Изготовление лекарственных средств - флавоноидов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Краткая характеристика флавоноидов

2. Подготовка растительного сырья, идентификация, выделение и разделение флавоноидов

2.1 Сушка растительного сырья

2.2 Экстрагирование флавоноидов из растительного сырья

2.3 Хроматографические методы идентификации флавоноидов

3. Качественное определение флавоноидов

4. Методы количественного определения флавоноидов

4.1 Объемные методы количественного определения флавоноидов

4.2 Электрохимические методы исследования флавоноидов

4.3 Физико-химические методы исследования флавоноидов

4.4 Комбинированные методы исследования флавоноидов

Заключение

Список литературы



Введение

Лекарственные средства растительного происхождения нашли широкое применение в современной фармакотерапии. К ним относят как химически чистые вещества и комплексы веществ, так и настойки, эликсиры, бальзамы и др. Одним из важнейших классов действующих соединений, содержащихся в лекарственном растительном сырье, являются флавоноиды.

Флавоноиды представляют собой многочисленной класс природных соединений, многообразие которых обуславливается, главным образом, строением агликона (степенью окисленности трехуглеродного фрагмента, положением бокового фенильного радикала, величиной гетероцикла и других признаках), а также составом гликозидного фрагмента.

Интерес к флавоноидам велик ввиду присущего им широкого спектра биологического действия и антиоксидантной активности. В современной науке огромное внимание уделяется поиску оптимальных путей использования флавоноидов в интересах укрепления здоровья людей, профилактики и лечения различных патологий, вызванных или сопровождающихся усилением свободнорадикальных процессов окисления.

В настоящее время для идентификации и количественного определения флавоноидов в лекарственных средствах широко используются физико-химические методы анализа, такие как спекрофотометрия, абсорбционная спектроскопия. Однако все большее распространение получают комбинированные методы, включающие различные варианты хроматографического разделения исследуемых компонентов. Широкое распространение физико-химических и комбинированных методов анализа, в первую очередь, связано с тем, что эти методы обладают значительно большей чувствительностью и селективностью по сравнению с современными химическими и электрохимическими методами.

Целью курсовой работы является ознакомление с современными методиками качественного и количественного анализа природных флавоноидов. флавоноид сырье хроматографический экстрагирование

Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач:

1) выявить необходимость качественного и количественного анализа биофлавоноидов;

2) выявить особенности (строение, физические и химические свойства) природных флавоноидов как объектов исследования;

3) изучить современные методы выделения и идентификации флавоноидов;

4) изучить теоретические вопросы количественного анализа;

1. Краткая характеристика флавоноидов

Флавоноидами называется группа природных биологически активных веществ (БАВ) - производных бензо-г-пирона (рисунок 1), в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С₆-С₃-С₆ углеродных единиц. Это гетероциклические соединения с атомом кислорода в кольце[1].

Рисунок 1 - Структура бензо-г-пирона

При замещении в хромоне атома водорода в б-положении на фенильную группу образуется 2-фенил-(б)-бензо-г-пирон или флавон (рисунок 2), который состоит из 2 ароматических остатков А и В и трехуглеродного звена (пропановый скелет)

Рисунок 2 - Структура флавона

В зависимости от степени окисления и гидроксилирования пропанового скелета С₆-С₃-С₆ и положения фенильного радикала флавоноиды делятся на несколько групп.

Флавоны - органические соединения гетероциклического ряда, фенильная группа находится во 2-м положении. Содержатся в цветках пижмы, ромашки.

Изофлавоны - фенильная группа находится в 3-м положении. Содержатся в корнях стальника полевого.

Флавонолы - отличаются от флавонов наличием группы ОН в 3-м положении, наиболее распространенными представителями являются кверцетин, кемпферол. У высших растений особенно часто встречается кверцетин, у однодольных преобладают производные кемпферола.

Флавононы - гидрированное производное флавона, в отличие от флавона не имеют двойной связи между углеродами во 2-м и 3-м положениях. Известно свыше 30 представителей этой группы флавоноидов. Они обнаружены в семействах Rosaceae, Fabaceae и Asteraceae.

Флавононолы отличаются от флавонола отсутствием двойной связи между углеродами во 2-м и 3-м положениях. ОН-группа, как и у флавонола, находится в 3-м положении. Скелет флавонола составляет гликозид аромадендрин, содержащийся в листьях эвкалипта.

Флавоноиды, которые связаны с одной или более молекулой сахара называют гликозидами флавоноидов. Гликозиды - это сложные безазотистые органические соединения, при гидролизе распадающиеся на сахаристую часть - гликон и несахаристую - агликон или генин. Большинство из флавоноидов находятся в клетках в виде гликозидов (О-гликозидов - основная группа и С-гликозидов (гликофлавоноиды)) или находятся в виде соединений с органическими кислотами[3].

По физическим свойствам флавоноиды являются кристаллическими веществами с определенной температурой плавления, без запаха, имеющие жёлтый цвет (флавоны, флавонолы), бесцветные (изофлавоны, флаваноны). К группе флавоноидов относятся также антоцианы (природные красящие вещества растений), которые окрашиваются по-разному в зависимости от сН среды: в кислой среде они имеют красный цвет (соли катионов), в щелочной - синий (соли анионов).

Агликоны флавоноидов, как правило, растворимы в ацетоне, спиртах, органических растворителях и нерастворимы в воде. Гликозиды плохо растворимы в воде, за исключением гликозидов, имеющих в своей молекуле более трёх остатков сахара, не растворимы в органических растворителях (эфире и хлороформе).

Флавоноидные гликозиды обладают оптической активностью, для них характерна способность к кислотному и ферментативному гидролизу. Скорость гидролиза и условия его проведения различны для различных групп флавоноидов.

По химическим свойствам О-гликозиды (цианогенные гликозиды, агликоновый компонент которых образован из б-циангидринов) при действии разбавленных минеральных кислот и ферментов легко гидролизуются до агликона и углеводного остатка. С-гликозиды с трудом расщепляются под действием концентрированных кислот (HCI или СН₃СООН) или их смесей при длительном нагревании.

Примерами флавоноидов, значимых для человека являются рутин и квертецин.

Рутин - органическое соединение из группы флавоноидов, обладающее витаминной активностью. По химической структуре рутин представляет собой 5,7,3',4'-OH-3-рамноглюкозид (рисунок 3)[3,4].

Рисунок 3 - Химическая структура рутина

Основные функции рутина: антиоксидантные, противовоспалительные, антиканцерогенные, антитромбические, противоязвенные, антиаллергические, противоотечные, спазмолитические, сахароснижающие, желчегонное действие; коррекция микроциркуляции крови и лимфы; укрепление стенок капилляров, защита от кровоизлияний; уменьшение венозного отека; сдерживание агрегации тромбоцитов; защита от токсинов; увеличение плотности костной ткани; ингибирование альдолазы, трансминазы, С - реактивного белка; ингибирование перекисного окисления липидов; увеличение активности адреналина; снижение активности щитовидной железы.

В организме человека рутин не вырабатывается. К основным природным источникам рутина относятся: листья гречихи, листья чайного куста, черная смородина, шиповник, клюква, соки черники и рябины, можжевельник (ягоды), боярышник (бутоны), ромашка (цветы), календула [2, 3].

Кверцетин (рисунок 4) является агликоном рутина. По химической структуре кверцетин представляет собой 3,5,7,3'4'-Пентаоксифлавон[3, 4].

Рисунок 4 - Химическая структура кверцетина

К основным функциям кверцетина относится: антиоксидантное, противоотечное, спазмолитическое, антигистаминное, противовоспали-тельное, диуретическое, противоязвенное, гипотензивное, иммуностимулирующее, противодиабетическое, гипогликемическое, противовирусное, ранозаживляющее, геропротекторное, анаболическое действия; снижение проницаемости стенок капилляров; повышение тонуса сосудов; блокада синтеза лейкотриенов и других воспалительных медиаторов; процессы ремоделирования костной ткани; эстрогено-подобное действие; нормализация выработки кортизона и инсулина; защита ЛНП-холестерина от окисления; улучшение реологии крови; угнетение синтеза тромбоксана; поддержка миокарда; стабилизация клеточных мембран; стимуляция ферментных систем; улучшение функций фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов; транспорт калия и натрия; адаптация к гипоксии; апоптоз раковых клеток.

В организме человека кверцетин, как и рутин, не вырабатывается. К основным источникам кверцетина природного происхождения относятся: брусника, черная смородина, малина, ежевика, клюква, черника, рябина, облепиха[2, 3].

Распространение в растительном мире.

Особенно богаты флавоноидами высшие растения семейств:

· Розоцветные (Rosacea) (различные виды боярышников, черноплодная рябина);

· Бобовые (Fabaceae) (софора японская, стальник полевой, солодка);

· Гречишные (Polygonaceae) (различные виды горцев - перечный, почечуйный, птичий; гречиха);

· Астровые (Asteraceae) (бессмертник песчаный, сушеница топяная, пижма);

· Яснотковые (Lamiaceae) (пустырник сердечный);

· Сельдерейные (Apiaceae) (володушка многожильчатая);

· Рутовые (Rutaceae) (бархат, рута душистая)

Более часто флавоноиды встречаются в тропических и альпийских растениях. Обнаружены и у низших растений: зеленые водоросли (ряски), споровые (мхи, папоротники), хвощи (хвощ полевой), а также у некоторых насекомых (мраморно-белая бабочка)[5].

Применение флавоноидов в медицине и других отраслях народного хозяйства.

Диапазон терапевтического применения растительного сырья, богатого флавоноидами, очень широк. Флавоноиды не токсичны для человека при любом способе введения.

Ранее других биологических свойств флавоноидов было обнаружено их сосудоукрепляющее действие. Благоприятное влияние флавоноидов на состояние капиллярной системы обычно проявляется в снижении патологически повышенной проницаемости капилляров и в устранении их ломкости и хрупкости. Именно это свойство витамина Р открывает широкие возможности для терапевтического его применения, так как повышение проницаемости и ломкости сосудов довольно часто встечается в патологии человека. Так, изменение сосудистой стенки наблюдается при ревматизме, гипертонической болезни, базедовой болезни, пневмониях и при многих инфекционных заболеваниях.

Установленно, что флавоноиды способствуют сохранению аскорбиновой кислоты в организме, приводят к её накоплению в органах, прежде всего в надпочечниках. Учитывая эти данные, флавоноиды рекомендуют больным С-гиповитаминозом в комплексе с аскорбиновой кислотой.

Кроме того, флавоноиды оказывают нормализующее влияние на лимфоток, с чем, по-видимому, согласуется их противоотечное действие.

Наряду с действием на сосуды, флавоноиды известны и как слабые кардиотонические средства: они способны урежать ритм сердечных сокращений и увеличивать их амплитуду. По другим данным, кверцетин, рутин и другие флавонолы восстанавливают силу утомленного или гиподинамического сердца, нормализуют пульс. Некоторые флавоноиды обладают слабым гипотензивным действием.

Флавоноидные соединения влияют на состав крови, снижают уровень холестерина и в-липопротеидов, что наблюдали под действием кверцетина, лютеолина и других Р-витаминных препаратов.

Одним из ценных свойств флавоноидов является их положительное влияние на функцию печени: они усиливают желчеотделение, улучшают ее детоксицирующую способность по отношению к таким веществам, как барбитураты, мышьяк. Детоксикации организма способствует свойство флавоноидов оказывать мочегонное влияние. Некоторые флавоноиды из семейства норичниковых благоприятно влияют на пищеварение, понижают тонус гладкой мускулатуры кишечника, и оказывают спазмолитическое действие при спазмах мускулатуры желудочно-кишечного тракта. Большое значение придается противовоспалительному действию флавоноидов, с чем, возможно, связаны их противоязвенное, ранозаживляющее, жаропонижающее и вяжущее действия. Привлекают внимание и антимикробные свойства флавоноидов. Так, выявлено отрицательное влияние кверцетина на граммположительных бактерий, флавонов и халконов - на стафилококка. Антимикробное действие отмечается у антоцианов.

В заключение перечня свойств флавоноидов необходимо упомянуть об их противоопухолевом, радиозащитном, также об эстрогенном действии одной из групп - изофлавонов, которые благодаря этому свойству могут воздействовать на воспроизводительную функцию организма[6].



2. Подготовка растительного сырья, выделение и разделение флавоноидов

2.1 Сушка растительного сырья

Лекарственное сырье сразу после сбора необходимо как можно быстрее сушить, так как в нем содержится большое количество влаги. Так, листья, трава и цветы содержат до 80 - 85%, сочные плоды до 96%, а корни и корневища до 46 - 65% влаги. При такой влажности растительное сырье под воздействием ферментов, имеющихся в растениях, и температуры, возникающей в результате самосогревания уплотненного сырья, быстро подвергается порче. Для сушки растительное сырье сразу же после сбора рассыпают тонким слоем так, чтобы на один квадратный метр приходилось не более 1 - 2 кг сырья. Чтобы оно сохло быстрее и не согревалось, его чаще переворачивают. Рассыпать растения необходимо на какой-нибудь чистой подстилке. Лучше всего лекарственное сырье сушить в хорошо проветриваемых помещениях[7].

Характер сушки зависит от вида сырья и содержания в нем действующих веществ. Сырье, имеющее в своем составе гликозиды, необходимо сушить при температуре 50 - 60°С, при которой быстро прекращается деятельность ферментов, разрушающих гликозиды.

Все виды лекарственного сырья лучше сушить под открытым навесом, где имеется хорошая вентиляция и на сырье не падают прямые солнечные лучи, а также в закрытых помещениях с вентиляцией[6, 7].

2.2 Экстрагирование флавоноидов из растительного сырья

Следующим этапом при изучении состава и получения лекарственных средств заключается в извлечении (экстрагировании) флавоноидов. К этому этапу также предъявляются требования соблюдения сохранности нативного состава веществ.

Для флавоноидных гликозидов подходящими экстрагентами являются спиртосодержащие смеси: метанол - вода (70:30) и чаще этанол - вода с разным соотношением компонентов. Спиртосодержащие экстрагенты выполняют еще и важную роль ингибирования ферментных систем растений и тем самым способствуют сохранению нативности состава.

Для агликонов, как для менее полярных соединений, кроме того, применимы и такие экстрагенты, как этилацетат и диэтиловый эфир.

В целях количественного анализа процедуру извлечения повторяют дважды или трижды (до максимального «истощения» экстрагируемого материала). Если растительный материал (листья, трава и т. п.) обогащен хлорофиллом, то для освобождения от него либо проводят преэкстракцию неполярным растворителем (хлороформом, диэтиловым эфиром), либо обрабатывают этими растворителями уже полученные экстракты, как правило, после практически полного удаления из них спирта.

Для флавоноидов, как и для других веществ, не существует способа выделения, универсального для всех растительных материалов. В каждом конкретном случае прибегают к наиболее подходящему методу или сочетанию методов, с учётом в основном свойств веществ и особенностей растительного сырья. Наиболее часто используются избирательная экстракция, осаждение с помощью солей тяжёлых металлов и хроматографические методы[9].

2.3 Хроматографические методы идентификации флавоноидов

Избирательная экстракция для флавоноидов имеет важное значение в связи с широким использованием для их разделения и очистки различных вариантов хроматографического метода.

В настоящее время используют различные варианты хроматографического метода. Наиболее важной в качественном анализе является распределительная хроматография на бумаге. Тонкослойный вариант удобен для разделения ароматических оксикислот и метилированных флавоноидов, которые с трудом делят на бумаге.

Метод жидкостно-жидкостной хроматографии и, особенно, ВЭЖХ позволяет осуществлять качественный и количественный анализ всех видов флавоноидов.

Для разделения флавоноидов между собой и отделения от сопутствующих веществ используется адсорбционно-хроматографический метод[10].

Тонкослойная хроматография

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) очень удобен для сравнительного анализа с использованием стандартных веществ.

Пятна флавоноидов на хроматограмме зачастую могут быть обнаружены просто при облучении пластинки УФ-светом. Широко используются методы обработки хроматограмм такими проявляющими (детектирующими) реагентами, как спиртовый раствор АlCl₃, пары иода и концентрированная серная кислота (для силикагелевых слоев), а также нагревание (только для силикагелевых пластинок).

Специфическим для хроматографии флавоноидов является полиамидный сорбент. Полиамидный сорбент (стационарная фаза), в зависимости от состава подвижной фазы, может проявлять двойственный характер, а именно выступать в роли полярной или неполярной фазы.

Соответственно разделение веществ может протекать либо как обычный распределительный (в водно-спиртовых элюентных системах), либо как обращенно-фазный распределительный (в элюентной системе метанол - хлороформ) процессы.

Центром сорбции является амидная группировка полиамидной макромолекулы, например капрона. Хроматографируемые вещества образуют обратимые водородные связи между протонодонорной гидроксильной группой флавоноидного соединения и карбонильной группой амидного фрагмента.

Агликоны сорбируются на полиамиде прочнее, чем их гликозиды. Сорбция агликонов находится в пропорциональной зависимости от числа гидроксильных групп в молекуле, а также от их местоположения в молекуле[11].

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является быстрым, хорошо воспроизводимым методом, который требует малого количества анализируемого вещества и используется для количественного, качественного анализа и препаративного выделения.

Для флавоноидов более употребительны колонки с обращенно-фазными сорбентами (RP-8; RP-18) и детектирование с помощью УФ-видимого детектора с переменной длиной волны. В настоящее время широко используется фотодиодный детектор, позволяющий одновременно с выделением пика на хроматограмме получать УФ-видимый спектр вещества, соответствующего этому пику. Такой экспериментальный прием значительно облегчает задачу идентификации веществ.

Подвижные фазы (элюентные системы), как правило, бывают бинарными и содержат подкисленный полярный компонент (водные растворы уксусной, перхлорной, фосфорной или муравьиной кислот) и менее полярный органический растворитель (метанол или ацетонитрил).

Соотнесение пика на хроматограмме с «принадлежащим» ему веществом является наиболее трудной задачей. Удобным приемом является использование параллельного хроматографирования хорошо известных, так называемых стандартных образцов и сравнение с ними хроматограммы исследуемого объекта. Стандартное вещество в идеале должно быть наиболее родственно флавоноидам и иметь подобные хроматографические свойства. В тех случаях, когда стандартное вещество хроматографируется в равных условиях, но параллельно, его называют внешним стандартом. Внутренний стандарт (добавляется в исследуемую пробу перед вводом в хроматограф) должен отвечать следующим условиям: в исследуемой смеси не должно содержаться аналогичное вещество и пик стандарта не должен перекрываться с каким-либо соединением в смеси. Такие ограничения отсутствуют в случае применения внешнего стандарта.

Преимуществами внутреннего стандарта является подтверждение достоверности экстракции, подготовки образца, хроматографической процедуры. В качестве стандартного вещества для флавоноидов часто используется рутин, являющийся коммерческим доступным продуктом. Он хорошо подходит для количественного анализа флавоноловых гликозидов. Для содержащихся в смеси других флавоноидов могут быть использованы такие коммерчески доступные стандарты, как апигенин-7-глюкозид - для флавоновых гликозидов, катехин - для флаван-3-олов, нарингенин - для дигидрофлавонов, дигидрокверцетин - для дигидрофлавонолов, даидзеин - для изофлавонов.

Для количественного анализа строится кривая зависимости концентрации флавоноида от площади пика для каждого стандарта в тех же самых хроматографических условиях (длина волны, растворитель), которые применяются по отношению к исследуемой смеси. Соответствующие калибровочные кривые могут быть использованы для расчета количества флавоноида, представляемого каждым пиком ВЭЖХ хроматограммы. В настоящее время практически исчезла надобность в построении калибровочных кривых в связи с обеспечением хроматографов компьютерной системой обсчета площадей пиков.

На примере хроматографирования смеси флавонов и флавонолов в обращенно-фазном варианте (рисунок 5) показано, что порядок выхода флавоноидов коррелирует с числом гидроксильных групп, а именно: время удерживания возрастает по мере снижения числа гидроксильных групп в молекуле.

Хроматографические условия: колонка Sep-Pak C-18, градиентный режим: метанол - 5 мМ, H₃PO_4.

Рисунок 5 - Хроматограмма смеси флавоноидов



3. Методы качественной идентификации флавоноидов

Для обнаружения различных видов флавоноидов используются качественные реакции. Они необходимы для подтверждения нахождения той или иной структуры на этапе идентификации флавоноидов.

Наиболее характерными реакциями являются следующие:

1) Цианидиновая проба (проба Шинода)

Общей реакцией на флавоноидные соединения является цианидиновая проба (рисунок 6), проводимая с помощью концентрированной соляной кислоты и металлического магния. Действие водорода в момент выделения приводит к восстановлению карбонильной группы и образованию ненасыщенного пиранового цикла, который под действием соляной кислоты превращается в оксониевое соединение, имеющее окраску от оранжевой (флавоны) до красно-фиолетовой (флаваноны, флавонолы, флаванонолы).

Рисунок 6 - Цианидиновая проба

Изменение условий восстановления путем замены магния на цинк приводит к изменению окраски. При использовании цинка положительную реакцию дают флавонолы и флавонол-3-гликозиды, а флаваноны не обнаруживают ее.

Цианидиновую реакцию не обнаруживают халконы, ауроны, но при добавлении концентрированной соляной кислоты (без магния) образуют красное окрашивание за счет образования оксониевых солей.

2) Борно-лимонная реакция (реакция Вильсона-Таубека)

5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с борной кислотой в присутствии лимонной (реактив Вильсона), образуют желтую окраску с красноватой флюоресценцией в УФ-свете. При замене лимонной кислоты на щавелевую (реактив Таубека) в УФ-свете отмечается зеленая или желтая флюоресценция (рисунок 7).

Рисунок 7 - Реакция Вильсона-Таубека

3) Реакция с треххлористой сурьмой

5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или желто-оранжевый цвет - флавоны, в красный или красно-фиолетовый - халконы (рисунок 8).

Рисунок 8 - Реакция с треххлористой сурьмой



Реакцией по Брианту (которая является модификацией пробы Шинода) можно отличить гликозиды от агликонов. Суть метода заключается в следующем: после проведения цианидиновой пробы к раствору добавляют октанол и взбалтывают. При наличии агликонов окраска переходит в органический слой.

4) Образование фенолятов

Так как в своей структуре флавоноиды имеют фенольные гидроксилы, то им присущи химические свойства, соответствующие данной функциональной группе. Так, фенольные ОН-группы способны проявлять слабокислые свойства, образуя феноляты с основаниями.

5) Взаимодействие со щелочами

Характерной реакцией на флавоноиды считается также их взаимодействие с щелочами. Флавоны, флавонолы, флаваноны и флаванонолы растворяются в щелочах с образованием жёлтой окраски, которая при нагревании изменяется до оранжевой или коричневой. Халконы и ауроны при взаимодействии со щелочами обычно дают красное или ярко-жёлтое окрашивание.

6) Образование комплексов с солями металлов

Присутствие фенольных гидроксилов и карбонильной группы позволяет флавоноидам образовывать комплексы различной степени устойчивости с солями металлов (Аl³⁺, Fe³⁺, Pb²⁺ и так далее), вступать в реакции с диазосоединениями с образованием азокрасителей.

7) Диазотирование

При проведении реакции диазотирования азосочетание проходит по 6 или 8 положениям. Если положения 5 и 7 замещены, то реакция не идёт (можно доказать присутствие в 7 положении углеводного компонента). В качестве диазосоставляющего часто используют кислоту сульфаниловую или п-нитроанилин.

8) При использовании хроматографических методов определения флавоноидов их можно обнаружить на хроматограммах по флуоресценции или в виде окрашенных пятен при сканировании в УФ-свете или/и проявлении одним из реактивов (пары аммиака, 5 %-ный спиртовой раствор алюминия хлорида, 10 % раствор щёлочи, реактив Вильсона, раствор диазотированного сульфаниламида и другие).



4. Методы количественного определения флавоноидов

4.1 Объемные методы количественного определения флавоноидов

Объёмный анализ - это совокупность методов химического количественного анализа, основанного на измерении объёмов для установления концентрации (содержания) определяемого вещества. К объёмным методам анализа относят распространённые в лабораторной практике различные варианты титриметрического анализа, основанного на измерении объёма израсходованного раствора реагента известной концентрации, необходимого для достижения точки эквивалентности.

Комплексонометрия - метод титриметрического анализа, который основан на образовании прочных комплексных соединений ионов металлов (всех, кроме одновалентных) с комплексоном III (двунатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты), при этом изменяются концентрации ионов металлов в титруемом растворе.

Метод комплексонометрического титрования избытка ацетата свинца, не вступившего в реакцию осаждения с флавонолами, обладает достаточной избирательностью по отношению к флавоноидам и позволяет проводить определение флавонолов в присутствии ацетилсалициловой кислоты, антрахинонов, кумаринов.

К титриметрическому методу анализа также относится метод окисления флавоноидов ферроцианидом калия по n-фенил-аптрониловой кислоте. Однако метод длителен и не обладает избирательностью[10].

Примером применения титриметрического метода может служить, например, определение содержания флавоноидов в препаратах Фламин и Флакумин.

Предложен объемный метод, в котором после добавления реактива осаждения при 80-85°С с последующим добавлением 4% раствора калия ацетата в 70% этиловом спирте, кислоты азотной, суммарный объем титруют 0,01 М раствором трилона Б из расчета содержания суммы флавоноидов 0,001061 г в 1 мл 0,01 М раствора трилона Б[10].

Аналогичный объемный метод титрованием трилоном Б использован и для определения кверцетина из расчета, что 0,001209 г его соответствуют 1 мл 0,01 М раствора трилона Б[20].

4.2 Электрохимические методы исследования флавоноидов

Потенциометрический метод количественного определения флавоноидов

Потенциометрическое титрование относится к методу электрохимического анализа, основанному на измерении изменяющегося в процессе титрования электрохимического потенциала электрода, погруженного в изучаемый раствор.

Количественное определение флавоноидов в среде неводных растворителей, например, ацетона, диметилформамида, диметилсульфоксида потенциометрическим методом возможно с использованием в качестве титрантов гидроокиси тетраэтиламмония или натрия. Метод имеет преимущество перед оптическими в точности определения и не требует наличия стандартных веществ для проведения количественной оценки.

Малая чувствительность (для анализа требуется 0.0005 - 0.001 г вещества) и недостаточная селективность для каждого из классов затрудняют определение без предварительного разделения веществ в сырье и суммарных препаратах[13].

Полярографические методы количественного определения флавоноидов

В основу высокочувствительного полярографического метода анализа положено восстановление флавоноидов на ртутном капельном электроде. Метод позволяет анализировать сумму флавоноидов, в пересчете на одно из соединений, выбранное в качестве стандарта. В отличие от спектрофотометрии окрашенных комплексов метод дает более близкие к истинному суммарному содержанию результаты для флавоноидов.

Полярографический метод позволяет устанавливать наличие внутримолекулярных связей, проводить идентификацию по величине потенциала полуволны, оценивать реакционную способность отдельных групп в молекуле. В практике фармацевтического анализа и в особенности в заводских условиях полярографический анализ встречает затруднения, так как требует соблюдения строгих условий техники безопасности при работе со ртутью. К недостаткам метода можно отнести его малую избирательность из-за близких величин потенциалов полуволн, в связи, с чем требуется, как и при спектральных методах, предварительное разделение веществ[13].

4.3 Физико-химические методы исследования флавоноидов

Оптические методы определения флавоноидов

Спектрофотометрический и фотоколориметрический анализы являются разновидностями молекулярно-абсорбционного спектрального анализа. Сущность молекулярно-абсорбционного спектрального анализа заключается в качественном и количественном определении веществ по их спектрам поглощения. Физической основой спектрального анализа является взаимодействие электромагнитного излучения с веществом.

Основной закон спектрофотометрии - закон Бугера-Ламберта-Бера. Применительно к растворам его запись выглядит следующим образом:

,

где, 10 - начальная интенсивность светового потока,

I - интенсивность светового пучка после прохождения раствора,

е - коэффициент поглощения (экстинкции) светового потока,

С - концентрация вещества в растворе в моль/л,

l - толщина слоя светопоглощающего раствора.

Из уравнения (1) следует:

,

Величина lg (I₀/I) называется оптической плотностью раствора и обозначается символом D. Из (2) имеем:

Из уравнения (3) следует, что оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации светопоглощающего вещества в растворе и толщине слоя раствора. То есть при определённой толщине слоя раствора, оптическая плотность будет тем больше, чем больше концентрация вещества в растворе. Отсюда следует, что, определяя оптическую плотность раствора, мы можем напрямую определять концентрацию вещества в растворе. Увеличивая толщину слоя l можно измерять очень малые концентрации веществ[10, 14].

Количественное определение исследуемых флавоноидных соединении в УФ- и видимой области спектров основано на измерении оптической плотности при длине волны в максимумах поглощения как растворов анализируемых веществ, так и растворов их окрашенных комплексов.

Спектрофотометрическое определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой спектрофотомерии или дифференциальной спектрофотомерии является одним из наиболее распространенных методов анализа флавоноидов. При этом рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые максимумы для флавоноидов - 330-370 нм, так и коротковолновые. Коротковолновые максимумы, хотя и более интенсивны, но в ряде случаев менее пригодны для аналитических целей из-за малой «площади» вершины пика, что приводит к большим ошибкам определения. Относительная ошибка прямого спектрофотометрического определения составляет ± 2-5 % и может быть снижена при дифференциальной методике анализа до 0.5-1.0 %. Рабочий интервал концентраций спиртовых, спиртоводных растворов составляет от 5 до 20 мкг вещества в 1 мл раствора. Обладая высокой чувствительностью, метод не селективен, так как не контролирует содержание каждого из веществ одного класса соединений и не позволяет судить о их количестве.

Спектрофотометрические или фотометрические определения по реакции диазотирования ранее были широко распространены в анализе. Реакция чувствительна, но не избирательна, так как наряду с флавоноидами эту реакцию дают фенольные соединения, пиразолоны и другие классы соединений. Применение данного метода ограничено неспецифичностью его и внутри каждого из классов соединении из-за прохождения реакции у флавоноидов только по кольцу А при наличии свободного ортоположения по отношению к фенольному гидроксилу у 7-го углеродного атома. Поэтому даже суммарные определения с данным реактивом не показывают истинного содержания исследуемых веществ как в суммарных фитохимических препаратах, так и в растительном сырье.

Большей специфичностью обладают, хотя и не лишены недостатков, методики определения флавонолов по цветным комплексным соединениям с хлоридом алюминия, хлорокисью циркония (хлористым цирконилом), азотнокислым галлием. Окрашенные растворы имеют максимумы в интервалах: 385-460 нм с хлористым алюминием, 385-500 нм с хлористым цирконилом, 400-455 нм с азотнокислым галлием. Наибольшей чувствительностью обладает методика с применением азотнокислого галлия, позволяющая количественно определять 0.5 мкг в 1 мл раствора, затем с хлорокисью циркония - 0.9-1.0 мкг и с хлористым алюминием - 1-2 мкг.

Описаны методики анализа флавоноидов с нитритом кобальта в среде уксусной кислоты при длине волны 575 нм, а также с цинком и мышьяком. Получить истинное суммарное содержание флавоноидов по образованию цветных комплексов с металлами возможно лишь при наличии у соединений одинакового количества комплексообразующих центров. Отсутствие таковых у целого ряда соединений приводит к отрицательной реакции с данными реактивами.

Несмотря на указанные недостатки, метод нашел широкое применение при установлении суммарного содержания флавоноидов в сырье и суммарных фитохимических препаратах. В качестве стандарта используют кверцетин, кемпферол или их гликозиды.

Широко распространена при определении общего количества флавоноидных соединений в растениях методика фотометрического определения по реакции комплексобразования с борной кислотой при длине волны 470 нм. Методика обладает теми же недостатками, что и методика комплексобразования с солями металлов, и дает завышенные результаты, но простота проведения и доступность реактива дают возможность использовать их для ориентировочных определений. В качестве образцов используют как агликоны, так и гликозиды флавонов, флавонолов, халконов.

Одним из методов определения флавоноидных соединений по оптической плотности является также анализ продуктов взаимодействия с 4-аминоантипириновым реактивом. Однако, данный анализ требует соблюдения ряда условий, как и при реакции диазотировання, и не является избирательным.

В ряду спектрофотометрических методов анализа флаванонов наиболее чувствителен боргидридный метод (до 0.5-1 мкг/мл при длинах воли 535-560 нм). Несмотря на значительную селективность, он не имеет широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспроизводимости результатов.

Комплексонообразующие свойства флавоноидов положены в основу флуорометрического метода, являющегося на порядок более чувствительным, чем спектрофотометрический. Количественно оценить флавоноиды этим методом возможно при наличии 0.05-1 мкг вещества в 1 мл раствора. Высокая чувствительность флуорометрического метода раскрывает широкие возможности его применения для предварительной идентификации биологически активных веществ в тканях растений. Однако получить объективные результаты при анализе сырья и фитохимических препаратов можно только после разделения веществ с помощью различных видов хроматографии[14].

Абсорбционная спектроскопия

В целом для флавоноидов характерно поглощение в УФ-видимой области спектра (210-600 нм). Спектр поглощения флавоноидного соединения содержит, как правило, две полосы: одна из них в низковолновой (210-290 нм) части - полоса II, другая - в более длинноволновой (320-380 или 490-540 нм для антоцианидинов) части - полоса I.

Положение полос поглощения служит в некоторой степени характеристическим признаком отдельных групп флавоноидов. Так, флаваноны и флаванонолы отличаются от других групп флавоноидов положением полосы II в области 270-290 нм и наличием полосы I в виде плеча при 310-330 нм. В то время как для флавонов и флавонолов специфическим признаком служит положение полосы I в области 320-355 и 340-385 нм соответственно. Для халконов характерно положение полосы II в несколько более длинноволновой области (рисунок 9).

Рисунок 9 - Положение полос поглощения в УФ-видимой области спектра для флавона (1), флавонола (2) и халкона (3)

Абсорбционная спектроскопия флавоноидов хорошо изучена, и выявленные закономерности широко используются в целях идентификации и установления строения новых соединений.

В настоящее время происходит смена «приоритетов» и зачастую сложные структурные вопросы решаются уже более «коротким», но более технически оснащенным путем за счет высокоразрешающих современных физико-химических методов[14].

4.4 Комбинированные методы исследования флавоноидов

Широкое распространение в анализе получили комбинированные методы, включающие предварительное хроматографическое разделение на бумаге, в тонком слое с последующим определением веществ в элюатах из пятен хроматограмм, а также непосредственным сканированием оптической плотности или определением площади пятна па хроматограмме[10].

Хроматомасспектрометрическое определение флавоноидов

Хроматомасспектрометрия - метод анализа смесей, преимущественно органических веществ, и определения следовых количеств веществ в объеме жидкости. Метод основан на комбинации двух самостоятельных методов - хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго - идентификацию и определение строения вещества, количественного анализа. Известны два варианта хроматомасспетрометрии, представляющие собой комбинацию масс-спектрометрии либо с газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ), либо с ВЭЖХ.

При сочетании ГЖХ и масс-спектрометрии совместимость этих двух приборов обусловлена тем, что в обоих случаях анализируемое вещество находится в газовой фазе, рабочие температурные интервалы одинаковы, пределы обнаружения (чувствительность) близки. Различие состоит в том, что в ионном источнике масс-спектрометра поддерживается высокий вакуум (10^-5 - 10^-6 Па), тогда как давление в хроматографической колонке 10⁵ Па. Для понижения давления используют молекулярный сепаратор, который одним концом соединен с выходом хроматографической колонки, а другим - с ионным источником масс-спектрометра. Молекулярный сепаратор удаляет из газового потока, выходящего из колонки, основную часть газа-носителя, а органическое вещество пропускает в масс-спектрометр. При этом давление на выходе колонки понижается до рабочего давления в масс-спектрометре.

Наиболее удобный для хроматомасспектрометрии газ-носитель - гелий.

В масспектрометрах, соединенных с газовыми хроматографами, применяется ионизация электронным ударом, химическая или полевая. Хроматографические колонки должны содержать труднолетучие и термостабильные стационарные жидкие фазы, чтобы масс-спектр их паров не налагался на спектр анализируемого вещества.

Анализируемое вещество (обычно в растворе) вводится в испаритель хроматографа, где мгновенно испаряется, а пары в смеси с газом-носителем под давлением поступают в колонку. Здесь происходит разделение смеси, и каждый компонент в токе газа-носителя по мере элюирования из колонки поступает в молекулярный сепаратор. В сепараторе газ-носитель в основном удаляется и обогащенный органическим веществом газовый поток поступает в ионный источник масс-спектрометра, где молекулы ионизируются. Число образующихся при этом ионов пропорционально количеству поступающего вещества. С помощью установленного в масс-спектрометре датчика, реагирующего на изменение полного ионного тока, записывают хроматограммы. Таким образом, масс-спектрометр можно рассматривать как универсальный детектор к хроматографу. Одновременно с записью хроматограммы в любой ее точке, обычно на вершине хроматографического пика, может быть зарегистрирован масс-спектр, позволяющий установить строение вещества[15].

В современных масс-спектрометрах, снабженных ЭВМ, построение хроматограмм и обработка масс-спектров производится автоматически. Через равные промежутки времени по мере элюирования компонентов смеси регистрируются масс-спектры, количественные характеристики которых накапливаются в памяти ЭВМ. Для каждого сканирования производится сложение интенсивностей всех регистрируемых ионов. Так как эта суммарная величина (полный ионный ток) пропорциональна концентрации вещества в ионном источнике, то ее используют для построения хроматограммы (эта величина откладывается по оси ординат, по оси абсцисс - время удерживания и номер сканирования). Задавая номер сканирования, можно вызвать из памяти масс-спектр в любой точке хроматограммы. Как описано выше, может быть проанализированы смеси веществ, достаточно хорошо разделяемые на подходящих колонках. Иногда удается исследовать и неразрешенные хроматографические пики. Исследуемые вещества должны быть термически стабильны, хроматографически подвижны в интервале рабочих температур колонки, легко переводиться в паровую фазу при температуре испарителя.

Чувствительность хроматомасспетрометрии (обычно 10^-6-10^-9 г) определяется чувствительностью детектора масс-спектрометра. Более чувствительна (10^-12-10^-15 г) разновидность хроматомасспетрометрии - массфрагментография, называемая также селективным ионным или многоионным детектированием. Суть ее состоит в том, что запись хроматограмм осуществляется не по полному ионному току, а по наиболее характерным для данного вещества ионам. Этот вид хроматомасспетрометрии используют для поиска, идентификации и количественного анализа вещества с известным масс-спектром в составе сложной смеси, например при количественном определении следов веществ в больших объемах биологических жидкостей (медицина, фармакология, токсикология, допинг-контроль, биохимия).

Другой вариант хроматомасспетрометрии заключается в сочетании ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Метод предназначен для анализа смесей труднолетучих, полярных веществ, не поддающихся анализу методом ГЖХ. Для сохранения вакуума в ионном источнике масс-спектрометра необходимо удалять растворитель, поступающий из хроматографа со скоростью 0.5-5 мл/мин. Для этого часть жидкого потока пропускают через отверстие в несколько мкм, в результате чего образуются капли, которые далее попадают в обогреваемую зону, где большая часть растворителя испаряется, а оставшаяся вместе с веществом попадает в ионный источник и ионизируется химически.

Метод хроматомасспетрометрии используют при структурно-аналитических исследованиях в органической химии, нефтехимии, биохимии, медицине, фармакологии, для охраны окружающей среды и других областях[15].

Наиболее часто встречаемым методом количественного определения содержения флавоноидов является спектрофотометричесий.

Разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в побегах черники обыкновенной, которая может быть использована для стандартизации данного вида лекарственного растительного сырья.

В соответствии с ГФ XI издания стандартизация сырья черники проводится по внешним признакам.

Для разработки методики количественного определения флавоноидов в побегах черники был использован метод дифференциальной спектрофотометрии, отличающийся высокой точностью и экспрессностью, и вследствие этого широко применяемый в последнее время для количественного анализа флавоноидов в растительном сырье.

Метод базируется на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. Происходящий при этом батохромный сдвиг первой полосы поглощения флавоноидов с 330-350 нм до 390-415 нм позволяет применить в качестве контроля испытуемый раствор без реактива, и тем самым исключить влияние сопутствующих окрашенных веществ. В качестве стандартного вещества используют рутин, максимум дифференциального спектра поглощения которого (415 нм) совпадает с максимумом дифференциального спектра извлечения из побегов черники.

Для определения оптимального времени комплексообразования суммы флавоноидов побегов черники с алюминия хлоридом определяют оптическую плотность полученного комплекса на фоне чистого извлечения через равные промежутки времени. Полученные результаты свидетельствуют о том, что через 40 мин величина оптической плотности исследуемого комплекса достигает максимального значения. Вследствие этого измерение оптической плотности необходимо проводить через 40 мин после добавления алюминия хлорида к извлечению.

Для выяснения подчиняемости исследуемого комплекса закону Ламберта-Бугера-Бера из него были приготовлены разведения, и установлено, что в диапазоне оптических плотностей 0,2-0,7 у.е. наблюдается линейная зависимость между концентрацией растворов и величиной поглощения.

В процессе разработки методики количественного определения изучены и подобраны оптимальные условия экстракции исследуемого сырья. Оптимальными параметрами получения извлечений из побегов черники обыкновенной являются: экстрагент - 70% этиловый спирт, степень измельчения сырья - 0,5-1,0 мм, температура экстракции - 90 °С, соотношение сырье : экстрагент - 1 : 100, кратность экстракции - 2, продолжительность I экстракции - 60 мин, II экстракции - 60 мин. Измеряют оптическую плотность раствора в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 415 нм.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора комплекса ГСО рутина с алюминия хлоридом.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в % Х вычисляют по формуле:

X=

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 - оптическая плотность ГСО рутина;

m - масса сырья в г;

m0 - масса ГСО рутина в г;

w - потеря в массе при высушивании сырья в %.

Относительная ошибка определения суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной составляет 3,44 %. В связи с этим, по предлагаемой методике достаточно проводить анализ в 3 повторностях.

Таким образом, для стандартизации побегов черники обыкновенной предлагается количественное определение суммарного содержания флавоноидов, базирующееся на достаточно точном и нетрудоемком методе дифференциальной спектрофотометрии. В побегах черники обнаружено относительно высокое количество флавоноидов[19].

На практике трудно обойтись каким-то одним методом идентификации и количественного определения флавоноидов, как и других веществ, в лекарственном растительном сырье, поэтому применяют комплекс методов, сочетание которых может быть различным.

Впервые из надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) выделены и идентифицированы с использованием современных физико-химических методов (ВЭЖХ, УФ-, ПМР-спектроскопии и масс-спектрометрии) флавоноиды, относящиеся к группе флавонов: гиспидулин (5,7,4'-тригидрокси-6-метоксифлавон), апигенин (5,7,4'-тригидроксифлавон), хризоэринол (5,7,4'-тригидрокси-3'-метоксифлавон) и лютеолин (5,7,3',4'-тетрагидроксифлавон), а также скутелляреин ( 5,6,7,4'-тетрагидроксифлавон).

Для изучения состава флавоноидов был получен экстракт на 70% этаноле методом мацерации при нагревании. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через несколько слоев марли, растворитель удаляют под вакуумом, остаток высушивают, высушенный экстракт измельчают. Для разделения сложных смесей веществ полученного экстракта применяют методы избирательной экстракции, используя в качестве экстрагентов: хлороформ, этилацетат и н-бутанол. Полученные фракции анализируют с применением методов одномерной и двумерной хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента (селикогель) параллельно со стандартными образцами веществ-свидетелей в различных системах растворителей ( н-бутанол - уксусная кислота - вода 4:1:5, 15 -60% уксусная кислота, хлороформ - этанол 8:2, 1:1). Обнаружение веществ проводят в фильтрованном УФ-свете при длине волны 254 нм до и после обработки хроматограмм 5% этанольным раствором гидроксида калия и 2% этанольным раствором хлорида алюминия.

Выделение индивидуальных соединений из этилацетатной фракции проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикогеле. Элюирование проводили хлороформом, смесью хлороформ-этилацетат, затем этилацетатом, смесью этилацетат-этанол, этанолом.

Контроль за элюированием веществ осуществляют с помощью методов ТСХ (“Сорбфил”, элюенты: метанол - хлороформ ( 1:1; 1:4; 1:9)) и хроматографией на бумаге (FN -4, элюенты: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:5:1; 6:4:3)) и 1, 15, 30, 60% растворы уксусной кислоты), просматривая хроматограммы в фильтрованном УФ-свете (254 нм).

Для изучения компонентного состава и химического строения образцы веществ с колонки анализируют методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе с диодно-матричным УФ- и масс-селективным детекторами.

Методом ESI-масс-спектрометрии получают масс-спектры веществ, используя ионную ловушку MSD Trap XCT Ultra. Регистрацию масс-спектров образцов проводят как с положительной, так и с отрицательной ионизацией. Полученные спектры анализируются и обрабатываются в программном пакете flexAnalysis.

Спектры ПМР записаны на спектометре Фурье AVANCE AV 300. В качестве внутреннего стандарта используют тетраметилсилан (ТМС).

R=H, R₁=H (флавоноид 1);

R=OCH₃, R₁=H (флавоноид 2);

R=H, R₁=OCH₃,(флавоноид 3);

R=OH, R₁=H (флавоноид 4);

R=H, R₁=OH (флавоноид 5).

По физико-химическим свойствам выделенных из василька шероховатого флавоноидов установили наличие флавоноидов: гиспидулин (5,7,4'-тригидрокси-6-метоксифлавон), апигенин (5,7,4'-тригидроксифлавон), хризоэринол (5,7,4'-тригидрокси-3'-метоксифлавон) и лютеолин (5,7,3',4'-тетрагидроксифлавон), а также скутелляреин (5,6,7,4'-тетрагидроксифлавон).



Заключение

Флавоноиды исключительно многогранны. В равной мере они интересны как объекты изучения в ботанике, фармакогнозии, фитохимии и особенно в фармации и медицине.

В курсовой работе рассмотрены особенности строения, представлены современные методы идентификации, выделения и разделения флавоноидов. Также в работе проанализированы основные способы экстрагирования лекарственного растительного сырья и выявлены оптимальные условия проведения экстракции, рассмотрены основные методы качественного и количественного определения природных флавоноидов в лекарственном растительном сырье. Особое внимание уделялось физико-химическим методам анализа.

...