Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО «ВИТЕБСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра фармацевтической химии с курсом ФПК и ПК

Фармакопейный контроль качества андрогенов и эстрогенов

Корниенко Юлия Владимировна

Научный руководитель

ассистент Атрощик Т. В.

Витебск, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Перечень условных обозначений

Введение

1. Общая характеристика андрогенов и эстрогенов

1.1 Представители андрогенных гормонов

1.1.1 Общие физические свойства

1.1.2 Общие химические свойства

1.2 Представители эстрогенных гормонов

1.2.1 Общие физические свойства

1.2.2 Общие химические свойства

2. Определение примесей

3. Сравнительный анализ методик, используемых при идентификации веществ

3.1 Представители андрогенных гормонов

3.2 Представители эстрогенных гормонов

4. Сравнительная характеристика методов количественного определения

4.1 Представители андрогенных гормонов

4.2 Представители эстрогенных гормонов

Заключение

Список использованных источников

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

BP-2009 - Британская фармакопея

EP-2008 - Европейская фармакопея

JP-2006 - Японская фармакопея

USP-24 - Фармакопея США

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ИК-спектроскопия - инфракрасная спектроскопия

ЛФ - лекарственная форма

НД - нормативная документация

МФ - Международная фармакопея

СО - стандартный образец

ТСХ - тонкослойная хроматография

УФ-спектроскопия - ультрафиолетовая спектрофотометрия

ФС - фармакопейная статья

ФСП - фармакопейная статья производителя

ВВЕДЕНИЕ

Среди задач фармацевтической химии - таких, как моделирование новых лекарственных средств и их синтез, изучение фармакокинетики и др., особое место занимает анализ качества лекарственных средств.Если вопросы качества в любом производстве занимают важное место, то качество лекарственных средств имеет исключительное значение, т.к. ни больной, ни окружающие его лица, как правило, не могут проверить и установить доброкачественность полученного лекарственного средства.

Сборником обязательных общегосударственных стандартов и положений, нормирующих качество лекарственных средств, является Государственная фармакопея. Фармакопейный анализ лекарственных средств включает в себя оценку качества по множеству показателей. В частности, устанавливается подлинность лекарственного средства, анализируется его чистота, производится количественное определение. Первоночально для такого анализа применяли исключительно химические методы: реакции подлинности, реакции на содержание примесей и титрование при количественном определении.

В последние годы наметилась тенденция к переходу на расширенное использование физических и физико-химических методов анализа. В частности, широко применяются спектральные методы: инфракрасная и ультрафиолетовая спектрофотометрия и др. Активно используются методы хроматографии (высокоэффективная жидкостная, газожидкостная, тонкослойная), электрофорез и др [1].

Цель работы.Учитывая существование различных методов анализа в рамках одного и того же вещества возникает необходимость их сравнения и выявления наиболее доступного, отличающегося простотой методик анализа, экспрессностью, высокой чувствительностью, воспроизводимостью, низкой токсичностью. С этой целью и будет проведен сравнительный анализ методик по контролю качества лекарственных средств на основе лекарственных средств андрогенной и эстрогенной природы, включенных в фармакопеи мира: международная, британская, японская, европейская, фармакопея США.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНДРОГЕНОВ И ЭСТРОГЕНОВ

Еще в 1849 г. Бертольдом было установлено, что у петухов при кастрации наступает атрофия гребня и что, наоборот, при пересадке семенников молодым кастрированным петушкам у них восстанавливаются вторичные половые признаки, т. е. рост гребешка, голос, поведение. Отсюда был сделан вывод, что в семенниках птиц содержатся какие-то активные вещества, обусловливающие половые отличия и половую деятельность.

Первым андрогенным гормоном, выделенным Бутенандтом и Чернингом в 1931 г. из мужской мочи, был андростерон. Несмотря на доступность андростерона, он почти не нашел практического применения, так как в 1935 г. Лакером (Нидерланды) было показано, что в семенниках быков (и других животных) содержится более активный мужской гормон, названный тестостероном. Тестостерон активнее андростерона в 7 раз. Первый синтез тестостерона был осуществлен также Бутенандтом.

Выделение женского гормона долгое время представляло большие трудности, так как экстракты из яичников, наряду с гормонами, содержат большое количество примесей. Более пригодный источник эстрогенных гормонов был найден Цондеком в 1927 г., когда было установлено, что эстрогены содержатся в значительном количестве в моче беременных женщин. В дальнейшем, когда было найдено, что женские гормоны в значительно больших количествах содержатся в моче жеребых кобылиц и в моче жеребцов или меринов, были разработаны производственные методы получения эстрона.

Вначале, когда стероидная химия была недостаточно развита, количество лекарственных средств на основе половых гормонов было ограничено. В настоящее же время эти средства находят широкое применение в медицине [2].

Андрогены и эстрогены являются половыми гормонами, которые по химическому строению относятся к стероидным соединениям.

Стероидные гормоны являются производными ряда углеводородов, главным образом андростана, эстрана:

андростан

эстран

Они сходны между собой по химической структуре. Отличие от анростана состоит лишь в том, что эстран имеет в молекуле ароматическое ядро и у него отсутствует одна из метильных групп.

Структурной основой стероидных гормонов гидрированный скелет углеводорода циклопентанпергидрофенантрена. Общая формула стероидных гормонов может быть представлена следующим образом:



Метальные группы, присоединенные к стероидному циклу в положениях 10 и 13, называются ангулярными. Радикал Rи атомы водорода (в положениях 8, 9, 14) ориентированы в пространстве в цис- или транс-положении. Условно принято считать, что ангулярные метильные группы расположены над плоскостью чертежа (это обозначают сплошной линией). Если другие заместители находятся в цис-положении, т. е. в одной плоскости с ангулярными группами (Р-конфигурация). то их также обозначают сплошной линией, а если в транс-положении (б-конфигурация), то пунктирной линией.

К числу производныхандростанаотносятся андрогенные гормоны, а эстрана -- эстрогенные гормоны.

Исходя из представленной общей формулы и функциональных групп (заместителей), указанных в таблице 1, можно написать химические формулы каждой группы стероидных гормонов.

Таблица 1 - Химическая структура половых гормонов

Группа гормонов	Двойная связь	Заместители
		Х1	Х2	R
Андрогены	ен-4	=О	-Н	-ОН
Эстрогены	триен-1,3,5 (нет С-19)	-ОН	-Н	-ОН =О

Имеющие стероидную структуру полусинтетические аналоги половых гормонов содержат в своих молекулах ряд других атомов и функциональных групп.

Андрогены и эстрогены являются основой многих лекарственных веществ. На основе андрогенов производятся лекарственные вещества, обладающие андрогенной активностью и оказывают стимулирующее действие на синтез белков в организме (анаболическая активность). Эстрогены применяются в качестве эстрогенных средств, входят в состав противозачаточных средств [3].

1.1 Представители андрогенных гормонов

Тестостерона энантат

Впервые Мишером, Ветштейном и Шоппом было найдено, что андрогенное действие тестостерона усиливается жирными кислотами (1936 г.). Аналогичное действие наблюдается и в присутствии высших спиртов, например стеарилового спирта. Дальнейшие исследования показали, что действие тестостерона повышается также при его этерификации. В связи с этим Pyжичка и Ветштейном были синтезированы эфиры муравьиной, уксусной, пропионовой, масляной и изомасляной кислот, а также пальмитиновой и стеариновой. Оказалось, что первые три эфира проявляют активность (на петушином гребне) уже в дозах 20 у, вторые два -- в дозах 60--70у, а последние два в дозах 1000 у. Слабее действуют ароматические эфиры, например бензойной кислоты -- 100 у. На основании этих данных в медицину был введен тестостерона энантат [2].

Физические свойства. Белый или кремово-белый кристаллический порошок без запаха или почти без запаха.Практически нерастворим в воде, очень легко растворим в этаноле, эфире и ацетоне [4].



Тестостерона энантат (Testosteroni Enantas)

Применяется при половом недоразвитии, мужском климактерии, нервных расстройствах; у женщин -- при нервных расстройствах, опухолях молочной железы, маточных кровотечениях и др. Тестостерона энантат обладает также выраженной анаболической активностью [5].

Метилтестостерон

Стероидный гормон -- андроген, метилпроизводное тестостерона.

Метилтестостерон (Methyltestosteronum)

Физические свойства. Белый или белый с кремовым оттенком кристаллический порошок, т. пл. 161--167°, без запаха, не растворим в воде, растворяется в спирте, эфире, ацетоне, мало растворим в растительных маслах. Удельный показатель поглощения от 520 до 540 (с = 0,001, 95%-ный спирт) при длине волны 240 ммк [6].

Метилтестостерон применяют при гипофункции половых желез у мужчин, раке молочных желез у женщин, также для выявления реакции гипофиза на повышение уровня тестостерона в крови и в качестве кратковременной заместительной терапии при подборе основного препарата заместительного лечения.

Препарат вызывает кратковременное (4-6 часов) повышение уровня свободного тестостерона в крови. Повышает маскулинную агрессивность. При курсовом применении обладает всеми эффектами эндогенного тестостерона [5].

1.1.1 Общие физические свойства

По физическим свойствам лекарственные вещества представляют собой белые кристаллические порошки, допускается наличие слабого желтоватого оттенка. Они практически нерастворимы в воде, легко растворимы или растворимы в этаноле, очень легко или умереннорастворимы в хлороформе, умеренно (метилтестостерон) или легко (тестостерона энантат) растворимы в эфире. Метилтестостерон растворим в ацетоне. Тестостерона энантат растворим в растительных маслах.

Для данных веществ характерны поглощения света в ИК-области света. ИК-спектр испытуемого вещества, снятый в вазелиновом масле в области 3700-400 см-1, должен иметь полное совпадение с полосами поглощения прилагаемого к ФС рисунка спектра [3].

1.1.2 Общие химические свойства

Реакция на кетогруппу.

Тестостерона энантат и метилтестостерон, содержащие в положении 3 кетонную группировку, при действии гидро- ксиламином образуют оксимы с температурой плавления соответственно 166-171оС и 210-216°С. Оксим метилтестостерона образуется по схеме:



Реакция с концентрированной серной кислотой

Со стероидными соединениями протекает цветная реакция с концентрированной серной кислотой. Метилтестостерон и тестостерона энантат образуют при этом жёлто-оранжевое окрашивание с характерной зелёной флуоресценцией [7].

1.2 Представители эстрогенных гормонов

Этинилэстрадиол

По строению и действию этинилэстрадиол близок к эстрадиолу. Химически отличается включением этинилового радикала в положении С (17), что привело к повышению в несколько раз эстрогенной активности по стравнению с эстроном и сохранению ее при пероральном применении [8].

Этинилэстрадиол (Ethinylestradiol)

Физические свойства. От белого с кремовым оттенком до светло-кремового цвета мелкокристаллический порошок. Температура плавления 181 - 186°С. Удельное вращение от -27 до -31° (0,4%-ный раствор в пиридине). Практически нерастворим в воде, легко растворим в этаноле, растворим в хлороформе, ацетоне и диоксане [4].

Этинилэстрадиол применяется при гипофункции яичников, бесплодии, климактерических расстройствах, некоторых формах рака молочной железы, для подавления лактации [9].

Эстрадиола бензоат

Эстрадиол является естественным гормоном, так как образуется в организме женщины вместе с эстроном. В виде эфиров (бензоата) эстрадиол мало разрушается в тканях организма животного. Препарат медленно всасывается, медленно выделяется и оказывает длительное влияние на организм, его можно вводить относительно редко, с большими интервалами между инъекциями [7].

Эстрадиола бензоат (Estradioli benzoas)

Физические свойства. Белый или с желтоватым оттенком кристаллический порошок, без запаха, температура плавления 191--196°С. Плохо растворим в ацетоне, мало растворим в метаноле, в этаноле(95%) и в диэтиловом эфире и практически не растворим в воде [3].

Эстрадиола бензоат применяется при эстрогенной недостаточности в климактерическом периоде и при хирургической менопаузе по поводу незлокачественных новообразований, после лучевой кастрации; первичной и вторичной аменорее, гипоменорее, олигоменорее, дисменорее, вторичной эстрогенной недостаточности; гирсутизм при синдроме поликистозных яичников, вагините (у девочек и в старческом возрасте), гипогенитализме, бесплодии, слабости родовой деятельности, переношенной беременности, для угнетения лактации, при вирильном гипертрихозе у женщин; постменопаузном остеопорозе; раке молочной и грудной железы, раке предстательной железы, урогенитальных расстройствах (диспареунии, атрофическом вульвовагините, уретрите, тригоните), алопеции при гиперандрогенемии. Эстрадиолабензоат применяется также в качестве ЛС, стимулирующего гемопоэз у мужчин при остром радиационном поражении [5].

1.2.1 Общие физические свойства

По физическим свойствам лекарственные вещества представляют собой белые или со слабым кремоватым оттенком кристаллические порошки. Они практически нерастворимы в воде, очень легко, легко или умеренно (этинилэстрадиол) растворимы в хлороформе, умеренно или легко (этинилэстрадиол) растворимы в этаноле, умеренно или легко растворимы в эфире.

Производные эстрадиола отличаются друг от друга и других стероидных гормонов по удельному вращению, так как имеют в молекуле четыре ассиметричных атома углерода.

УФ-спектр поглощения раствора этинилэстрадиола в смеси этанола и гидроксида натрия в области 220-330 нм имеет максимумы поглощения при 241 и 299 нм и минимумы поглощения при 226 и 271 нм, а раствор в этаноле -- максимум поглощения при 280 нм. Этинилэстрадиол можно отличить по удельному показателю поглощения 0,005%-ного спиртового раствора при длине волны 280 нм. Он должен быть равен 65-69. Эстрадиола бензоат идентифицируют по УФ-спектру 0,01%-ного раствора в этаноле, который в области 220-350 нм должен иметь два максимума поглощения (при 269 и 276 нм).

Для данных веществ характерны поглощения света в ИК-области света. ИК-спектр испытуемого вещества, снятый в вазелиновом масле в области 3700-400 см-1, должен иметь полное совпадение с полосами поглощения прилагаемого к ФС рисунка спектра [7].

1.2.2 Общие химические свойства

Реакция с концентрированной серной кислотой.

С производными эстрогена протекает реакция с концентрированной серной кислотой. В присутствии этинилэстрадиола раствор приобретает оранжево-красную окраску с желтовато-зелёной флуоресценцией. После добавления полученного раствора к 10 мл воды окраска изменяется до фиолетовой и выпадает фиолетовый осадок. Эстрадиола бензоат под действием концентрированной серной кислоты гидролизуется с образование эстрадиола и бензойной кислоты. Последующее нагревание в присутствии этанола ведёт к образованию этилового эфира бензойной кислоты, имеющего характерный фруктовый запах.

Реакция с образованием бензоата этинилэстрадиола.

Наличие фенольного гидроксила в молекуле этинилэстрадиола подтверждают реакцией образования бензоата этинилэстрадиола, имеющего т. пл. 199-202°С [8]:

2. Определение примесей

К лекарственным веществам предъявляют многочисленные жесткие требования. Прежде всего, лекарственное вещество должно обладать высокой активностью, избирательностью и продолжительностью лечебного действия. Себестоимость его производства не должна быть слишком высокой. Наконец, оно должно быть доступным, а доходность при его реализации на фармацевтическом рынке - достаточно высокой. Оно должно быть нетоксичным и не должно вызывать нежелательных побочных эффектов. Кроме того, лекарственное вещество должно иметь высокую стабильность при хранении и быть высокочистым. Поэтому в контроле качества ЛС обязательно проводят исследования на чистоту. Основными источниками примесей являются: исходные и промежуточные продукты синтеза, сопутствующие вещества (в растительном и животном сырье), растворители, остатки кислот и щелочей, в том числе за счет выщелачивания стекла, металл, из которого изготовлена аппаратура, песок, асбест, волокна тканей и фильтровальной бумаги и т.д. Примеси можно разделить на две группы: технологические (внесенные исходным сырьем или образовавшиеся в процессе производства) и примеси, приобретенные в процессе хранения, транспортировки, под воздействием различных факторов (тепла, света, кислорода воздуха, влаги и др.).

Примеси могут быть токсичные (недопустимые), оказывающие влияние на фармакологический эффект, и примеси, указывающие на степень очистки ЛВ. Последние, присутствуя в больших количествах, снижают содержание биологически активных веществ и, соответственно, уменьшают активность ЛС. Поэтому в ФС (ФСП) указываются допустимые пределы содержания таких примесей и приводятся испытания, подтверждающие отсутствие токсичных примесей [7].

Согласно методике МФ для определения чистоты андрогенных препаратов применяют метод ТСХ, используя в качестве адсорбента силикагель Р2, а в качестве подвижной фазы смесь 90 объемов хлороформа Р и 10 объемов ацетона Р. Наносят отдельно на пластинку по 5 мкл каждого из двух растворов в этаноле (~750 г/л) ИР, содержащих: (А) 10 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 0,10 мг испытуемого вещества в 1 мл. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, дают ей высохнуть на воздухе до удаления растворителей и оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (254 нм). Любое пятно, полученное с раствором А, кроме основного пятна, не должно быть более интенсивным, чем пятно, полученное с раствором Б. Кроме того, определяют потерю массы при высушивании (высушивают до постоянной массы при 105 °С; потеря составляет не более 10 мг/г) [10].

При сравнении с Японской фармакопеей следует отметить, что методики совпадают. Однако в фармакопее США, Европейской и Британской фармакопеях используется метод ВЭЖХ [11, 12, 13, 14].

Согласно методике МФ для определения чистоты эстрогенных препаратов применяют метод ТСХ, используя в качестве адсорбента силикагель Р1, а в качестве подвижной фазы смесь 92 объемов дихлорэтана Р, 8 объемов метанола Р и 0,5 объема воды. Наносят отдельно на пластинку по 5 мкл каждого из двух свежеприготовленных растворов в смеси 9 объемов хлороформа Р и 1 объема метанола Р, содержащих: (А) 20 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 0,20 мг стандартного образца эстрона СО в 1 мл. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, оставляют ее высыхать на воздухе до тех пор, пока не перестанет ощущаться запах растворителя, затем нагревают при 110°С в течение 10 мин и оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (365 нм). Пятно, полученное с раствором Б, более интенсивное, чем любое соответствующее по положению и внешнему виду пятно, полученное с раствором А. Также определяют потерю массы при высушивании (высушивают до постоянной массы при 105 °С; потеря составляет не более 10 мг/г) [10].

Сравнивая с другими фармакопеями, следует отметить, что методики, описанные в МФ, совпадают с Японской фармакопеей. В фармакопее США, Европейской и Британской фармакопеях применяют метод ВЭЖХ [11, 12, 13, 14].

Таким образом, можно сделать вывод, что все рассматриваемые фармакопеи для определения примесей используют метод ТСХ и ВЭЖХ. И действительно методы жидкостной и тонкослойной хроматографии, которые характеризуются высокой чувствительностью и объективностью, являются перспективными для контроля чистоты лекарственных средств [15, 16].

3. Сравнительный анализ методик, используемых при идентификации веществ

В настоящее время фармацевтический рынок полон фальсифицированнх ЛС. Поэтому, чтобы не допустить некачественную продукцию в продажу проводят идентификацию. В исследуемых фармакопеях приводятся различные методы идентификации данной группы ЛС [17].

3.1 Представители андрогенных гормонов

Таблица 2 - Сравнительная характеристика методов идентификации метилтестостерона

Вещество	Лекарственная форма	НД	Методика
Метилтестостерон	Субстанция	МФ	1. ИК-спектрофотометрия 2. ТСХ 3. Температура плавленияоколо 165 °С
		JP-2006	1. Ультрафиолетовая и видимая спектрофотометрия 2. ИК-спектрофотометрия 3. Температура плавления 163- 1680С
		EP-2008	1. Первая идентификация: B. 2. Вторая идентификация: A, C.
		BP-2009	1. Первая идентификация: B. 2. Вторая идентификация: A, C.
		USP-24	1. ИК-спектроскопия 2. УФ-спектроскопия 3. Температура плавления 162 - 1670С

Идентификация метилтестостерона по МФ проводится по следующим методикам:

1. ИК-спектроскопия. Инфракрасный спектр соответствует спектру, полученному со стандартным образцом метилтестостерона СО, илиспектру сравнения метилтестостерона.

2. Проводят испытание методом ТСХ, используя в качестве адсорбента кизельгур и импрегнируя пластинку в смеси 10 объемов пропиленгликоля и 90 объемов ацетона путем погружения ее на 5 мм ниже поверхности жидкости. После того как фронт растворителя пройдет не менее 16 см, вынимают пластинку из хроматографической камеры и выдерживают ее при комнатной температуре до полного удаления растворителя. Используют импрегнированную пластинку в пределах 2 ч с момента приготовления, проводя хроматографирование в том же направлении, что и импрегнирование. В качестве подвижной фазы используют смесь 80 объемов циклогексана и 20 объемов толуола. Наносят отдельно на пластинку по 2 мкл каждого из двух растворов в смеси 9 объемов хлороформа и 1 объема метанола, содержащих: (А) 1,0 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 1,0 мг стандартного образца метилтестостерона СО в 1 мл. Проводят хроматографирование до прохождения фронта растворителя на 15 см. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, дают ей высохнуть на воздухе до удаления растворителей, нагревают при 120 °С в течение 15 мин, опрыскивают раствором 4-толуолсульфоновой кислоты в этаноле и затем нагревают при 120 °С в течение 10 мин. Дают охладиться и оценивают хроматограмму в дневном свете и ультрафиолетовом свете (365 нм). Основное пятно, полученное с раствором А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности пятну, полученному с раствором Б.

3. Температура плавления около 165 °С [10].

Идентификация метилтестостерона по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

1. УФ-спектроскопия. Определяют спектр поглощения раствора метилтестостерона в этаноле (1:100.000) и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром эталонного раствора метилтестостерона полученного таким же образом, как раствор образца: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

Рисунок 1 - Спектр в УФ-области метилтестостерона

2. ИК-спектроскопия. Определяют инфракрасный спектр поглощения метилтестостерона, предварительно высушив, и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром высушенного метилтестостерона эталонного стандарта: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

Рисунок 2 - Инфракрасный спектр пропускания метилтестостерона

3. Температура плавления 163- 1680С [11].

Идентификация метилтестостерона по Европейской и Британской фармакопеям проводится по следующим методикам:

А. Температура плавления: 162 ° C до 168 ° C.

В. Абсорбционная спектрофотометрия в инфракрасной области спектра.

С. ТСХ.В качестве сорбента используют силикагель F254, нанесенный на пластинку. В качестве подвижной фазы используют смесь безводной уксусной кислоты, петролейного эфира и бутилацетата(1:30:70). Наносят на пластинку отдельно по 5 мкл каждого из 2 растворовв смеси 1 части метанола и 9 частей хлороформа, содержащих (А) 0,2г испытуемого вещества в 10 мл и (Б) 20 мг стандартного образца тестостерона энантата СО в 10 мл. После того как растворитель достигнет высоты более 2/3 от пластины, извлекают пластинку из хроматографической камеры и сушат на воздухе. Оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (254 нм), а также путём опрыскивания насыщенным раствором дихромата калия в смеси 30 объемов воды и 70 объемов серной кислоты, затем рассматривают при дневном свете. Основное пятно, которое дает раствор А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности основному пятну, которое дает раствор Б [12, 13].

Идентификация метилтестостерона по фармакопее США проводится по таким же методикам, что и в Японской фармакопее (ИК- и УФ-спектроскопия).

Таблица 3 - Сравнительная характеристика методов идентификации тестостерона энантата

Вещество	Лекарственная форма	НД	Методика
Тестостерона энантат	Субстанция	МФ	1. ИК-спектроскопия 2. ТСХ 3. Реакция с серной кислотой и этанолом
		JP-2006	1. Реакция с раствором гидроксида калия в метаноле 2. УФ-спектроскопия 3. ИК-спектроскопия
		EP-2008	1. Первая идентификация: B. 2. Вторая идентификация: A, C, D.
		BP-2009	1. Первая идентификация: B. 2. Вторая идентификация: A, C, D.
		USP-24	1. ИК-спектроскопия 2. УФ-спектроскопия 3. Температура плавления от 151 до 1570 С

Идентификация тестостерона энантата по МФ проводится по следующим методикам:

1. ИК-спектроскопия. Инфракрасный спектр соответствует спектру, полученному со стандартным образцом тестостерона энантата СО, или спектру сравнения тестостерона энантата.

2. ТСХ. В качестве сорбента используют кизельгур и смесь объемов жидкого парафина и 90 объемов петролейного эфира для импрегнирования пластинки путем погружения ее на глубину около 5 мл в жидкость. После того как растворитель достигнет высоты по крайней мере 16 см, извлекают пластинку из хроматографической камеры и оставляют ее при комнатной температуре до полного испарения растворителей. Используют импрегнированную пластинку в течение 2 ч, проводят хроматографию в том же направлении, что и импрегнирование. В качестве подвижной фазы используют смесь 4 объемов ледяной уксусной кислоты и 6 объемов воды. Наносят на пластинку отдельно по 2 мкл каждого из 2 растворов в смеси 9 объемов хлороформа и 1 объема метанола, содержащих (А) 1,0 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 1,0 мг стандартного образца тестостерона энантата СО в 1 мл. Проводят хроматографию до прохождения фронтом растворителя отметки 12 см. После извлечения пластинки из хроматографической камеры дают ей высохнуть на воздухе до испарения растворителей, нагревают 5--10 мин при 120 °С, опрыскивают раствором 4-толуолсульфоновой кислоты в этаноле и затем нагревают 10 мин при 120 °С. Дают остыть и оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (365 нм). Основное пятно, которое дает раствор А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности основному пятну, которое дает раствор Б.

3. Суспендируют 5 мг испытуемого вещества в 2,0 мл смеси предварительно охлажденных 2 объемов серной кислоты (~1760 г/л) ИР и 1 объема этанола (~750г/л) ИР, затем помещают в водяную баню; появляется зеленовато-желтая флуоресценция, которая сменяется оранжевой, в то время как стенки пробирки окрашиваются в дихроичный синий цвет, сменяющийся красным ниже определенной глубины [10].

Идентификация тестостерона энантата по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

1. Нагревают 25 мг тестостерона энантата с 2 мл раствора гидроксида калия в метаноле (1 к 100) с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 часа, охлаждают и добавляют 1 мл воды. Собирают полученный осадок путём всасывания, промывают водой до тех пор пока последняя промывка не получится нейтральной, и сушат осадок в эксикаторе (в вакууме фосфора (V) оксида) в течение 4 часов: осадок плавится между 151° C и 157 °C.

2. УФ-спектроскопия. Определяют спектр поглощения раствора тестостерона энантата в этаноле (1:100.000) и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром эталонного раствора тестостерона энантата, полученного таким же образом, как раствор образца: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.



Рисунок 3 - Спектр в УФ-области тестостерона энантата

3. ИК-спектроскопия. Определяют инфракрасный спектр поглощения тестостерона энантата, предварительно высушив, и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром высушенного тестостерона энантата эталонного стандарта: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны [11].

Рисунок 4 - Инфракрасный спектр пропускания тестостерона энантата

Идентификация тестостерона энантата по Европейской и Британской фармакопеям проводится по следующим методикам:

А. Температура плавления: от 34 ° C до 39 ° C.

В. Инфракрасная абсорбционная спектрофотометрия

С. ТСХ. В качестве сорбента используют силикагель F254, нанесенный на пластинку. В качестве подвижной фазы используют смесь воды,ацетонитрила, 2-пропанола (20:40:60). Наносят на пластинку отдельно по 5 мкл каждого из 2 растворовв смеси 10 частей метанола и 90 частей метиленхлорида, содержащих (А) 5 мг испытуемого вещества в 10 мл и(Б) 5 мг стандартного образца тестостерона энантата СО в 10 мл.После того как растворитель достигнет высоты 15 см, извлекают пластинку из хроматографической камеры и сушат на воздухе, а затем при 100 ° С в течение 10 мин, дают остыть. Оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (254 нм),а также путём опрыскивания спиртовым раствором серной кислоты, нагревают при 120 ° С 10 мин, дают остыть, затем рассматривают при дневном свете. Основное пятно, которое дает раствор А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности основному пятну, которое дает раствор Б.

D. К 25 мг испытуемого образца добавляют 2 мл 10 г / л раствора гидроксида калия в метаноле и кипятят с обратным холодильником в течение 1 часа. Добавляют 10 мл воды, подкисляют разбавленной соляной кислотой до тех пор, пока лакмусовая бумажка не станет красной. Фильтруют и промывают осадок небольшим количеством воды. Остаток после сушки при 60 ° С и при давлении, не превышающем 0,7 кПа, в течение 3 ч имеет температуру плавления от 150 ° С до 153 ° С [12, 13].

Идентификация тестостерона энантата по фармакопее США имеет одинаковые методики, что и в Японской фармакопее (ИК- и УФ-спектроскопии). Фармакопея США имеет также схожую методику проведения реакции с раствором гидроксида калия в метаноле, как и в Европейской фармакопее. Однако отличие состоит в том, что температура плавления образовавшегося осадка по фармакопее США имеет пределы от 1510 до 1570С [14].

3.2 Представители эстрогенных гормонов

Таблица 4 - Сравнительная характеристика методов идентификации этинилэстрадиола

Вещество	Лекарственная форма	НД	Методика
Этинилэстрадиол	Субстанция	МФ	1. ИК-спектроскопия 2. ТСХ
		JP-2006	1. Реакция с раствором этанола и серной кислоты 2. Температура плавления между 200 ° и 202° С
		USP-24	1. ИК-спектроскопия 2. УФ-спектроскопия 3. Температура плавления от 180 ° до 186 °С

Идентификаци яэтинилэстрадиола по МФ проводится по следующим методикам:

1. Инфракрасный спектр соответствует спектру, полученному со стандартным образцом этинилэстрадиола СО, или спектру сравнения этинилэстрадиола. Если спектр, полученный с испытуемым веществом в твердой фазе, не соответствует спектру, полученному со стандартным образцом, сравнивают спектры растворов в хлороформе , содержащих 30 мг/мл вещества, и используют кювету с толщиной слоя 0,2 мм.

2. ТСХ. В качестве адсорбента используют кизельгур и импрегнируют пластинку в смеси 1 объема пропиленгликоля и 9 объемов ацетона путем погружения ее на 5 мм ниже поверхности жидкости. Когда фронт растворителя пройдет не менее 16 см, вынимают пластинку из хроматографической камеры и выдерживают ее при комнатной температуре до полного испарения растворителя. Используют импрегнированную пластинку в пределах 2 ч с момента приготовления, проводя хроматографирование в том же направлении, что и импрегнирование. В качестве подвижной фазы используют толуол. Наносят отдельно на пластинку по 2 мкл каждого из двух растворов в смеси 9 объемов хлороформа и 1 объема метанола, содержащих: (А) 1,0 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 1,0 мг стандартного образца этинилэстрадиола СО в 1 мл. Проводят хроматографирование до прохождения фронта растворителя на 15 см. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, дают ей высохнуть до испарения растворителей, нагревают при 120 °С в течение 15 мин, опрыскивают раствором 4-толуолсульфоновой кислоты в этаноле и затем нагревают при 120 °С в течение 5--10 мин. Дают пластинке охладиться и оценивают хроматограмму в дневном свете и в ультрафиолетовом свете (365 нм). Основное пятно, полученное с раствором А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности пятну, полученному с раствором Б [10].

Идентификация этинилэстрадиола по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

1. Растворяют 2 мг этинилэстрадиола в 1 мл смеси этанола (95%) и серной кислоты (в соотношении 1:1): появляется пурпурно-красный цвет с желто-зеленой флуоресценцией. Добавляют 2 мл воды: цвет раствора изменится на красно-пурпурный.

2. В пробирку со стеклянной пробкой вносят 0,02 г этинилэстрадиола, растворяют в 10 мл водного раствора гидроксида калия (1:20), добавляют 0.1 г бензоилхлорида и встряхивают. Собирают осадок, перекристаллизованный из метанола, и сушат в эксикаторе (в вакууме фосфора (V) оксида). Температура плавления осадка между 200 ° и 202° С [11].

Идентификация этинилэстрадиола по фармакопее США проводится по следующим методикам:

1. ИК-спектроскопия. Определяют инфракрасный спектр поглощения этинилэстрадиола, предварительно высушив, и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром высушенного этинилэстрадиола эталонного стандарта: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

2. УФ-спектроскопия. Определяют спектр поглощения раствора этинилэстрадиола в этаноле (1:100.000) и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром эталонного раствора этинилэстрадиола, полученного таким же образом, как раствор образца: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

3. Температура плавления от 180 ° до 186 °С [14].

Таблица 5 - Сравнительная характеристика методов идентификации эстрадиола бензоата

Вещество	Лекарственная форма	НД	Методика
Эстрадиола бензоат	Субстанция	JP-2006	1. Реакция с серной кислотой 2. ИК-спектроскопия
		EP-2008	1. ИК-спектроскопия
		BP-2009	1. ИК-спектроскопия

Идентификация эстрадиола бензоата по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

1. К 2 мг эстрадиола бензоата добавить 2 мл серной кислоты: появляется желтовато-зеленое окрашивание с синей флуоресценцией. При осторожном добавлении 2 мл воды цвет раствора изменяется до светло-оранжевого.

2. ИК-спектроскопия. Определяют спектр инфракрасного поглощения эстрадиола бензоата, предварительно высушенного, и сравнивают с эталонным спектром или со спектром высушенного эстрадиола бензоата эталонного стандарта: оба спектра показывают подобные интенсивности поглощения при том же количестве волн [11].



Рисунок 5 - Инфракрасный спектр пропускания эстрадиола бензоата

Методика идентификации эстрадиола бензоата с помощью ИК-спектроскопии по Европейской и Британской фармакопеям не имеет существенных отличий по сравнению с этой же методикой по Японской фармакопее [12, 13].

4. Сравнительная характеристика методов количественного определения

4.1 Представители андрогенных гормонов

Таблица 6 - Сравнительная характеристика методов количественного определения

Вещество	ЛФ	Методика количественного определения
		МФ	JP-2006	EP-2008	BP-2009	USP-24
Метил-тестостерон	Субстанция	Спектрофотометрия	ВЭЖХ	Спектрофотометрия	Спектрофотометрия	ВЭЖХ
Тестостерона энантат	Субстанция	Спектрофотометрия	Спектрофотометрия	Спектрофотометрия	Спектрофотометрия	Спектрофотометрия

Для количественного определения метилтестостерона Международная, Европейская и Британская фармакопеи рекомендуют спектрофотометрию. Для этого около 20 мг препарата (точная навеска) растворяют в достаточном количестве этанола (~750 г/л) до получения 100 мл; разводят 5,0 мл этого раствора до 100 мл тем же растворителем. Измеряют поглощение разведенного раствора в кювете с толщиной слоя 1 см при максимуме около 242 нм. Рассчитывают содержание С20Н30О2 в испытуемом веществе путем сравнения со стандартным образцом метилтестостерона СО, который исследуют одновременно аналогичным образом. Поглощение раствора стандартного образца в правильно откалиброванном спектрофотометре должно составлять 0,54+0,03 [10, 12, 13]. Японская фармакопея и фармакопея США для количественного определения метилтестостерона рекомендуют ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила и воды (11:9). Неподвижная фаза - селикагель. Детектируют спектрофотометрически при 241 нм [11].

Для количественного определения тестостерона энантата все 5 фармакопей рекомендуют метод спектрофотометрии. Для этого около 20 мг испытуемого вещества (точная навеска) растворяют в безводном этаноледо получения 100 мл раствора; разводят 5,0 мл этого раствора до 100 мл тем же растворителем. Измеряют поглощение разведенного раствора в кювете с толщиной слоя 1 см при максимуме около 241 нм. Рассчитывают содержание С26Н40О3 в испытуемом веществе путем сравнения со стандартным образцом тестостерона энантата СО, исследованным одновременно и аналогичным образом. В правильно откалиброванном спектрофотометре поглощение раствора стандартного образца тестостерона энантата СО в безводном этанолес концентрацией 10 мкг/мл должно быть 0,42 ±0,02 [10, 11, 12, 13, 14].

4.2 Представители эстрогенных гормонов

Таблица 7 - Сравнительная характеристика методов количественного определения

Вещество	ЛФ	Методика количественного определения
		МФ	JP-2006	EP-2008	BP-2009	USP-24
Этинилэстрадиол	Субстанция	Спектрофотометрия	Алкалиметрическоетитрование	--	--	ВЭЖХ
Эстрадиолабензоат	Субстанция	--	ВЭЖХ	Спектрофотометрия	Спектрофотометрия	--

Международная фармакопея для количественного определения этинилэстрадиола рекомендует спектрофотометрию, которая проводится следующим образом: около 0,05 г препарата (точная навеска) растворяют в достаточном количестве безводного этанола до получения 100 мл и разводят 10,0 мл этого раствора до 50,0 мл тем же растворителем. Измеряют поглощение разведенного раствора в кювете с толщиной слоя 1 см при максимуме 281 нм. Рассчитывают содержание С20Н24О2 в испытуемом веществе путем сравнения со стандартным образцом этинилэстрадиола СО, который исследуют одновременно аналогичным образом. Поглощение раствора стандартного образца в правильно откалиброванном спектрофотометре должно составлять 0,72±0,04 [10]. Японская фармакопея с этой же целью рекомендует алкалиметрическое титрование. Для этого взвешивают около 0,2 г этинилэстрадиола, предварительно высушив и растворив в 40 мл тетрагидрофурана. Добавляют 10 мл раствора нитрата серебра (1:20) и титруют 0,1 моль/л гидроксидом натрия. Точку эквивалентности определяют потенциометрически. Каждый мл 0,1 моль / л гидроксида натрия соответствует 29.64 мг C20H24O2 [11].

Количественное определение этинилэстрадиола по фармакопее США проводят с помощью ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы используют профильтрованную и дегазированную смесь воды и ацетонитрила (1:1), а в качестве неподвижной - селикагель. Детектируют спектрофотометрически при 280 нм [14].

Для количественного определения эстрадиола бензоата Японская фармакопея рекомендует метод ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила и воды (7:3). Неподвижная фаза представлена силикатным гелем. Детектор - ультрафиолетовый фотометр поглощения (длина волны 230 нм) [11]. Количественное содержание эстрадиола бензоата по Европейской и Британской фармакопеям определяют спектрофотометрическим методом. Для этого 25,0 мг исследуемого образца (точная навеска) растворяют в безводном этаноле до получения 250,0 мл раствора. Отмеривают 10,0 мл этого раствора и доводят до 100,0 мл этим же растворителем. Измеряют поглощение разведенного раствора в кювете с толщиной слоя 1 см при максимуме 231 нм. Рассчитывают содержание C25H28O3 в испытуемом веществе путем сравнения со стандартным образцом эстрадиола бензоата СО, который исследуют одновременно аналогичным образом [12, 13].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фармакопейный анализ позволяет установить подлинность лекарственного средства, его чистоту, определить количественное содержание фармакологически активного вещества или ингредиентов, входящих в состав лекарственных форм. И несмотря на то что каждый из этих этапов имеет свою конкретную цель, их нельзя рассматривать изолированно. Они взаимосвязаны и взаимно дополняют друг друга.

На основании анализа данных литературы и сравнительной оценки уровня требований и методик анализа, включенных в нормативные документы и зарубежные фармакопеи на лекарственные средства производных андрогенных и эстрогенных гормонов, установлено, что уровень требований и методы анализа указанной группы препаратов достаточно совершенны и позволяют объективно оценить их качество. На данный момент одним из актуальных методов контроля чистоты лекарственных препаратов является метод ТСХ, отличающийся от хроматофафии на бумаге тем, что процесс, протекающий при перемещении подвижной фазы, происходит на сорбенте, нанесенном тонким слоем на инертную поверхность, чем достигается высокая чувствительность, простота использования и устойчивость к температурным и химическим воздействиям.

Идентификация данной группы лекарственных препаратов проводится как химическими (химические реакции), так и физическими и физико-химическими методами (УФ- и ИК-спектроскопии, ТСХ, ВЭЖХ и др). Физические и физико-химические методы приобретают все большее значение как недеструктивный анализ (без разрушения анализируемого объекта).Эти методы имеют ряд преимуществ перед химическими. Они основаны на использовании как химических, так и физических свойств веществ и в большинстве случаев отличаются экспрессивностью, возможностью унификации и автоматизации.

Количественное определение лекарственных веществ исследуемой группы проводится с помощью ВЭЖХ, спектрофотометрического метода, отличающихся доступностью, простотой методик анализа, экспрессностью, высокой чувствительностью, воспроизводимостью, низкой токсичностью. Значительно реже с этой же целью используется метод алкалиметрического титрования (для количественного определения этинилэстрадиола по JP-2006). Указанный метод не требует дорогого оборудования и дорогих реактивов.

андроген эстроген фармакопея

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Мелентьева, Г.А. Фармацевтическая химия/ Г.А. Мелентьева, Л.А. Антонова. - М.: Медицина, 1985. - 480 с.

2. Библифонд[Электронный ресурс] / Фармацевтическая химия половых гормонов. - Режим доступа: http://www.bibliofond.ru/view.aspx?id=459951#_Toc288408268. - Дата доступа: 2.05.2013.

3. Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 частях: Ч. 2 Специальная фармацевтическая химия: Учеб.пособие / В.Г. Беликов - 2-е изд. - М.: МЕДпресс-информ, 2008. - 616 с.

4. Халецкий, А.М. Фармацевтическая химия / А.М. Халецкий. - М.: Медицина, 1966. - 763 с.

5. Харкевич, Д.А. Фармакология / Д.А. Харкевич. - М.: ГЭОТАРМЕД, 2001. - 664 с.

6. Машковский М. Д. Лекарственные средства / М. Д. Машковский. - М.: Новая волна, 2005.- 1206 с.

7. Арзамасцев А. П. Фармацевтическая химия / А. П. Арзамасцев.- М.: Гэотар-Медиа, 2006. - 636 с.

8. Солдатенков А. Т. Основы органической химии лекарственных веществ / А. Т. Солдатенков, Н. М. Колядина, И. В. Шендрик. - М.: Химия, 2001.- 189 с.

9. Бышевский, А.Ш. Влияние превращения арахидоновой кислоты в тромбоцитах на эффективность этинилэстрадиола / А.ШБышевский, С.Л. Галян, П.Я. Шаповалов // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2007. - т. 34, № 7. - С. 29 - 32.

10. Международная фармакопея 3-е издание / Женева: ВОЗ, 1981. - 604 с., 1983. - 364 с., 1990 - 435 с. 1-3 т.

11. Japanese Pharmacopoeia - 2007, version 15.0 [Электронный ресурс]. - Электрон. текстовые дан. и прогр. (83 Мб). - 1 электрон. опт. диск (CD-ROM) и последующие версии.

12. EuropeanPharmacopoeia - 2002, version 4.0 [Электронный ресурс ]. -электрон. текстовые дон. и прогр. (246 Мб). - 2002. -1 электрон. опт. диск. (CD-ROM).

13. BritishPharmacopeia - 2001, version 5.0 [Электронный ресурс]. - Электрон. текстовые дан. и прогр. (177 Мб). - Norwich, 2001. - 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).

14. TheUnitedStatesPharmacopeia, (TheUSP 24thEd.), version 4.2 [Электрон. ресурс]. - Электрон. текстовые дан. и прогр. (245 Мб). Maryland, 2000. - 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).

15. Ф. Гейс. Основы тонкослойной хроматографии в 2 т. / Ф. Гейс. Пер. с англ. М.А. Кошевник, Б.П. Лапина/ Под ред. проф. В.Г. Березкина. - М.: Химия, 1999. - 751с.

16. Стыский, Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Е.Л. Стыский, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде. -М.: Химия, 1986. -214 с.

17. Кулешова, М.И. Пособие по качественному анализу лекарств / М.И. Кулешова, Л.Н. Гусева, О.К. Сивицкая. - М.: Медицина, 1989. - 288 с.

Размещено на Allbest.ru

...