эфиры 30-нор-хедерагенина, гликозиды L-F₂ и L-I₂ - 3-O--L-рамнопиранозил-(12)-О--L-арабинопиранозид каулофиллогенина и его 28-О--L-рамнопиранозил-(14)-О--генциобиозиловый эфир, а также гликозиды St-E₁ и L-G₀ - 3-O--L-арабинопиранозил-28-О--L-рамнопиранозил-(14)-О--генциобиозиловый и 3-O--L-рамнопиранозил-(12)--L-арабинопиранозил-28-О--L-рамнопиранозил-(14)-О-(6-О-ацетил--D-глюкопиранозил)-(16)-О--D-глюкопиранозиловый эфиры эхиноцистовой кислоты. Гликозиды L-E₂, L-G₁', L-G_1b, L-H₃, L-F₂, L-I₂ и L-G₀ выделены из листьев, а St-E₁ - из стеблей плюща канарского. Строение гликозидов установлено комплексом химических методов и спектроскопии ЯМР.

Показаны значительные качественные и количественные различия в гликозидном составе листьев, стеблей и корней плюща канарского. Во всех изученных органах гликозиды хедерагенина являются преобладающими. Гликозиды 30-нор-хедерагенина и каулофиллогенина, а также частично ацетилированные гликозиды, найдены только в листьях. Кислые гликозиды с остатком глюкуроновой кислоты присутствуют в стеблях и корнях и не обнаружены в листьях плюща канарского. Кроме того, в стеблях и корнях не найдены нейтральные гликозиды олеаноловой кислоты.

Выявлена зависимость гемолитической активности выделенных гликозидов от строения их агликонных и углеводных частей в эксперименте in vitro. Показано, что для проявления высокой гемолитической активности гликозидами необходимо наличие в их агликоне свободной карбоксильной и гидроксильной групп. Гликозиды, в агликоне которых отсутствует одна метильная группа (30-нор-хедерагенин) или содержатся две гидроксигруппы (каулофиллогенин), показали значительно меньшую гемолитическую активность. Биозидные гликозиды оказались более активными, чем их моноозидные аналоги. У бисдесмозидных гликозидов гемолитическая активность не отмечена. Аналогичная зависимость выявлена и для ихтиотоксической активности гликозидов плюща канарского.

Ключевые слова: тритерпеновые гликозиды, Araliaceae, Hedera canariensis Willd., ¹Н- и ¹³С-ЯМР, гемолитическая и ихтиотоксическая активности.

Yakovishin L.A. Triterpene glycosides of Canarian ivy Hedera canariensis Willd. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. - A.V. Bogatsky Physico-Chemical Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Odessa, 2001.

The dissertation is devoted to the isolation and structural elucidation of triterpene glycosides from Hedera canariensis (Canarian ivy) leaves, stems and roots. It was found that the ivy glycosides are glycosides of oleanolic and echinocystic acids, hederagenin, 30-nor-hederagenin and caulophyllogenin. Glycosides of two last aglycons were found in the Hedera genus and Araliaceae family for the first time. Among 40 isolated glycosides, 8 are the new compounds. The structures of glycosides were established by complex of chemical methods and the NMR-spectrometry. A connection between the haemolytic and ichthyotoxic activites of isolated glycosides with aglycons' and carbohydrate moieties' structures was established.

Key words: triterpene glycosides, Araliaceae, Hedera canariensis Willd., ¹H- and ¹³C-NMR, haemolytic and ichthyotoxic activites.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі органічної хімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського Міністерства освіти і науки України, м. Сімферополь.

Науковий керівник: кандидат хімічних наук, доцент Гришковець Володимир Іванович, Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського, доцент кафедри органічної хімії

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор Давиденко Тетяна Іванівна, Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, завідувач відділу фізико-хімічних основ біотехнології

доктор хімічних наук, професор Кінтя Павло Костянтинович, Інститут генетики АН Республіки Молдова, завідувач лабораторії природних біорегуляторів генетичних процесів

Провідна установа

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка Міністерства освіти і науки України, кафедра органічної хімії, м. Київ

Захист відбудеться “24” травня 2001 р. о 10 ⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.219.02 при Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України за адресою: 65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України за адресою: 65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86.

Автореферат розісланий “20” квітня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради кандидат хімічних наук, с.н.с. Литвинова Л.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед лікарських рослин, що містять тритерпенові глікозиди, особливе місце належить представникам родини аралієвих (Araliaceae Juss.). З них найбільш важливими для всесвітнього комерційного використання є женьшень, елеутерокок колючий та плющ звичайний.

Листя плюща звичайного (Hedera helix L.) здавна застосовували у Європі для лікування кашлю. Новий німецький лікарський препарат “Геделікс сироп”, що з'явився останнім часом на українському фармацевтичному ринку, зроблено з екстракту листя цієї рослини. Він показаний при гострому і хронічному запаленні дихальних шляхів та не викликає побічних ефектів. Водно-спиртовий екстракт з листя Hedera helix (“Prospan”) застосовують як спазмолітичний засіб.

Протягом століть плющ використовували і у народній медицині як протизапальний та антимікробний засіб для лікування циститу, запалення сечового міхура та пухкої сполучної тканини, при жовчокам'яній хворобі, целюліті та зниженні функцій щитоподібної залози. Як косметичний засіб він знайшов використання для лікування педикульозу, корости, бородавок та облисіння.

Крім плюща звичайного вивчено глікозидний склад деяких інших видів роду плющ (Hedera L.) - плющів кримського (Hedera taurica), непальського (Hedera nepalensis), ромбічного (Hedera rhombea), кавказького (Hedera caucasigena), колхидського (Hedera colchica) та Пастухова (Hedera pastuchovii). Одним з невивчених видів роду плющ є плющ канарський Hedera canariensis Willd., який успішно інтродукован в Україні (м. Донецьк та Крим). Попередні дані про його тритерпенові глікозиди, які отримані в лабораторії хімії природних сполук Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського, свідчать, що за загальним вмістом глікозидів він не поступає плющу звичайному, але має визначені якісні розбіжності у глікозидному складі.

Нещодавно під час проведення спільних досліджень в Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського та Таврійському національному університеті ім. В.І. Вернадського був розроблен і запатентован спосіб стимулювання гуморальної та клітинної імуної відповіді при використанні як ад'ювантів тритерпенових глікозидів рослин роду плющ. В подальшому планується вивчити імунну активність тритерпенових глікозидів плюща канарського. Однак відомо, що в деяких випадках застосування глікозидів як імуноад'ювантів може бути обмежено їх цитотоксичністю. Тому було визначено один з видів цитотоксичної дії вилучених глікозидів - гемолітична активність, яка для глікозидів плюща канарського раніше не досліджувалась.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження глікозидного складу плюща канарського проведено у рамках науково-дослідної роботи кафедри органічної хімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського за програмами “Вивчення будови і біологічних властивостей вуглеводів та вуглеводовмісних сполук та біополімерів” (№ Держ. реєстрації 0197U001964 - 1996-2000 рр.) та “Отримання нових біологічно активних сполук на основі мурамоїлдипептиду та природних тритерпеноїдів” (№ Держ. реєстрації 0197U000423 - 1997-1999 рр.). У вказаних роботах автор був співвиконавцем, його участь зводилася до вилучення індивідуальних тритерпенових глікозидів, встановлення їх будови та вивчення їх біологічної активності. Дослідження виконані при частковій фінансовій підтримці Міжнародної Науково-Освітньої Програми (ISEP) (грант № PSU083096).

Мета і задачі дослідження. Метою цієї роботи було вилучення та встановлення повної структури тритерпенових глікозидів плюща канарського, а також виявлення залежності біологічної активності від їх структури.

Основні завдання дослідження:

а) вилучення, розподіл та очищення тритерпенових глікозидів з листя, стеблів та кореня плюща канарського;

б) встановлення будови вилучених сполук комплексом хімічних та спектральних методів;

в) порівняльний фітохімічний аналіз листя, стеблів та кореня Hedera canariensis; глікозид канарський плющ фітохімічний

г) встановлення залежності між гемолітичною активністю вилучених глікозидів та структурою їх агліконних та вуглеводних частин;

д) оцінка іхтіотоксичної активності глікозидів плюща канарського.

Об'єкт дослідження. Плющ канарський Hedera canariensis Willd. (родина аралієвих Araliaceae).

Предмет дослідження. Тритерпенові глікозиді плюща канарського, їх гемолітична та іхтіотоксична активності.

Методи дослідження. Тритерпенові глікозиди аналізували та препаративно розподіляли хроматографічними методами. Будову індивідуальних сполук встановлювали хімічними (кислотний та лужний гідролізи, амоноліз та метилування діазометаном) та спектральними (спектроскопія ЯМР ¹Н та ¹³С) методами. Гемоліз контролювали методом фотометрії.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вилучені тритерпенові глікозиди з різних органів плюща канарського та встановлена їх повна структура. Проведено порівняльне фітохімічне дослідження листя, стеблів та кореня цієї рослини. З листя плюща канарського вилучено двадцять три тритерпенових глікозидів, з стеблів - дванадцять та з кореня - п'ять. Серед вилучених глікозидів вісім виявилися новими сполуками. Вперше в роді плющ і родині аралієвих знайдені глікозиди 30-нор-хедерагеніну і каулофілогеніну, отримані та інтерпретовані їх ¹Н- і ¹³С-ЯМР-спектральні дані.

Вперше вивчені гемолітична та іхтіотоксична активності глікозидів плюща канарського. Показана залежність активностей від структури аглікону та вуглеводних частин.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлені повні структури значної кількості мінорних глікозидів, серед яких знайдені глікозиди рідкісних агліконів - 30-нор-хедерагеніну та каулофілогеніну. Це дає можливість оцінювати ступінь біохімічного споріднення представників раніше вивчених видів роду плющ і плюща канарського та на підставі цього робити таксономічні висновки.

При вивченні ряду вилучених глікозидів розширені фактичні дані стосовно зв'язку структури з біологічною активністю. Отримані результати щодо залежності “структура-активність” дозволяють прогнозувати ступінь токсичної дії тритерпенових глікозидів.

Показано, що плющ канарський може бути джерелом тритерпенових глікозидів, аглікони яких належать до олеананового типу. Глікозидний склад листя Hedera canariensis є достатньо близьким до складу листя Hedera helix, препарати на підставі якого використовуються у сучасній та народній медицині, що є передумовою для створення на основі Hedera canariensis лікарських препаратів. Знайдені розбіжності у глікозидному складі листя плющів звичайного і канарського припускають необхідність порівняльного вивчення фармакологічної активності їх екстрактів.

Особистий внесок здобувача полягає у постановці задач роботи та виборі загальної методики та основних методів дослідження. Автором самостійно проведено вилучення, розподіл, очищення та встановлення будови тритерпенових глікозидів хімічними методами. Спектри ЯМР глікозидів були отримані д.х.н. О.С. Шашковим (Інститут органічної хімії РАН, м. Москва) та к.х.н. І.Н. Щіпановою (Інститут хімічної фізики РАН, м. Москва). Інтерпретація спектральних даних виконана спільно з О.С. Шашковим і науковим керівником. Обговорення та аналіз результатів досліджень проведені з співавторами друкованих праць. Вивчення біологічної активності здійснено з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на Другому та Третьому Міжнародних симпозіумах з хімії природних речовин (Ескішехір, Туреччина, 1996; Бухара, Республіка Узбекістан, 1998), Першому Міжнародному конгресі з алелопатії (на Симпозіумі з алелопатичних взаємодій у агролісових системах) (Кадіс, Іспанія, 1996), Першій Всеросійській конференції з ботанічного ресурсознавства (Санкт-Петербург, Російська Федерація, 1996), Четвертій Міжнародній конференції з медичної ботаніки (Київ, Україна, 1997), Міжнародній конференції з природних продуктів та фізіологічно активних речовин (Новосибірськ, Російська Федерація, 1998), Десятому Європейському симпозіумі з вуглеводів “Eurocarb X” (Голуей, Ірландія, 1999), Міжнародному симпозіумі “Сапоніни у їжі, кормах та медичних рослинах” (Пулави, Польща, 1999), Третій конференції молодих вчених та студентів-хіміків південного регіону України (Одеса, Україна, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 статтей та 11 тез доповідей на симпозіумах та конференціях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, літературного огляду (розділ 1), загальної методики та основних методів дослідження (розділ 2), експериментальної частини та методики дослідження (розділ 3), обговорення результатів (розділ 4), висновків та списку використаних літературних джерел, що містить 117 праць. Робота викладена на 153 сторінках машинописного тексту та илюстрована 22 таблицями і 9 рисунками.

Автор висловлює щиру подяку ведучому науковому співробітнику, д.х.н. Шашкову О.С. за зйомку ЯМР-спектрів та допомогу у їх інтерпретації, а також д.б.н. Н.Н. Арнаутову (Ботанічний інститут ім. В.Л. Комарова РАН, м. Санкт-Петербург) за рослинний матеріал.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали і методи

Тритерпенові глікозиди листя, стеблів та кореня екстрагували п'ятьма порціями 80% водного пропанолу-2. Розподіл суми екстрактивних речовин здійснено препаративною хроматографією на сілікагелі при градієнтному елююванні системами хлороформ-етанол-вода. Розподіл вузьких фракцій глікозидів проведено на високоефективному мікросферичному сілікагелі. Додаткову очистку глікозидів від домішків фенольних глікозидів здійснено рехроматографуванням на сілікагелі з елюентом хлороформ-етанол-аміак. Після розподілу та очищення отримали двадцять три тритерпенових глікозидів з листя, дванадцять глікозидів з стеблів та п'ять - з кореня плюща канарського.

Для встановлення будови вилучених сполук проведено їх кислотний та лужний гідролізи, а також знято їх спектри ЯМР ¹Н и ¹³С. Наявність чи відсутність вільної карбоксильної групи у молекулах глікозидів підтверждено результатами метилування ефірним розчином діазометану. Ряд глікозидів ідентифіковано ТШХ в порівнянні з відомими зразками. ТШХ-аналіз та контроль за розподілом глікозидів виконували на платівках “Silufol”. Детектування агліконів та тритерпенових глікозидів здійснювали за допомогою фосфорновольфрамової кислоти. Вуглеводи виявляли кислим фталатом аніліну.

Гемолітичну активність визначали для монодесмозидних та бісдесмозидних глікозидів Hedera canariensis. Глікозиди розчиняли у ізотонічному фосфатному буфері. Використовували суспензію еритроцитів крові свині у фосфатному буфері. Гемоліз контролювали методом фотометрії у видимій ділянці спектру. Іхтіотоксичну активність встановлювали на рибах гупіях Poecilia reticulata (родина пецилієвих Poeciliidae). Активність глікозидів порівнювали з дією комерційного препарату “Saponin”, що містить суміш сапонінів з видів гіпсофіли Gypsophilla.

Глікозиди листя плюща канарського

Ідентифікація глікозидів листя плюща канарського. Структура глікозидів L-A (1), L-B₁ (2), L-B₂ (3), L-C (4), L-D (5), L-E₁ (6), L-F₁ (8), L-F₃ (10), L-G₁ (12), L-G_1a (14), L-G₂ (16), L-G₃ (17), L-G₄ (18), L-H₁ (19), L-H₂ (20) та L-I₁ (22) (див. табл. 1) встановлена на основі результатів кислотного і лужного гідролізів та метилування діазометаном. Крім того, глікозиди 1-6, 8, 12, 16-20, 22 та прогеніни з 10, 12, 14, 16, 17, 19, 20 та 22 ідентифіковані по ТШХ у порівнянні з відомими зразками. Будова вилучених сполук також підтверджена порівнянням величин хімічних зсувів сигналів їх ¹³С-атомів з наведеними в літературі.

Встановлення структури нових глікозидів L-E₂ (7), L-G₁' (13) та L-H₃ (21). Повний кислотний гідроліз глікозиду L-E₂ (7) дає рамнозу, арабінозу та неідентифікований аглікон, близький за хроматографічною рухомістю до хедерагеніну. Крім того, 7 не змінюється за умов лужного гідролізу, але метилюється ефірним розчином діазометану, що свідчить як про наявність вільної карбоксильної групи в агліконі, так і про звичайний тип глікозидного зв'язку вуглеводної частини з агліконом.

У ПМР-спектрі 7 легко ідентифіковані дублетні сигнали двох аномерних протонів залишків рамнози та арабінози. Сигнали, відповідні іншим скелетним протонам моносахаридних залишків,

Размещено на http://www.allbest.ru/



Таблиця 1

Тритерпенові глікозиди листя Hedera canariensis¹

Глікозид	С т р у к т у р а	Вихід, %2
L-A (1)	AraOlean A	3,1310-2
L-B1 (2)	AraEchinA	6,2510-2
L-B2 (3)	Ara Hed	9,3810-2
L-C (4)	Rha12Ara Olean A	1,0910-1
L-D (5)	Rha12Ara Echin A	2,3410-1
L-E1 (6)	Rha12Ara Hed	2,19
L-E2 (7)	Rha12Ara nor-Hed	1,5610-1
L-F1 (8)	Rha12Glc Hed	4,6910-2
L-F2 (9)	Rha12Ara Caul	9,3810-2
L-F3 (10)	Rha12Ara Olean A Glc61Glc41Rha 6 OAc	3,1310-2
L-G0 (11)	Rha12Ara Echin A Glc61Glc41Rha 6 OAc	1,7210-1
L-G1 (12)	Ara HedGlc61Glc41Rha	1,0910-1
L-G1' (13)	Ara nor-Hed Glc61Glc41Rha	9,3710-3
L-G1a (14)	Rha12Ara HedGlc61Glc41Rha 6 OAc	4,6910-2
L-G1b (15)	Rha12Ara nor-Hed Glc61Glc41Rha 6 OAc	4,6810-3
L-G2 (16)	Rha12Ara Olean A Glc61Glc41Rha	1,8810-1
L-G3 (17)	Rha12AraHedGlc61Glc	9,3810-2
L-G4 (18)	Rha12AraHed 4 Glc61Glc41Rha	6,2510-2
L-H1 (19)	Rha12Ara Echin A Glc61Glc41Rha	3,1310-1
L-H2 (20)	Rha12Ara HedGlc61Glc41Rha	4,69
L-H3 (21)	Rha12Ara nor-Hed Glc61Glc41Rha	2,1910-1
L-I1 (22)	Rha12GlcHed Glc61Glc41Rha	3,1310-2
L-I2 (23)	Rha12Ara Caul Glc61Glc41Rha	6,2510-2

Примітки:

1. Умовні позначки в табл. 1 та 2: Rha - -L-рамнопіранозил, Ara - -L-арабінопіранозил, Glc - -D-глюкопіранозил, GlcUA - -D-глюкуронопіранозил, Ас - ацетил, Olean A - олеанолова кислота, Hed - хедерагенін, Echin A - ехіноцистова кислота, nor-Hed - 30-нор-хедерагенін, Caul - каулофілогенін.

2. Тут і в табл. 2 вихід приведено у перерахунку на суху масу рослинної сировини знайдені за допомогою двомірної гомоядерної кореляційної спектроскопії COSY. Під час аналізу ¹³C-ЯМР-спектру 7 в області 90-110 м.д. знайдені три сигнала, з яких два є сигналами С- атомів в групах CH і віднесені до аномерних C-атомів залишків рамнози та арабінози. Типи конформацій моносахаридних залишків підтверджуються величинами констант спін-спінової взаємодії (КССВ) у спектрі ПМР. Величини хімічних зсувів інших С-атомів вуглеводної частини 7 повністю збігаються з літературними даними для дисахаридного фрагменту -L-Rha_p-(12)-О--L-Ara_p, що найчастіше зустрічаються в глікозидах рослин родини аралієвих.

Порівняння хімічних зсувів інших сигналів в ¹³С-ЯМР-спектрі 7, що відповідають агліконної частини глікозиду, з хімічними зсувами 3-О-глікозильованої олеанолової кислоти виявляє значні розбіжності між ними, але порівняння одержаних спектральних даних з хімічними зсувамі 3-О-глікозильованого хедерагеніну виявило збіг величин хімічних зсувів для C-атомів в кільцях A-D, але істотні розбіжності для атомів кільця E. Звісно, одному з атомів кільця E належить третій сигнал в області 90-110 м.д., який входить у групу CH₂, що випливає із зіставлення J-модульованого спектру ЯМР ¹³С та підспектру четвертичних С-атомів. У спектрі ЯМР ¹³С глікозида 7 без спінової розв'язки від протонів цьому С-атому належить триплет з КССВ J_CH 152 Гц, відповідний sp²-гібридному атому карбону, який з врахуванням величини хімічного зсуву є олефіновим С-атомом у групі =СH₂. З врахуванням цього два уширених “синглетних” сигнали (W_1/2 = 7 Гц) в області 4.7 м.д. спектра ПМР, що мають крос-піки тільки між собою у спектрі COSY, належать до хімічно нееквівалентних AB-протонів цього кінцевого подвійного зв'язку. При цьому уявляється зрозумілою і форма піків цих сигналів, що є нерозв'язаними складними мультіплетами з невеликою гемінальною КССВ ²J_AB у декілька герц та додатково малими далекими константами ⁴J з протонами у С-19 та С-21. Сигнал з 149.3 м.д., що залишився неідентифікованним, у ¹³С-ЯМР-спектрі 7 належить іншому дизаміщеному С-атому цього подвійного зв'язку, що знаходиться у кільці E. При цьому екзоциклічний тип подвійного зв'язку можливий лише за відсутністю однієї з метильних груп у С-20 (30-нор-тритерпеноїди), що й підтверджується відсутністю одного з сигналів метильних груп у ПМР-спектрі 7 у порівнянні з глікозидами хедерагеніну. Зіставлення хімічних зсувів сигналів С-атомів кільця Е (С-17 - С-22), що залишилися, з літературними даними для цих атомів у 30-нор-олеаноловій кислоті та її глікозидах дозволило однозначно виконати їх віднесення. Таким чином, агліконом глікозиду 7 є 30-нор-хедерагенін (3,23-дигідрокси-30-нор-олеан-12,20(29)-діен-28-ова кислота), а сам глікозид є 3-O--L-рамнопіранозил-(12)-O--L-арабінопіранозидом 30-нор-хедерагеніну. Нещодавно глікозиди 30-нор-хедерагеніну були виявлені у Akebia quinata (Lardizabalaceae).

Результати ТШХ-аналізу продуктів повного кислотного гідролізу свідчать, що аглікон глікозидів L-G₁' (13) та L-H₃ (21) ідентичний аглікону з глікозиду 7, а вуглеводний склад містить однакові моносахариди - рамнозу, арабінозу та глюкозу. Лужний гідроліз 13 дає прогенін, у повному кислотному гідролізаті якого ідентифіковані арабіноза та 30-нор-хедерагенін. У результаті лужного гідролізу 21 вилучено прогенін, який є ідентичним по ТШХ з 7, що частково визначає структуру 21. На відміну від 7, глікозиди 13 та 21 не метилюються ефірним розчином діазометану.

У спектрі ЯМР ¹Н 13 ідентифіковані сигнали аномерних протонів одного залишку арабінози, двох залишків глюкози та одного залишку рамнози, крім того, знайдено повний збіг величин хімічних зсувів сигналів ¹³С-атомів вуглеводних ланцюгів 13 з наведеними у літературі для фрагментів -L-Ara_p та -D-Glc_p-(61)--D-Glc_p-(41)--L-Rha_p. На підставі проведених досліджень для глікозида 13 запропонована структура 3-O--L-арабінопіранозил-28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--генціобіозилового естеру 30-нор-хедерагеніну.

У ПМР-спектрі 21 легко ідентифіковані сигнали п'яти аномерних протонів, з котрих два аналогічні таким у глікозиді 7, три останні відповідні трисахаридному фрагменту по карбоксильній групі аглікону. Повні віднесення сигналів скелетних протонів моносахаридних залишків виконані з використанням спектроскопії COSY ¹Н-¹Н. Характер розщеплення цих сигналів відповідає двом залишкам рамнопіранози, двом залишкам -глюкопіранози та одному залишку -арабінопіранози, а хімічні зсуви збігаються з літературними даними для фрагментів -L-Rha_р-(12)-О--L-Ara_р та -D-Glc_p-(61)--D-Glc_p-(41)--L-Rha_p.

У спектрі ЯМР ¹³С 21 сигнали С-атомів агліконної частини практично ідентичні таким для 7 за винятком невеликих ефектів глікозилювання карбоксильної групи, що з'являються на атомах С-16, С-17, С-18 та С-22. Це додатково підтверджує структуру аглікону глікозида 21 як 30-нор-хедерагенін. Сигнали ¹³С-атомів дисахаридного фрагменту по гідроксильній групі у атома C-3 аглікону знайдені шляхом порівняння зі спектром глікозида 7. Хімічні зсуви решти сигналів, які належать до трисахаридного фрагмента по карбоксильній групі аглікону, повністю збігаються з літературними даними для фрагменту -D-Glc_p-(61)--D-Glc_p-(41)--L-Rha_p. Таким чином, 21 є 3-O--L-рамнопіранозил-(12)-О--L-арабінопіранозил-28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--генціобіозиловий естер 30-нор-хедерагеніну.

Встановлення будови нових глікозидів L-G₀ (11) та L-G_1b (15). За результатами повного кислотного гідролізу вуглеводний склад цих глікозидів однаковий та представлений рамнозою, арабінозою і глюкозою. Агліконом 11 є ехіноцистова кислота, а у 15 - 30-нор-хедерагенін. Розщепленням ацилглікозидних зв'язків у 11 та 15 в умовах жорсткого лужного гідролізу вилучені прогеніни, які ідентичні, відповідно, глікозидам 5 та 7. Амонолізом 11 та 15 вилучені більш полярні глікозиди 19 та 21. Це частково обумовлює структуру 11 та 15 та припускає наявність у них додатково ацильної (ацильних) груп. Питання про кількість, природу та локалізацію ацильних груп вирішено на підставі спектрів ЯМР ¹Н і ¹³С. У спектрах ПМР глікозидів 11 та 15 спостерігається по одному трьохпротонному синглетному сигналу з 1.90 та 1.91 м.д. (відповідно) у області, яка характерна для ацетатів. У спектрах ЯМР ¹³С глікозидів 11 та 15 у порівнянні зі спектрами 19 та 21 знайдені по два додаткових сигнали С-атомів з 21.2 і 21.4 м.д. та 171.6 і 171.7 м.д., віднесених до ацетильної групи. Місце локалізації ацетильної групи встановлено шляхом порівняння ЯМР- підспектрів вуглеводних частин 11 та 15 з підспектрами неацетильованих фрагментів ?-L-Rhaр''-(1?2)-О-?-L-Araр'? та ??-D-Glcp'''-(6?1)-?-D-Glcp''''-(4?1)-?-L-Rhap'''''. При цьому спостерігаються низькопольні зсуви сигналів атомів Н-5'''', Н-6А'''', Н-6В'''', С-6'''', С-4'''' та високопольний зсув на атомі С-5''''. Це обумовлює розташування О-ацетильної групи у атома С-6 залишку Glc''''. Крім того, величини хімічних зсувів атомів карбону трисахаридного ланцюгу у 11 та 15 повністю збігаються з зсувами для фрагменту ??-D-Glcp'''-(6?1)-(6-ОАс-?-D-Glcp'''')-(4?1)-?-L-Rhap'''''. Отож, для глікозидів 11 та 15 запропоновано структури 3-O-?-L-рамнопі-ранозил-(1?2)-О-?-L-арабінопіранозил-28-О-?-L-рамнопіранозил-(1?4)-О-(6-О-ацетил-?-D-глюкопіранозил)-(1?6)-О-?-D-глюкопіранозилових естерів ехіноцистової кислоти та 30-нор-хедерагеніну, відповідно.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Фрагмент спектра COSY 1H-1H (400 МГц) глікозида L-I2 (23)

Нові глікозиди L-F₂ (9) та L-I₂ (23). У повному кислотному гідролізаті глікозида L-F₂ (9) знайдено цукри: рамноза, арабіноза та неідентифікований аглікон. Глікозид 9 не змінюється в умовах лужного гідролізу, але метилюється ефірним розчином діазометану, що свідчить про наявність вільної карбоксильної групи у складі його агліконної частини. Повний кислотний гідроліз глікозида L-I₂ (23) дає рамнозу, арабінозу, глюкозу та той же аглікон, що й у глікозиді 9. На відміну глікозиду 9, глікозид 23 не метилюється діазометаном, а при лужному гідролізі дає прогенін, що є ідентичним по ТШХ у різних системах розчинників з 9. Це доводить наявність у складі 23 у порівнянні з 9 додаткової вуглеводної частини по карбоксильній групі аглікону.

У ПМР-спектрі 23 знайдені сигнали п'яти аномерних протонів та за допомогою методики COSY (рис. 1) відповідні їм сигнали інших скелетних протонів. Характер розщеплення цих протонів відповідає двом залишкам -рамнопіранози, двом залишкам -глюкопіранози та одному залишку -арабінопіранози, а величини хімічних зсувів збігаються з такими для фрагментів -L-Rha_р-(12)-О--L-Ara_р та -D-Glc_p-(61)--D-Glc_p-(41)--L-Rha_p. У спектрі ЯМР ¹Н 9 аналогічно знайдені сигнали, що відповідають тільки дисахаридному фрагменту -L-Rha_р-(12)-О--L-Ara_р.

Остаточне встановлення структури аглікону у 9 та 23 проведено аналізом їх спектрів ЯМР ¹³С. При цьому у низькопольній (>80 м.д.) області спектру спостерігаються сигнали одного С-атома карбоксильної групи аглікону, двох С-атомів тризаміщеного подвійного зв'язку у атома С-12, а також атома С-3, хімічний зсув якого дозволяє припустити наявність замісника у С-23-атома аналогічно хедерагеніну. При цьому у ПМР-спектрах 9 та 23 за допомогою методики COSY знайдені по два дублетних сигнали протонів, що мають між собою спін-спіновий зв'язок і по величинам КССВ та хімічних зсувів відповідають АВ-протонам у С-23-атома в групі СН₂ОН.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Порівняння ¹³С-ЯМР-спектрів 9 і 23 зі спектром 3-О-глікозильованого хедерагеніну показало збіг величин хімічних зсувів сигналів С-атомів у кільцях А, В, С та значні відмінності для атомів карбону у кільцях D та E, а саме - відсутність сигналу атома С-16 у звичайній для нього області, значні зсуви у розташуванні сигналів С-15 і С-17 та невеликі ефекти на інших С-атомах. Це дозволило припустити наявність додаткової гідроксильної групи у атома С-16. При цьому другий псевдотриплетний сигнал у ПМР-спектрах 9 та 23 з 5.53 м.д. належить протону у С-16, а характер розщеплення цього сигналу визначає його екваторіальне положення та, отже, аксіальне () положення гідроксильної групи аналогічно ехіноцистовій кислоті (16-гідроксіолеаноловій кислоті). Тоді порівняння величин хімічних зсувів сигналів С-атомів для кілець D та Е з такими у ехіноцистовій кислоті виявляє їх збіг.

Сигнали С-атомів вуглеводних частин 9 та 23 однозначно віднесені шляхом порівняння з величинами хімічних зсувів сигналів атомів карбону у фрагментах -L-Rha_р-(12)-О--L-Ara_р та -D-Glc_p-(61)--D-Glc_p-(41)--L-Rha_p. Сигнал, який залишився, у області С-атомів моносахаридних залишків з 74.3 м.д. належить атому С-16 агліконної частини. Таким чином, агліконом глікозидів 9 та 23 є 3,16,23-тригідроксіолеан-12-ен-28-ова кислота. Раніше аглікон аналогічної будови з назвою каулофілогенін був знайдений у глікозидах з Caulophyllum robustum, Chrysanthemum procumbens та з назвою колінсогенін - у глікозиді з Collinsonia canadensis.

Вилучені глікозиди 9 та 23 є 3-O--L-рамнопіранозил-(12)-О--L-арабінопіранозид каулофілогеніну та його 28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--генціобіозиловий естер, відповідно.

Глікозиди стеблів та кореня плюща канарського

Ідентифікація глікозидів стеблів та кореня плюща канарського. Будова глікозидів St-A₁ (2), St-A₂ (3), St-B₁ (5), St-B₂ (6), St-C (24), St-D (25), St-E₂ (12), St-F₁ (19), St-F₂ (20), St-G (27) і St-H (28) з стеблів та R-A (3), R-B (12), R-C (19), R-D (27) і R-E (28) з кореня Hedera canariensis (див. табл. 2) встановлена на підставі результатів кислотного та лужного гідролізів, метилування діазометаном, а також поряд з глікозидами з листя плюща канарського та стеблів плюща кримського.

Встановлення будови нового глікозида St-E₁ (26) з стеблів плюща канарського. Повний кислотний гідроліз глікозида St-E₁ (26) з стеблів плюща канарського дає глюкозу, арабінозу, рамнозу та ехіноцистову кислоту. Лужним гідролізом 26 отримано прогенін, ідентичний по ТШХ та даним повного кислотного гідролізу з глікозидом 2 з листя плюща канарського. Дані лужного гідролізу та відсутність взаємодії з діазометаном визначають бісдесмозидну природу 26.

Остаточне встановлення будови 26 виконано на підставі спектра ЯМР ¹³С, в якому знайдені сигнали одного залишку арабінози, двох залишків глюкози та одного залишку рамнози. Сигнали

Таблиця 2

Тритерпенові глікозиди стеблів та кореня Hedera canariensis

Глікозид	С т р у к т у р а	Вихід, %
	с т е б л о
St-A1 (2)	Ara Echin A	2,0010-2
St-A2 (3)	Ara Hed	7,0010-2
St-B1 (5)	Rha12Ara Echin A	2,0010-2
St-B2 (6)	Rha12AraHed	1,0010-1
St-C (24)	GlcUA Olean A	4,0010-2
St-D (25)	GlcUA Hed	6,0010-2
St-E1 (26)	Ara Echin A Glc61Glc41Rha	2,0010-2
St-E2 (12)	Ara Hed Glc61Glc41Rha	2,7010-1
St-F1 (19)	Rha12Ara Echin A Glc61Glc41Rha	2,0010-2
St-F2 (20)	Rha12Ara Hed Glc61Glc41Rha	3,2010-1
St-G (27)	GlcUA Olean A Glc61Glc41Rha	2,0010-2
St-H (28)	GlcUA HedGlc61Glc41Rha	4,0010-2
	к о р і н ь
R-A (3)	Ara Hed	5,0010-2
R-B (12)	Ara Hed Glc61Glc41Rha	2,0010-1
R-C (19)	Rha12Ara Echin A Glc61Glc41Rha	1,0010-2
R-D (27)	GlcUA Olean A Glc61Glc41Rha	1,0010-2
R-E (28)	GlcUA HedGlc61Glc41Rha	1,5010-2

С-атомів вуглеводних ланцюгів віднесені шляхом порівняння з літературними даними для фрагментів -L-Ara_р та -D-Glc_p-(61)--D-Glc_p-(41)--L-Rha_p. Встановлена ідентичність величин хімічних зсувів сигналів атомів карбону агліконної частини глікозида 26 з такими у 3,28-О-диглікозильованній ехіноцистовій кислоті. Таким чином, для 26 запропонована структура 3-О--L-арабінопіранозил-28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--генціобіозилового естеру ехіноцистовій кислоті. Глікозид 26 є новою сполукою.

Біологічна активність глікозидів плюща канарського

Гемолітична активність in vitro. Досліджені монодесмозидні глікозиди 1-9, 18, 24 та 25, а також бісдесмозидні глікозиди 12, 16, 19-23, 27 та 28 (табл. 3). При цьому встановлено, що для глікозидів з однаковими вуглеводними ланцюгами на гемолітичну активність впливає структура аглікону. Наявність додаткової гідроксильної групи в ехіноцистовій кислоті та хедерагеніні у порівнянні з олеаноловою кислотою приводить до зросту гемолітичної активності у їх глікозидів (арабінозиди 2 і 3 та рамнозил-арабінозиди 5 і 6). У той же час присутність двох гідроксильних груп у агліконі каулофілогеніну знижує активність його глікозида 9. Аналогічний ефект визначено і для глікозида 7, в агліконі якого відсутня метильна група у атома С-20 (30-нор-хедерагенін). Активність глікозидів 7 та 9 на порядок менша, ніж у самого активного глікозида 6. Активність комерційного препарату “Saponin” практично ідентична активності глікозидів 6 та 18, а глікозид 8 проявляє таку ж активність. Крім того, всі протестовані бісдесмозидні глікозиди є неактивними до концентрації 10^-1 моль/л, що узгоджується з раніше відомими даними про необхідність наявності в їх агліконних частинах вільної карбоксильної групи для проявлення гемолітичної активності. Також знайдено, що глікозиди з двома моносахаридними залишками у вуглеводному ланцюгу по атому С-3 аглікону більш активні, ніж їх аналоги з залишком глюкуронової кислоти або арабінози. Подовження вуглеводного ланцюга до п'яти вуглеводних залишків в одному з вилучених глікозидів (18) не приводить до помітної зміни гемолітичної активності у порівнянні з його біозидним прогеніном 6. Незначна зміна активності спостерігається і при зміні залишку арабінози у глікозиді 6 на залишок глюкози (глікозид 8).

Таблиця 3

Гемолітична активність монодесмозидних глікозидів Hedera canariensis

Глікозид	HC50*, моль/л	Глікозид	HC50, моль/л
1	3,010-5 0,0710-5	8	8,010-6 0,1410-6
2	1,410-5 0,1110-5	9	6,010-5 0,1010-5
3	1,210-5 0,1410-5	18	6,110-6 0,1410-6
4	1,210-5 0,1310-5	24	1,610-5 0,0910-5
5	1,010-5 0,1110-5	25	2,110-5 0,1110-5
6	6,010-6 0,1010-6	“Saponin”	8,010-6 0,0910-6
7	4,010-5 0,1010-5

Примітка. ^* HC₅₀ - концентрації, що викликають 50% гемоліз.

Іхтіотоксичність. Експеримент на рибах гупіях Poecilia reticulata з використанням глікозидів 1-9, 12, 16, 18-25, 27 та 28 показав (табл. 4), що кон-центрації монодесмозидних глікозидів, що призводять до 50% летального кінця, приблизно у 2-3 рази більше, ніж концентрації, що викликають 50% гемоліз (HC₅₀) еритроцитів у експерименті in vitro, а бісдесмозидні глікозиди не виявили активності в інтервалі концентрації до 10^-1 моль/л.

Таблиця 4

Іхтіотоксичність монодесмозидних глікозидів Hedera canariensis

Глікозид	LC50*, моль/л	Глікозид	LC50, моль/л
1	8,010-5 0,4110-5	8	2,010-5 0,4210-5
2	4,010-5 0,3510-5	9	2,010-4 0,4310-4
3	3,010-5 0,3610-5	18	2,010-5 0,3410-5
4	3,010-5 0,3810-5	24	4,010-5 0,3110-5
5	3,010-5 0,3810-5	25	5,010-5 0,3510-5
6	2,010-5 0,4610-5	“Saponin”	2,010-5 0,3110-5
7	1,010-4 0,4310-4

Примітка. ^* LC₅₀ - концентрації, що викликають 50% летальний кінець.

ВИСНОВКИ

1. Показано, що плющ канарський Hedera canariensis Willd. є джерелом тритерпенових глікозидів олеананового типу. Серед сорока вилучених глікозидів вісім є новими сполуками. Глікозиди 30-нор-хедерагеніну та каулофілогеніну вперше знайдені у роді Hedera та родині Araliaceae.

2. Встановлено будову нових глікозидів L-E₂, L-G₁', L-G_1b та L-H₃ з листя плюща, що є, відповідно, 3-O--L-рамнопіранозил-(12)-О--L-арабінопіранозид і 3-О--L-арабінопіранозил-28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--генціобіозиловий, 3-O--L-рамнопіранозил-(12)-О--L-арабінопіранозил-28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О-(6-О-ацетил--D-глюкопіранозил)-(16)-О--D-глюкопіранозиловий та 3-O--L-рамнопіранозил-(12)-О--L-арабінопіранозил-28-О--L-рамнопіранозил-(16)-О--генціобіозиловий естери 30-нор-хедерагеніну.

3. Доказано будову нових глікозидів L-F₂ та L-I₂ як 3-O--L-рамнопіранозил-(12)-О--L-арабінопіранозид каулофілогеніну та його 28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--генціобіозилового естеру.

4. Показано, що нові глікозиди St-E₁ та L-G₀ є 3-O--L-арабінопіранозил-28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--генціобіозиловий та 3-O--L-рамнопіранозил-(12)--L-арабінопіранозил-28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О-(6-О-ацетил--D-глюкопіранозил)-(16)-О--D-глюкопіранозиловий естери ехіноцистової кислоти.

5. Показано, що для прояву високої гемолітичної та іхтіотоксичної активностей вивченими глікозидами необхідна наявність у агліконі вільної карбоксильної та гідроксильної груп. Біозидні глікозиди є більш активні, ніж їх моноозидні аналоги. У бісдесмозидних глікозидів активності не знайдено.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гришковец В.И., Сидоров Д.Ю., Яковишин Л.А., Арнаутов Н.Н., Шашков А.С., Чирва В.Я. Тритерпеновые гликозиды Hedera canariensis I. Строение гликозидов L-A, L-B₁, L-B₂, L-C, L-D, L-E₁, L-G₁, L-G₂, L-G₃, L-G₄, L-H₁, L-H₂ и L-I₁ из листьев Hedera canariensis // Химия природ. соедин. - 1996. - №3. - С. 377-383.

...