Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

02.00.10 - Біоорганічна хімія

Антигенна структура білків оболонки двох українських штамів м-вірусу картоплі

Ткаченко Тетяна Юріївна

Київ 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі структури і функції білків та пептидів Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук Вітер Сергій Сильвестрович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, старший науковий співробітник відділу структури і функції білків та пептидів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу хімії білка

доктор біологічних наук Щербатенко Іван Степанович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних вірусів

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ молекулярної імунології

Захист відбудеться 13 червня 2003 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 12 травня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

1. Загальна характеристика роботи

антиген вірус картопля

Актуальність теми. Вірусні хвороби рослин спричиняють значні втрати врожаю та зниження якості сільськогосподарської продукції. Необхідність вивчення фітовірусів на Україні визначається, в першу чергу, тим, що більша частина території України - це райони інтенсивного землеробства. Розробка високочутливих та специфічних методів діагностики фітовірусів і ефективних заходів боротьби з ними потребує детального вивчення їх біологічних та структурно-функціональних характеристик. Цінну інформацію щодо структури вірусних білків, організації вірусної частки, деяких функціональних характеристик вірусів рослин можна одержати шляхом вивчення їх антигенної структури. Одним з критеріїв оцінки ступеню спорідненості вірусів рослин є їх антигенні властивості. Вивчення антигенної структури фітовірусів та їх білків є підґрунтям для створення чутливих імунохімічних тест-систем для виявлення та ідентифікації вірусів в рослинному матеріалі, а також становить суто теоретичний інтерес, оскільки фітовіруси є безпечними та зручними моделями для дослідження таких фундаментальних проблем біоорганічної хімії як механізми білок-білкової та білок-нуклеїнової взаємодії, самоорганізація макромолекулярних комплексів.

Антигенні властивості карлавірусів, незважаючи на широку розповсюдженість представників цієї групи та високу враженість ними виробничих посівів в світі та в Україні, на сьогодні залишаються маловивченими. Зручних методів швидкої та точної діагностики карлавірусів в Україні не розроблено. Аналіз антигенної структури окремих вірусів карлагрупи за допомогою моноклональних антитіл є необхідним кроком на шляху створення імунохімічних тест-систем для виявлення та ідентифікації карлавірусів, зокрема М-вірусу картоплі (Potato virus M - PVM), а також може надати інформацію щодо особливостей просторової організації субодиниць структурного білка та вірусної частки в цілому.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у межах тематичних планів Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (тема № 2.1.10.14) “Дослідження фізико-хімічної та антигенної будови білка Р69 кашлючного мікроба, дифтерійного токсину та капсидних білків деяких штамів М-вірусу картоплі” (номер держреєстрації 0197U009977).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала в локалізації та характеристиці антигенних детермінант білків оболонки (БО) двох українських штамів М-вірус картоплі (PVM U1 та PVM U7) за допомогою трьох моноклональних антитіл (МКА), а також у виявленні особливостей первинної та вторинної структури БО ряду карлавірусів.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

Проаналізувати за допомогою МКА фрагменти, одержані в результаті ферментативного протеолізу білків оболонки PVM U1 і PVM U7, та встановити амінокислотну послідовність пептидів, що розпізнаються МКА.

Визначити розташування антигенних детермінант на поліпептидному ланцюзі білка оболонки відносно одна одної.

Охарактеризувати визначені антигенні детермінанти шляхом аналізу синтетичних аналогів та модифікованих похідних відповідних фрагментів.

Провести множинне вирівнювання первинних структур білків оболонки карлавірусів та виділити консервативні мотиви, специфічні для білків оболонки карлавірусів.

Провести передбачення та множинне порівняння вторинних структур білків оболонки карлавірусів і вивести загальну схему організації вторинної структури, характерної для білків оболонки карлавірусів, зокрема для PVM.

Об'єкт дослідження - білки оболонки двох штамів PVM U1 та PVM U7, виділених в Україні в зоні Полісся.

Предмет дослідження - антигенні властивості та структурні характерис-тики субодиниць білка оболонки та вірусних часток PVM U1 та PVM U7.

Методи дослідження. При аналізі антигенної структури білків оболонки PVM U1 та PVM U7 використані такі методи біоорганічної хімії та біохімії, як ферментативний гідроліз білка, фракціонування пептидів методом ВЕРХ, гель-електрофорез, хімічна модифікація пептидів, дот імуноблотинг, імуноферментний аналіз (ІФА) та інгібування ІФА; при аналізі первинної та вторинної структури БО карлавірусів - методи множинного вирівнювання послідовностей, пошуку мотивів в білкових базах даних та передбачення вторинної структури.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено імунохімічний аналіз двох українських штамів PVM U1 та PVM U7 за допомогою моноклональних антитіл. Вперше локалізовано антигенні детермінанти, які специфічно розпізнаються МКА M6D5 та M9G1 на поліпептидних ланцюгах білків оболонки PVM U1 та PVM U7, та встановлено розташування антигенних детермінант, що взаємодіють з МКА М4С1, M6D5 та M9G1, відносно одна одної. Показано, що N-кінцева ділянка БО PVM експонована на поверхню білкової субодиниці та вірусної частки. Шляхом модифікації пептидів цитраконовим ангідридом встановлено внесок бокової групи лізину у взаємодію антигенних детермінант з відповідними антитілами.

Проведено аналіз синтетичних аналогів пептидів, що розпізнаються МКА M6D5 та M9G1, та визначено внесок негативно заряджених залишків амінокислот у формування комплексу антиген-антитіло.

Аналіз та порівняння первинних та вторинних структур БО карлавірусів дозволили виявити особливості, властиві лише карлавірусам, а також ряд спільних ознак в організації капсидних білків вірусів зі спіральним типом капсиду. Вперше запропоновано загальну схему вторинної структури БО карлавірусів.

Практичне значення отриманих результатів. Локалізація та характеристика антигенних детермінант, що знаходяться на поверхні вірусної частки та розпізнаються PVM-специфічними МКА, дозволяють створити зручні та чутливі тест-системи для експрес-діагностики PVM.

За результатами множинного вирівнювання амінокислотних послідовностей БО карлавірусів були виділені специфічні для білків оболонки карлавірусів мотиви, які можуть бути застосовані як один з критеріїв встановлення приналежності вірусних білків оболонки до групи карлавірусів.

Особистий внесок здобувача. Виділення БО PVM U1 та PVM U7, гель-електрофорез, розщеплення БО PVM U1 та PVM U7 трипсином та термолізином, модифікація пептидів цитраконовим ангідридом, імунохімічний аналіз БО, його фрагментів та їх синтетичних аналогів, а також аналіз первинної та вторинної структури БО двадцяти трьох карлавірусів здійснені особисто здобувачем. Результати дослідів, що опубліковані в статтях зі співавторами, і що увійшли до дисертації, одержані особисто дисертантом. Віруси штамів PVM U1, PVM U7 та PVM U2 були ізольовані в Інституті сільськогосподарської мікробіології НААН України (м. Чернігів) та накопичені разом зі співробітником цього інституту к.б.н. Л.П. Коломієць. Моноклональні антитіла M6D5, M9G1 та M4C1 були отримані в Інституті хімічної та біологічної фізики АН Естонії (м. Таллінн) та люб'язно надані професором М.Ю. Саарма. Автор щиро вдячний співробітникам вищеназваних організацій.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на V Міжнародному симпозіумі з плюс-ланцюгових РНК-вірусів, “Fifth International Symposium on Positive Strand RNA Viruses” (Ст.-Петербург, Флоріда, США, 1998); II Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 1998); XV та XVIII Наукових конференціях з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ 2000, 2003).

Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях Вченої ради та наукових семінарах в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Публікації. За результатами роботи опубліковано 3 статті в наукових фахових журналах та 2 тези у збірках міжнародних конференцій.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (3 розділи, 11 підрозділів), висновків, списку літературних джерел (247 найменувань). Робота викладена на 128 сторінках машинописного тексту. Дисертація містить 19 ілюстрацій, таблицю та додаток.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури. В огляді літератури представлені сучасні дані про організацію вірусної частки, структуру геному та білка оболонки представників роду карлавірусів, зокрема PVM, а також висвітлено стан та перспективи досліджень антигенної структури деяких фітопатогенних вірусів зі спіральним капсидом.

Матеріали та методи досліджень. Віруси штамів PVM U1 та PVM U7 накопичували на рослинах томатів та виділяли зі свіжого листя рослин через 30-40 діб після зараження (Николаева О.В. и др., 1985). БО PVM виділяли шляхом виморожування суспензії вірусів в присутності солянокислого гуанідину та хлориду літію (Wu G. J. and Bruening G., 1971). Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry O.H., 1951). Чистоту та гомогенність препаратів вірусів та білків оболонки контролювали спектрофотометрично на приладах “SPECORD” (Німеччина) і СФ-16 (“ЛОМО”, Росія). Молекулярну масу білків оболонки PVM визначали методом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (ДСН) (Laemmli U.K., 1970) з використанням набору маркерних білків LMW Sigma Markers (“Sigma”, США).

Для аналізу антигенної структури БО PVM U1 (БО U1) та БО PVM U7 (БО U7) використовували МКА M6D5, M9G1 та M4C1, які були отримані до вірусних часток PVM (Російський штам - PVM Ru) (Jдrvekьlg L. et al., 1989).

БО U1 та БО U7 розщеплювали трипсином та термолізином. Одержані суміші пептидів фракціонували методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) в оберненій фазі на хроматографічній системі “LKB-PHARMACIA” (Швеція), на колонці “LiChrosorb RP-18”, 5 мкм, 250 х 4,6 мм; елюцію проводили в лінійному градієнті ацетонітрилу. Пептидні фракції аналізували методом непрямого ІФА (Clark M.F. and Adams A.N., 1977) на планшетах для мікротитрування (“Nunk”, Данія). Результати ІФА фіксувалися на автоматичному спектрофотометрі “Kinetic Microplate Reader” (“Molecular devices”, США). Амінокислотну послідовність пептидів встановлювали на газофазному сіквенаторі, модель 816 (“Knauer”, Німеччина) згідно методики, рекомендованої виробником, в Інституті молекулярної біології ім. Енгельгардта РАН (м. Москва, Росія).

Дот імуноблотинг проводили на нітроцелюлозних мембранах “Hybond C” 0,45 мкм (“Amersham”, Велика Британія). БО наносили на нітроцелюлозну мембрану за допомогою автоматичної піпетки. Вільні сайти адсорбції блокували бичачим сироватковим альбуміном (БСА). Для одержання кольорової реакції в якості субстрату пероксидази хрону використовували 3,3'-діамінобензидин.

Блокування аміногрупи залишку лізину в пептидах проводили з використанням цитраконового ангідриду (Dixon H.B. and Perham R.N., 1968).

Пептиди EARPLPTAADFEGK (П14), AADFEGK (П7), AAAFEGK (П1), AADFAGK (П2), AAAFAGK (П3) були синтезовані твердофазним методом з використанням Boc-захищених амінокислот (Barany G. and Merrifield R. B., 1980) в НВО “Верта” (м. Санкт-Петербург, Росія). Синтетичні пептиди аналізувалися методом інгібування ІФА (Altschuh D. and Van Regenmortel M.H.V., 1982). Планшети сенсибілізували БО PVM або пептидом П14. МКА M6D5 та M9G1 перед внесенням в лунки преінкубували з синтетичними пептидами П14, П7, П1, П2 та П3 протягом 1 год при кімнатній температурі. Інші етапи проводилися як у традиційному непрямому ІФА.

Пошук первинних структур БО карлавірусів здійснювали в базі даних білкових послідовностей Entrez Proteins Національного центру біотехнологічної інформації, США (National Center for Biotechnology Information - http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Множинне вирівнювання первинних структур БО карлавірусів проводилося з використанням програми CLUSTAL W (Thompson J.D. et al., 1994) зі стандартними параметрами вирівнювання. Програма CLUSTAL W доступна через інтернет-сервер з молекулярної біології ExPASy (Expert Protein Analysis System - експертна система з аналізу білків) - http://www.expasy.org, а також на сайті Європейського інституту біоінформатики - http://www.ebi.ac.uk/clustalw.

Сканування баз даних відомих білкових послідовностей SWISS-PROT та TrEMBL (Bairoch A. and Apweiler R., 1997) на наявність заданих мотивів проводилося з використанням Бази даних білкових родин та доменів PROSITE - Database of protein families and domains та інструменту ScanProsite (http://cn.expasy.org/tools/scanprosite) (Bairoch A. et al., 1997).

Передбачення вторинної структури БО карлавірусів проводили за методом SOPMA (Geourjon C. and Deleage G., 1995) з наступними параметрами передбачення: кількість конформаційних станів - 4 (б-спіраль, в-складка, в-поворот, нерегулярна структура), поріг подібності - 8, ширина вікна - 17.

Аналіз антигенної структури білків оболонки двох українських штамів М-вірусу картоплі. Очищені препарати PVM U1 та PVM U7 мали типові для карлавірусів УФ-спектри з максимумом поглинання при 260 нм та мінімумом - при 247 нм. Для спектрів поглинання очищених вірусних препаратів були характерні співвідношення, типові для PVM: Е260/Е280=1,25 та Емакс/Емін=1,12.

Чистоту та гомогенність препаратів БО U1 та БО U7 перевіряли електрофорезом в ПААГ-ДСН. При електрофорезі в 10,5 %-ному ПААГ з 0,1 % ДСН було виявлено відмінності в значеннях молекулярної маси БО для двох штамів: молекулярна маса БО U1 становила 37,3 кДа, а БО U7 - 36,4 кДа. Різниця між молекулярними масами БО споріднених штамів може бути пояснена амінокислотними замінами, делеціями, вставками в поліпептидному ланцюгу БО, а також пост-трансляційними модифікаціями білкової молекули, зокрема глікозилюванням.

З метою локалізації епітопів БО U1 та БО U7 були гідролізовані трипсином. Суміш триптичних пептидів фракціонували методом ВЕРХ на колонці з оберненою фазою, елюцію проводили в лінійному градієнті ацетонітрилу 2-60%. Зібрані фракції та БО U1 і U7 тестувалися в непрямому ІФА на взаємодію з МКА M6D5, M9G1 та M4C1. Рівень реакції БО U1 і U7 та БО PVM Ru з МКА M6D5, M9G1 та M4C1 був однаковим.

В результаті ІФА триптичних фракцій було виявлено, що жодна фракція не розпізнавалася МКА М4С1; МКА M6D5 взаємодіяли з фракціями U1-13 та U1-14, одержаними при розділенні фрагментів БО U1 та фракціями U7-15 та U7-16, одержаними при розділенні фрагментів БО U7; МКА M9G1 розпізнавали фракції U1-14 та U7-16. Фракції, що взаємодіяли з МКА були рехроматографовані з використанням комбінації лінійного градієнту та елюції в ізократичних умовах. Очищені пептиди з кожної фракції були перевірені в ІФА на здатність розпізнаватися МКА, після чого було встановлено їх амінокислотну послідовність:

U1-13: EARPLPTAADFEGKDTSENTDGR

U1-14: EARPLPTAADFEGK

U7-15: GARPLPTAADFEGKDTSENTDGR

U7-16: GARPLPTAADFEGK.

Послідовність пептидів U1-14 та U7-16 відповідає послідовності в позиціях 22-35, а пептидів U1-13 та U7-15 - в позиціях 22-44 БО PVM Ru (далі в тексті ці пептиди умовно позначені як 22Glu/Gly-Lys35 та 22Glu/Gly-Arg44). Пептиди U1-13 та U7-15 являють собою пептиди U1-14 та U7-16, подовжені в С-кінцевому напрямку на 9 залишків, та містять зв'язок 35Lys-Asp36, що частково не розщепився трипсином. В БО U7 було виявлено амінокислотну заміну: в позиції 22 БО U1 та БО PVM Ru знаходиться залишок глютамінової кислоти, а в БО U7 - гліцину. Заміна GluGly не впливає на взаємодію МКА з пептидами та цілою молекулою БО U7, тобто, скоріш за все, залишок Glu22 не є критичним для взаємодії епітопів M6D5 та M9G1 з відповідними МКА. Пептид 22Glu/Gly-Lys35 є спільною ділянкою зв'язування для МКА M6D5 та M9G1. Той факт, що МКА M9G1, на відміну від МКА M6D5, не розпізнають фрагмент 22Glu/Gly-Arg44, може свідчити про те, що МКА M6D5 та M9G1 специфічні до різних епітопів, які, або розташовані послідовно, або перекриваються.

Втрату здатності МКА M9G1 розпізнавати ділянку 22Glu/Gly-Lys35 у складі пептиду 22Glu/Gly-Arg44 можна пояснити різною конформацією цих пептидів. В результаті аналізу первинної структури ділянки, що містить епітопи M6D5 та M9G1 було побудовано гіпотетичну модель структури цього фрагменту. Згідно цієї моделі, ділянка БО U1 та U7 в позиціях 34-49 має схильність до формування петлі, яка стабілізована зв'язком між Glu39 та Arg44 та містить залишки 40Asn-Gly43. У випадку, якщо Glu39 та Arg44 поєднані водневим зв'язком між N-H пептидного зв'язку залишку Arg44 та C=O пептидного зв'язку залишку Glu39, то петля являє собою -поворот (Rajashankar K. R. and Ramakumar S., 1996). Якщо ж бокові радикали Glu39 та Arg44 зорієнтовані в середину петлі, то між зарядженими групами ймовірним є утворення іонного зв'язку. В обох випадках можливою є також додаткова стабілізація петлі за рахунок іонних зв'язків між Lys35 та Asp47 (або Asp49). Згідно побудованої моделі в нативному білку водневі та (або) іонні зв'язки підтримують петлеподібну структуру в певному напруженні. Гідроліз трипсином зв'язку 44Arg-Ala45 призводить до деформації цієї петлі, порушення нативної конформації ділянки 22Glu/Gly-Arg44 та, як наслідок, відсутності взаємодії цього пептиду з МКА M9G1. Просторова структура короткого пептиду 22Glu/Gly-Lys35, що розпізнавався МКА M9G1, скоріш за все, значно не змінюється. Порушення конформації фрагменту 22Glu/Gly-Arg44 не впливало на розпізнавання епітопу M6D5 відповідними МКА.

Для підтвердження висновку про те, що МКА M6D5 та M9G1 розпізнають два на БО U1 та U7 різні епітопи, а також для визначення відносного розташування епітопів, що взаємодіють з МКА M6D5, M9G1 та М4С1, було проведено дот імуноблотинг. В якості антигенів на нітроцелюлозні мембрани наносилися БО U1, U7, U2 та PVM Ru. МКА M6D5 та M9G1 були застосовані як перші антитіла, а МКА М4С1 кон'юговані з пероксидазою хрону - як другі антитіла. В результаті дот імуноблотингу було показано, що МКА M6D5 не заважають взаємодії МКА М4С1 з БО різних штамів PVM, тоді як МКА M9G1 блокують реакцію МКА М4С1 з БО PVM. Ці дані підтверджують те, що МКА M6D5 та M9G1 розпізнають різні епітопи, що перекриваються між собою. Ці результати дозволяють також припустити, що МКА M9G1 та М4С1 взаємодіють з епітопами, які або перекриваються між собою, або близько розташовані на поліпептидному ланцюгу чи на поверхні білкової глобули.

З метою встановлення внеску бокового ланцюга Lys35 у взаємодію МКА M6D5 та M9G1 з відповідними епітопами було проведено цитраконилювання пептидів U1-14 та U7-16, одержаних після протеолізу БО U1 та U7 трипсином. При порівнянні взаємодії цитраконильованих та інтактних пептидів U1-14 та U7-16 з МКА M6D5 та M9G1 в непрямому ІФА були одержані наступні результати: рівень реакції МКА M6D5 з модифікованими пептидами зменшився на 10 % у порівнянні з рівнем реакції МКА M6D5 з немодифікованими пептидами, тоді як реакція МКА M9G1 з цитраконовими похідними пептидів була вдвічі вищою, ніж з немодифікованими пептидами U1-14 та U7-16. Цей ефект можна пояснити, виходячи з того, що епітоп, який розпізнається МКА M9G1, простягається в С-кінцевому напрямку за межі ділянки 22Glu/Gly-Lys35: негативний заряд полуаміду 2-метилмалеїнової кислоти, що замінив позитивний заряд залишку Lys35 внаслідок цитраконилювання, міг імітувати негативно заряджену бокову групу залишку аспарагінової кислоти (позиція 36), відсутнього в пептиді 22Glu/Gly-Lys35. Таким чином, залишок Asp36 може брати участь у взаємодії МКА M9G1 з відповідним епітопом, а для розпізнавання МКА M6D5 свого епітопу - не є критичним. Позитивно заряджена бокова група Lys35 безпосередньо не бере участі у взаємодії МКА M9G1 з відповідним епітопом. Це узгоджується із запропонованою моделлю петлеподібної структури в позиціях 34-49, у відповідності з якою заряджена бокова група Lys35 зорієнтована в середину петлі та бере участь в утворенні іонного зв'язку з Asp47 (або Asp49). Тобто, скоріш за все, залишок лізину в позиції 35 грає роль у формуванні оптимальної просторової структури епітопу, який розпізнається M9G1.

З метою виділення більш коротких фрагментів, здатних розпізнаватися МКА, БО U1 було розщеплено термолізином. Продукти розщеплення розділяли методом ВЕРХ на колонці з оберненою фазою в лінійному градієнті ацетонітрилу 2-60 %. В результаті ІФА зібраних фракцій із застосуванням МКА M6D5, M9G1 та M4C1 було виявлено, що МКА М4С1 не розпізнавали жодної фракції, тоді як МКА M6D5 та M9G1 взаємодіяли з фракцією 17. Фракцію 17 було рехроматографовано з використанням комбінації лінійного градієнту та елюції в ізократичних умовах, після чого було визначено амінокислотну послідовність пептиду, що розпізнавався МКА M6D5 та M9G1: AADFEGK. Послідовність відповідала позиціям 29-35 послідовності БО PVM Ru (далі в тексті цей пептид умовно позначено як 29Ala-Lys35). Гептапептид 29Ala-Lys35 являє собою С-кінцеву частину триптичного тетрадекапептиду 22Glu/Gly-Lys35, який також розпізнавався МКА M6D5 та M9G1. Гептапептид 29Ala-Lys35 містить достатню кількість критичних амінокислотних залишків для взаємодії з МКА M6D5 та M9G1 та являє собою спільну ділянку зв'язування цих МКА.

На основі даних епітопного картування були синтезовані тетрадекапептид EARPLPTAADFEGK (П14) та гептапептид AADFEGK (П7), що відтворювали послідовності триптичного пептиду 22Glu-Lys35 та термолізинового пептиду 29Ala-Lys35, відповідно. Для визначення ролі негативно заряджених амінокислот у взаємодії МКА M6D5 та M9G1 з відповідними епітопами також були синтезовані три гептапептиди, в яких залишки негативно заряджених амінокислот були замінені на залишок аланіну:

пептид AAAFEGK (П1) з заміною Asp31Ala,

пептид AADFAGK (П2) з заміною Glu33Ala,

пептид AAAFAGK (П3) з подвійною заміною Asp31Ala та Glu33Ala.

При аналізі в непрямому ІФА рівень реакції пептиду П14 з МКА M6D5 при однакових концентраціях був вищим, ніж з МКА M9G1, що може бути пов'язано з тим, що в цьому пептиді представлено лише частину антигенної детермінанти, яка розпізнається МКА M9G1, та (або) з тим, що конформація пептиду П14 не є оптимальною для розпізнавання МКА M9G1.

Здатність синтетичних пептидів розпізнаватися МКА M6D5 та M9G1 досліджували методом інгібування ІФА, де синтетичні пептиди використовували як інгібітори реакції МКА з антигенами, адсорбованими на планшеті. В якості антигенів використовували БО U1 та пептид П14. Ступінь інгібування (в %) розраховували як відношення рівня реакції в присутності інгібітору до рівня відповідних контрольних (без інгібітору) реакцій МКА з БО U1 та пептидом П14. З використанням методу інгібування ІФА було показано, що пептиди П14, П7, П1, П2 та П3 з різною ефективністю інгібують взаємодію МКА з БО та пептидом П14.

Синтетичні гепта- та тетрадекапептиди, що не містили замін (П7 та П14), інгібували на 95-98 % взаємодію МКА M6D5 з БО в концентраціях на три порядки вищих, ніж взаємодію МКА M6D5 з пептидом П14 (100-200 нМ та 200-400 пМ, відповідно). Гептапептид П7 значно ефективніше інгібує взаємодію МКА M9G1 з пептидом П14 , ніж сам пептид П14.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1 Інгібування взаємодії M6D5-П14 та M9G1-П14 синтетичними пептидами П7 та П14. Лінії: 1 - пептидом П7 взаємодії M6D5-П14; 2 - пептидом П7 взаємодії M9G1-П14; 3 - пептидом П14 взаємодії M6D5-П14

Тобто спостерігається така ж тенденція, що й при аналізі триптичних фрагментів БО U1 та БО U7 (див. стор. 6-7), коли МКА M9G1, на відміну від МКА M6D5, розпізнавали лише короткі пептиди 22Glu/Gly-Lys35 і не реагували з цією ж ділянкою в складі подовжених пептидів 22Glu/Gly-Arg44. Аналіз синтетичних пептидів П14 (аналог 22Glu/Gly-Lys35) та П7 (аналог 29Ala-Lys35, С-кінцевої половини П14) також показав, що укорочення пептиду покращує його здатність взаємодіяти з МКА M9G1. Це може бути пояснено тим, що для специфічного розпізнавання МКА M9G1 свого епітопу (або його частини) надзвичайно важливу роль відіграє просторова структура цієї ділянки: скоріш за все, пептид П7 має більш відповідну конформацію для взаємодії з паратопом МКА M9G1 (або здатний її набути під час взаємодії з МКА), ніж пептид П14, а тим більше, ніж пептид 22Glu/Gly-Arg44, який при наявності необхідного набору критичних для взаємодії амінокислотних залишків, взагалі не розпізнається МКА M9G1. Для МКА M6D5 зв'язок між розпізнаванням та довжиною пептиду, що містить епітоп (або його частину), не спостерігався, тобто, для взаємодії з паратопом МКА M6D5 просторова структура цієї ділянки не відіграє такої принципової ролі, як для взаємодії з МКА M9G1.

При порівнянні здатності пептидів, що містять заміни залишків аспарагінової та глютамінової кислот на залишок аланіну, інгібувати взаємодію МКА M6D5 та M9G1 як з БО, так і з тетрадекапептидом П14, було знайдено, що найбільш ефективним інгібітором є пептид із заміною по залишку глютамінової кислоти (П2). При цьому очевидно, що заміна залишку глютамінової кислоти все ж таки впливає на розпізнавання гептапептиду обома МКА. Для повного пригнічення взаємодії між МКА M6D5 та пептидом П14 потрібні були на 3 порядки більші концентрації гептапептиду із заміною по залишку глютамінової кислоти П2 (200 нМ), ніж гептапептиду без замін П7 (300-400 пМ).

Гептапептид із заміною по залишку аспарагінової кислоти (П1) при максимальній концентрації 200 нМ, яка використовувалася в експерименті, інгібував на 80-90 % взаємодію МКА M6D5 з обома адсорбованими на планшеті антигенами, але при нижчих концентраціях його здатність до інгібування була на 8-15 % меншою, ніж гептапептиду із заміною по залишку глютамінової кислоти П2. Подвійна заміна Asp31Ala та Glu33Ala в гептапептиді П3 радикально знижувала здатність цього пептиду інгібувати взаємодію як з БО, так і з синтетичним тетрадекапептидом П14.

В реакції між МКА M9G1 та обома адсорбованими на планшеті антигенами найбільш сильним інгібітором також був гептапептид із заміною по залишку глютамінової кислоти (П2). При максимальній концентрації цей пептид інгібував взаємодію між МКА M9G1 та тетрадекапептидом П14 на 90 %, однак при використанні в якості адсорбованого антигену БО рівень інгібування пептидом П2 досягав лише 35 %. При порівнянні результатів інгібування пептидом П2 (Glu33Ala) взаємодії між МКА та адсорбованими антигенами були виявлені певні відмінності: в реакції між МКА M9G1 та обома антигенами інгібування пептидом П2 спостерігалося при високих концентраціях (>100 нМ), тоді як в реакції за участю МКА M6D5 - при низьких концентраціях (<10 нМ). Заміна по залишку аспарагінової кислоти призводить до значного зниження здатності гептапептиду взаємодіяти з МКА M9G1: в максимальних концентраціях цей пептид (П1) інгібував реакцію МКА M9G1 з адсорбованим тетрадекапептидом П14 лише на 9 %, а з БО - на 1 %. Практично на тому ж рівні взаємодію МКА M9G1 з адсорбованими антигенами інгібував гептапептид П3 з подвійною заміною Asp31Ala та Glu33Ala, тобто його здатність розпізнаватися МКА M9G1 також виявилася дуже низькою.

В результаті аналізу синтетичних аналогів спільної ділянки зв'язування МКА M6D5 та M9G1 було визначено роль негативно заряджених амінокислотних залишків в позиціях 31 та 33 у взаємодії антиген-антитіло. Залишки глютамінової та аспарагінової кислот беруть участь у взаємодії епітопів M6D5 та M9G1 з відповідними МКА, однак внесок їх відрізняється. В реакції з обома МКА залишок аспарагінової кислоти в позиції 31 є більш критичним, ніж залишок глютамінової кислоти в позиції 33, причому залишок аспарагінової кислоти важливіший для розпізнавання антитілами M9G1 відповідного епітопу. Одночасна заміна Asp31 та Glu33 радикально зменшує розпізнавання гептапептиду антитілами M9G1, що свідчить про ключову роль цих залишків у взаємодії з МКА M9G1, тоді як у відсутності Asp31 та Glu33 гептапептид частково зберігає здатність розпізнаватися МКА M6D5. Це свідчить про те, що у взаємодії МКА M6D5 зі специфічним епітопом важливу роль відіграють інші залишки, розташовані на ділянці 29Ala-Lys35.

Спільною та передбачуваною тенденцією при дослідженні результатів інгібування ІФА синтетичними пептидами було те, що однакові концентрації інгібіторів (П14, П7, П1, П2 та П3) ефективніше інгібують взаємодію МКА M6D5 та M9G1 з П14, ніж з БО U1. Ці результати свідчать про те, що нативна конформація антигену та оточення цієї ділянки в складі білкової молекули є надзвичайно важливими для взаємодії між МКА та епітопами, навіть якщо припустити, що всі критичні залишки епітопів представлені на ділянці 22Glu-Lys35 (тетрадекапептид П14).

Порівняльний аналіз первинної та вторинної структури капсидних білків карлавірусів. З використанням програми CLUSTAL W було здійснено множинне вирівнювання амінокислотних послідовностей БО двадцяти трьох вірусів карлагрупи, зокрема для п'яти вірусів аналізувалися 2-3 штами та ізоляти. В результаті вирівнювання було встановлено, що більшість БО карлавірусів мають високий ступінь гомології один з одним, однак ступінь схожості між структурними білками окремих представників групи відрізняється. Найменшим ступенем гомології з іншими послідовностями характеризується БО вірусу мозаїки тополі (Poplar mosaic virus - PopMV).

N-кінцеві фрагменти БО карлавірусів (приблизно 50 позицій), на відміну від корової та С-кінцевої частини, характеризуються високою варіабельністю. У більшості БО ці фрагменти містять багато залишків гліцину та проліну, які перешкоджають утворенню або деформують регулярні елементи вторинної структури (-спіралі та -складки). N-кінцева ділянка насичена також зарядженими залишками, що збільшують її гідрофільність та, завдяки цьому, підвищують ймовірність того, що фрагменти цієї ділянки експоновані на поверхню білкової глобули. Розташування N- і С-кінцевих фрагментів БО на поверхні вірусного капсиду раніше було встановлено для багатьох фітовірусів зі спіральним типом симетрії капсиду (Bloomer A.C. et al., 1978; Baratova L.A. et al., 2001). Також відомо, що більшість вірусспецифічних епітопів у представників паличковидних та нитковидних вірусів рослин локалізовані саме в N-кінцевій області білка, а групоспецифічні епітопи розташовані в коровій частині БО та в більшості своїй є конформаційними (Shukla D.D. et al., 1989; Joisson C. et al., 1992; Fernandez-Fernandez M.R. et al., 2002). Це свідчить про такі спільні властивості БО вірусів зі спіральним типом симетрії як консервативність амінокислотних послідовностей та просторових структур корової частини у вірусів однієї групи та мінливість кінцевих ділянок поліпептидного ланцюга, що виступають на поверхню білкової субодиниці.

Курова та С-кінцева області БО карлавірусів містять консервативні мотиви різної довжини. Висока консервативність цих ділянок свідчить про їх важливу роль при формуванні третинної структури білкової субодиниці. На підставі результатів множинного вирівнювання первинних структур БО 23 карлавірусів умовно були виділені сім консервативних мотивів (М1-М7). При описі мотивів були використані наступні позначення: 1) ідентичні для всіх послідовностей залишки позначалися відповідним однобуквеним кодом; 2) якщо в даній позиції знаходилися від двох до чотирьох залишків, то ці залишки вказувалися в квадратних дужках, наприклад, [GT], [МКРТ]; 3) позначення Х (будь-який залишок) було використано при наявності в даній позиції більше чотирьох залишків; 4) якщо в ряді послідовностей для даної позиції залишок був відсутній (розриви при вирівнюванні), то ця позиція позначалася як: залишок(0,1), наприклад G(0,1), де “0” позначає розрив, а “1” - наявність залишку.

Згідно обраних умовних позначень, виділені мотиви можуть бути представлені в такий спосіб (номера позицій установлені при множинному вирівнюванні та не збігаються з номерами позицій в індивідуальних послідовностях БО)

Раніше, рядом авторів було відмічено консервативний мотив, характерний для капсидних білків потекс- і карлавірусів [RK]-[FYW]-A-[GAP]-F-D-X-F-X-Х-[LV]-X-Х-Х-[GAST]-[GAST] (Abouhaidar M.G. and Lai R. , 1989; Henderson J. Et al., 1992). У базах даних білкових послідовностей цей мотив розглядається як специфічна “характерна ознака” (“signature”) БО потекс- і карлагрупи вірусів рослин. Цей мотив відповідає позиціям 250-265 виділеного нами мотиву М5, проте має значні відмінності в представленні послідовності мотиву.

Мотиви М3 та М4 містять консервативні залишки цистеїну в позиціях 176 і 218, відповідно. Для PopMV мотив М4 не є характерним, між тим Cys у позиції 218 зберігається.

Консервативність розташування цистеїну в цих мотивах дозволяє припустити, що залишки Cys беруть участь в утворенні дисульфідних зв'язків або між собою, або з іншими залишками Cys і, таким чином, можуть відігравати важливу роль у формуванні просторової структури корової області білка. З перерахованих вище мотивів привертає до себе увагу мотив М7, що містить послідовність TGG, яка присутня в усіх БО карлавірусів з відомою на даний момент послідовністю, але функція TGG-мотиву дотепер залишається невстановленою.

Для встановлення того, наскільки виділені консервативні мотиви специфічні саме для БО карлавірусів, було здійснено пошук подібних мотивів в базах даних білкових послідовностей з використанням програми PROSITE (інструмент ScanPROSITE). В результаті цього аналізу було встановлено, що мотиви М3, М5 і М6 характерні лише для БО карлавірусів, тоді як мотиви М1, М2 і М7 зустрічаються і в інших білках (більш 1000 відповідностей). Для мотиву М4, виведеного без урахування послідовності PopMV, не було знайдено відповідностей в інших білкових послідовностях, крім як у БО карлавірусів. Однак цей мотив, виведений з урахуванням послідовності PopMV, було знайдено не тільки в капсидних білках карлавірусів, але й у послідовності капсидного білка PVX, штам НВ.

Наступним етапом аналізу первинних структур БО карлавірусів було передбачення вторинної структури кожного білка методом SOPMA. В результаті множинного порівняння передбачених структур для індивідуальних білків були відмічені деякі особливості, характерні для БО карлавірусів: 1) вторинна структура N-кінцевих областей БО варіабельна, а корових і С-кінцевих - досить консервативна; 2) всі БО схильні до формування -спіральних сегментів різної довжини, поєднаних ділянками з переважанням нерегулярної структури. На підставі результатів множинного порівняння вторинної структури було запропоновано загальну схему організації вторинної структури БО карлавірусів