Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

УДК 547.814+541.143+577.336

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Флуоресцентні зонди на основі 3-гідроксихромону: синтез, вивчення спектральних і сенсорних властивостей, випробування в моделях біологічних систем

02.00.10-біоорганічна хімія

Климченко Андрій Сергійович

Київ 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в науковому центрі TUBITAK (Туреччина) та на хімічному факультеті Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: кандидат хімічних наук Пивоваренко Василь Георгійович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, доцент кафедри органічної хімії

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Іщенко Олександр Олександрович, Інститут органічної хімії НАН України, провідний науковий співробітник відділу кольору і будови органічних сполук

доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Дорошенко Андрій Олегович, Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна завідувач відділу фізичної органічної хімії інституту хімії

Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

Захист відбудеться 15 квітня 2003 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.25 на хімічному факультеті Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ, вул. Володимирська 64).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці хімічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка (01033, Київ, вул. Володимирська 64).

Автореферат розісланий 24 лютого 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Комаров І.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Флуоресцентні зонди широко застосовуються у дослідженнях біологічних процесів на молекулярному рівні. Більшість сучасних зондів діють за принципом зміни інтенсивності односмугової флуоресценції. Проте досконалішими є раціометричні зонди, принцип роботи яких полягає у зміні відношення інтенсивностей двох смуг флуоресценції. Розробка раціометричних зондів є актуальною проблемою, тому що в наш час існують лише поодинокі приклади подібних молекулярних пристроїв. У цьому напрямку перспективними є флуоресцентні барвники, молекули яких зазнають фотопереносу протону, тому що це дає можливість ефективного переключення з емісії нормальної збудженої форми на емісію фототаутомеру.

3-Гідроксихромони відомі як флуоресцентні сполуки, здатні до фототаутомеризації, результатом якої є поява двох смуг емісії у їхніх спектрах. Але до цього часу мало було зроблено у напрямку створення флуоресцентних барвників на їх основі. Також мало відомо про флуоресцентні властивості 3-гідроксихромонів. Попередні дослідження 3-гідроксифлавону та його похідних показали високу чутливість їхньої емісії до природи розчинника. Проте кількісних залежностей параметрів емісії від певних параметрів середовища для них досі не було встановлено.

Дослідження біологічної системи, такої як ліпідна мембрана, потребує розміщення зонду в певній її області, що робиться за рахунок приєднання до молекули барвника позитивно зарядженої групи. Тому створення іонних похідних 3-гідроксихромонів є перспективним напрямком розробки раціометричних мембранних зондів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках державної бюджетної теми 01БФ037-03 Київського національного університету ім. Тараса Шевченка “Синтез біологічно активних сполук”, а також грантів наукового центру TUBITAK (Туреччина).

Мета дослідження - розробка двосмугових флуоресцентних зондів на основі 3-гідроксихромону. Завдання: (1) оптимізувати умови синтезу 3-гідроксихромонів; (2) синтезувати нові флуоресцентні барвники на основі 3-гідроксихромону; (3) для створених барвників вивчити спектрально-люмінесцентні властивості та їх зв'язок з будовою молекули барвника; (4) вивчити сенсорні властивості барвників в органічних розчинниках та в більш складних моделях біосистем; (5) створити нові мембранні зонди на основі 3-гідроксихромона та дослідити їхню поведінку в ліпосомах.

Наукова новизна одержаних результатiв. Удосконалено метод синтезу 3-гідроксихромонів, що дозволило одержати нові флуоресцентні барвники - похідні 3-гідроксифлавону та 2-[бензо[d]фуран-2-іл]-3-гідроксихромону, в яких варіюється довжина кон'югованої системи молекули та -донорність замісників в кінцевих циклах кон'югованої системи молекули. Створено сполуки з найбільш довгохвильовим поглинанням та емісією, а також найвищими квантовими виходами емісії серед відомих 3-гідроксихромонів. Встановлено закономірності між флуоресцентними властивостями отриманих барвників в розчинах і їх будовою та природою розчинника.

Детально досліджено сенсорні властивості 3-гідроксихромонів. Вперше продемонстровано, що для цих сполук логарифм відношення інтенсивностей двох смуг флуоресценції перебуває у лінійній кореляції з емпіричним індексом полярності ЕТ(30) та з функцією діелектричної проникливості середовища. Пояснено причини відхилень від лінійності для протонних розчинників і створено сполуку-сенсор, для якої лінійність цих залежностей підтримується у всіх розчинниках. Використання 3-гідроксихромонів разом з відповідними 3-гідроксибензо[f]хромонами дозволяє вивчати одночасно полярність та протонодонорність середовища, що було неможливим раніше.

Випробування нових зондів в обернених міцелах виявили рекордну чутливість параметрів флуоресценції створених сполук до змін параметрів мікрооточення.

Створено похідні 3-гідроксифлавону, які несуть катіонну групу у різних положеннях молекули і цим дозволяють локалізувати молекулу зонду у певній області ліпідної мембрани та у певній орієнтації відносно її поверхні. Встановлено, що нові мембранні зонди мають високу чутливість до зміни електростатичних параметрів ліпідних мембран.

Практичне значення одержаних результатiв. Запропонований спосіб синтезу дає можливість отримувати нові похідні 3-гідроксихромонів за короткий час та з задовільними виходами. Синтезовані флуоресцентні барвники рекомендовані для використання як високочутливі зонди полярності гомогенних рідинних систем. Шляхом молекулярного дизайну створені зонди можна оптимізувати на роботу у будь-якому заданому діапазоні полярності середовища. Нові зонди виявилися надзвичайно ефективними при вивченні поведінки мікрогетерогенних систем, таких як обернені міцели та ліпосоми. Катіонні похідні 3-гідроксихромону рекомендовано для досліджень електростатичних явищ у біомембранах.

Особистий внесок здобувача. Основний об'єм теоретичної та експериментальної роботи виконано здобувачем особисто. У визначенні завдань дослідження, та узагальненні одержаних результатів приймали участь к.х.н., доцент Пивоваренко В. Г. та д.б.н. пров. н. с. Демченко О.П. Автор висловлює щиру подяку науковому центру TUBITAK (Туреччина) за фінансову підтримку наукових програм за темою дисертації та др. Оzturk T. за підтримку синтетичної частини роботи, а також др. Duportail G. та проф. Mйly Y. за співпрацю у дослідженні мембранних зондів у ліпосомах.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідалися на міжнародних наукових конференціях: (1) 3rd Conference on Fluorescence Miscroscopy and Fluorescent Probes (Prague, 1999), (2) IXth ISLS 2000 Luminescence Symposium (2000, Montpellier, France) (3) 7th Conference on Methods and Applications of Fluorescence: Spectroscopy, Imaging and Probes (2001, Amsterdam, Netherlands), (4) 46th Annual Meeting of the Biophysical Society, February 23-27, 2002, San Francisco, USA).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 статей у наукових фахових журналах та 5 тез доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 128 сторінках друкованого тексту. Вона складається з 7 розділів. Список використаних літературних джерел налічує 104 найменування. Робота містить 31 рисунок, 10 схем та 6 таблиць.

Основний зміст роботи

В першому розділі дисертації проведено аналіз літературних джерел який дозволив обґрунтувати актуальність даної роботи. В розділах з другого до шостого представлено результати роботи та їх обговорення. Сьомий розділ присвячено опису матеріалів та методів проведених досліджень. Наведено методики синтезу нових сполук та дані, які підтверджують їх структуру. Описано досліди з моделями біологічних систем та умови проведення спектрально-люмінесцентних досліджень.

Розділ 2. Дизайн і синтез нових барвників класу 3-гідроксихромонів.

Застосування похідних 3-гідроксихромону (3ГХ) у якості флуоресцентних зондів перш за все вимагає покращення їх спектрально-люмінесцентних характеристик, зокрема - зміщення їх максимуму поглинання у видиму область, збільшення молярного коефіцієнту екстинкції та квантового виходу флуоресценції. З цією метою нами здійснено синтез і вивчено властивості наступних барвників на основі 3ГХ, з яких раніше відомими були лише сполуки 1 - 3.

Синтез 3-гідроксихромонів: удосконалення методики. Загальновизнані умови синтезу 3ГХ виявилися неефективними при одержанні похідних з донорними групами (3m, 3j, 4m, 4j), або з анельованими циклами (3f, 3b, 4f і 4b): конденсація у відповідні 2-пропен-1-они відбувалася декілька тижнів, а їх перетворення у 3ГХ за класичною методикою Алгара-Флінна-Оямади призводило тільки до слідів продуктів. Тому умови реакції на обох стадіях були модифіковані, що дало можливість синтезувати нові 3ГХ з задовільними виходами (10-40%) за винятково короткий час (2-5 год).

Розділ 3. Будова і спектрально-люмінесцентні властивості барвників на основі 3-гідроксихромону.

Порівняння спектральних властивостей 2-бензофурил-3-гідроксихромонів та 3-гідроксифлавонів. Спектри поглинання 2-[бензо[d]фуран-2-іл]-3-гідроксихромонів (БФ-3ГХ) 2, 4, 4j і 4m зміщені батохромно на 20-40 нм (1600-2100 см-1) у порівнянні з 2-фенільними аналогами - 3-гідроксифлавонами (3ГФ) 1, 3, 3j і 3m. У спектрах флуоресценції для них спостерігається та ж тенденція, причому батохромне зміщення існує як для N*, так і для Т*-смуги. Більше того, батохромні зсуви у флуоресценції при заміщенні 2-фенілу на 2-бензофурил для диалкіламіно-похідних значно більші у порівнянні з незаміщеними. Співвідношення інтенсивностей емісії двох смуг, IN*/IT* є важливою характеристикою реакції внутрішньомолекулярного фотопереносу протону (ESIPT-реакції). В усіх вивчених розчинниках це співвідношення виявилося значно більшим для БФ-3ГХ 2, 4, 4j і 4m у порівнянні з відповідними флавонами 1, 3, 3j і 3m.

Усі вивчені БФ-3ГХ мають високі квантові виходи флуоресценції у більшості розчинників. Як правило, для них виходи в 2-5 разів вищі, ніж для флавонів. Це дуже важлива перевага БФ-3ГХ як флуоресцентних барвників.

Ефекти -електронодонорних груп. Для обох хромонових серій 1-3-3j і 2-4-4j збільшення -донорності 2-арильної групи призводить до послідовних батохромних зсувів у спектрі поглинання. Батохромні зсуви спостерігаються так само і для обох смуг флуоресценції, причому у випадку N*-смуги вони значно більші. В той же час введення -донора - метоксигруппи у положення 7 (3m і 4m) створює протилежний ефект - гіпсохромний зсув спектру поглинання та N*-смуги емісії. Крім того, 7-метоксипохідні мають більш високі квантові виходи флуоресценції у більшості розчинників.

Найбільше введені -електронодонорні замісники впливають на співвідношення інтенсивностей емісії двох смуг, IN*/IT*. Так, у хлороформі для хромонів 3 і 4 у порівнянні з незаміщеними сполуками 1 і 2 співвідношення IN*/IT* збільшується відповідно в 84 і 210 разів. Подальше збільшення -електронодонорності 2-арила у випадку 3j і 4j викликає додаткове зростання IN*/IT*. В той же час, введення метоксигрупи в положення 7 (сполуки 3m і 4m) призводить до зменшення співвідношення IN*/IT* (Рис. 3).

Анелювання фуранового циклу по грані g хромона Рис. 1. Спектри флуоресценції 3ГХ 4, 4j та 4m у толуолі. викликає значний батохромний зсув Т*-смуги без зміни положення N*-смуги, що збільшує відстань між максимумами для 3f і 4f на 12-17 нм (360-520 см-1) і 7-13 нм (180-320 см-1), відповідно. Фурохромони 3f і 4f мають найбільші коефіцієнти екстинкції (близько 40000 лмоль-1см-1) серед усіх відомих 3ГХ. Проте найбільш цінною властивістю фурохромонів є їх високі квантові виходи флуоресценції. Для 3f і 4f вони завжди приблизно в два рази вищі, ніж для відповідних аналогів 3 і 4, досягаючи рекордних значень у етанолі (70% для 3f) та хлороформі (61% для 4f).

Батохромний зсув N*-смуги 3ГХ при збільшенні -донорності 2-арила завжди супроводжується ростом її відносної інтенсивності, IN*/IT*. Відповідно, гіпсохромні зсуви N*-смуги як наслідок введення 7-метоксигрупи супроводжуються падінням співвідношення IN*/IT* (Таб. 1). Ці закономірності дають підстави припустити, що співвідношення IN*/IT* контролюється енергією N*-форми відносно Т*-форми. У такому разі подовження хромофора, а також збільшення -донорності 2-арила призводить до більш ефективної стабілізації N*-форми в порівнянні з Т*-формою, що підвищує відносну інтенсивність емісії першої.

Більш високі квантові виходи флуоресценції (Ф), що спостерігаються для БФ-3ГХ у порівнянні з 3ГФ є наслідком більш планарної конформації перших. Про це свідчать проведені нами квантово-механічні розрахунки (АМ1-метод).

Розділ 4. Сенсорні властивості 3-гідроксихромонів

Чутливість 3-гідроксихромонів до полярності оточення. Шкалою полярності для опису сольватохромних властивостей 3-гідроксихромонів був обраний найбільше вживаний спектроскопічний емпіричний індекс полярності ЕТ(30).

На відміну від спектрів поглинання, спектри флуоресценції 3ГХ 2, 3, 3m, 3j, 4, 4m, 4j мають чітку залежність від полярності розчинника. Цей ефект значно більш виражений для короткохвильової N*-смуги, для якої зафіксовано систематичні батохромні зсуви з ростом полярності (Таб. 1). Винятком є найпростіший 3ГХ 1, для якого положення обох смуг не корелює з полярністю розчинника.

Найбільш виразно ефекти полярності середовища проявляються у зміні співвідношення інтенсивностей смуг емісії IN*/IT*. Збільшення полярності розчинника призводить до сильного росту IN*/IT*. Логарифм цього відношення перебуває у лінійній залежності від полярності ЕТ(30) для усіх вивчених 3ГХ, з високими коефіцієнтами кореляції (Таб. 1).

Таблиця 1. Дані лінійних кореляцій логарифму IN*/IT* від ET(30).

R - коефіцієнт кореляції, ЩE(30) - ЕТ(30) віртуального розчинника при IN*/IT* = 1.

Винятково важливим є той факт, що чутливість параметра IN*/IT* до полярності оточення молекул 3ГХ також визначається структурою останніх. Так, нахили лінійних кореляцій для БФ-3ГХ 4, 4m і 4j значно крутіші, ніж для відповідних флавонів 3, 3m і 3j, що свідчить про більш високу чутливість перших до полярності розчинника (Таб. 2).

Робочий діапазон зондів полярності. Для того, щоб вимірювати параметр IN*/IT* з більшою точністю, обидві смуги емісії повинні мало відрізнятися за інтенсивністю. У відношенні до індексу полярності ЕТ(30) ми пропонуємо новий параметр ЩE(30), що дорівнює величині ЕТ(30) віртуального розчинника при IN*/IT* = 1. Бензофурилхромони 4, 4m і 4j демонструють істотно більш низькі значення ЩE(30) у порівнянні з відповідними флавонами 3, 3m і 3j (Таб. 2). Це означає, що діапазон чутливості до полярності для них зміщений у бік менших полярностей. Введення диалкіламіногрупи та її фіксація в юлолідиновий цикл приводить до різкого зменшення ЩE(30). На противагу цьому, введення 7-метоксигрупи забезпечує зсув діапазону чутливості до більш високих значень полярності. Отримані дані свідчать, що шляхом варіації довжини хромофору та положення донорного замісника в молекулі 3-гідроксихромону можна створювати високочутливі флуоресцентні зонди полярності, що працюють у двосмуговому режимі в будь-якій заданій області полярності рідинних середовищ (Рис. 2).

3-Гідроксифлавони - мультипараметричні зонди універсальних і специфічних взаємодій. 3-Гідроксихромони - унікальний клас флуоресцентних барвників, що дозволяє реєструвати одночасно збільшену кількість спектральних параметрів: положення максимумів поглинання (нabs), N*-еміссії (нN*) та Т*-еміссії (нT*), а також співвідношення IN*/IT*. Нами вивчені кореляції цих параметрів для зонду 3 з чотирма фізичними параметрами середовища: функцією полярності розчинника f(е) = (е1)/(2е+1); електронної поляризованості f(n) = (n21)/(2n2+1),

Рис. 2. Спектри флуоресценції 3ГХ 2, 3 і 4, кожен з яких працює у окремому діапазоні полярності розчинників: відповідно у полярних, середньої полярності та неполярних. Спектр у воді був записаний у присутності 10% метанолу. Довжина хвилі збудження 350 нм для 2 та 420 нм для 3 і 4.протонодонорності та протоноакцепторності . Для цього була обрана серія з 21-го розчинника, де максимально змінюються перераховані вище параметри.

Для нейтральних розчинників ( і 0) спостерігається лінійна кореляція між нabs і f(n), у той час як для протонакцепторних ( 0, 0) та особливо протонних розчинників спостерігається систематичне батохромне зміщення.

Рис. 3. Стоксів зсув N* смуги як функція параметру Ліпперта L нейтральных (), протонних () і протоноакцепторних () розчинників.

Положення максимуму N*-форми (нN*) перебуває в чіткій лінійній кореляції з функцією діелектричної проникливості середовища f(е). Систематичні відхилення від лінійності спостерігаються лише для протонних розчинників. Положення максимуму Т*-форми (нТ*) не має виражених кореляцій з f(е) чи f(n). Дуже важливим є принципове розходження у поведінці N* і Т*-смуг у відношенні до протонних розчинників: у той час як N*-смуга зміщується в червону область, Т*-смуга зміщується в синю, внаслідок чого відстань між смугами флуоресценції зменшується.

Стоксів зсув N*-смуги (abs N*) демонструє чітку лінійну кореляцію з функцією Ліпперта L = f() - f(n). Важливо, що ця кореляція має місце для всіх розчинників, включаючи протонні (Рис. 3). Це означає, що незалежно від типу мікрооточення, параметр L можна оцінити зі значень Стоксового зсуву.

Параметр log(IN*/IT*) зонду 3 лінійно корелює з f() окремо для апротонних і протонних розчинників. Цей результат демонструє можливість відокремлення ефекту полярності, пов'язаного з неспецифічними міжмолекулярними взаємодіями, від специфічних ефектів утворення водневого зв'язку протонними розчинниками.

Виходячи з моделі рідинних діелектриків Онзагера, знайдені кореляції дозволяють зробити наступні висновки щодо фотофізики зонду 3, які узгоджуються з припущеннями інших авторів: (а) дипольний момент N*-стану вище дипольних моментів основного N- та збудженого Т*-стану молекули; (б) співвідношення IN*/IT* визначається відносними енергіями N* та Т*-станів, що свідчить про утворення динамічної рівноваги між цими станами на початкових етапах емісії. Останнє підтверджується також тим фактом, що log(IN*/IT*) зонду 3 для всієї серії розчинників лінійно залежить від відстані між максимумами емісії, N* T*. Ця залежність підтримується для всіх досліджених диалкіламіно-заміщених 3ГХ, що свідчить про справедливість зроблених висновків для усієї групи цих сполук. Крім того, висновки узгоджуються з виявленими ефектами впливу замісників на флуоресцентні властивості 3ГХ (див. розділ 3).

Отримані результати мають важливе практичне значення. Вони дають можливість аналізувати одночасно кілька фізичних параметрів середовища за допомогою чотирьох спектроскопічних параметрів - abs, N*, T*, і log(IN*/IT*). Оптимальний спосіб аналізу спектроскопічних даних ми представили у вигляді алгоритму, що дає на виході три незалежні характеристики мікрооточення: полярність, виражену функцією f(е), електронну поляризованість - f(n) та протонодонорність.

Дизайн 3-гідроксихромонів, нечутливих до протонодонорності оточення. Анелювання бензольного кільця поряд з 4-карбонілом не веде до суттєвих змін спектроскопічних властивостей 3ГХ в апротонних розчинниках. Тим часом у протонних розчинниках співвідношення IN*/IT* для флавону 3 майже на порядок вище, ніж для 3b. Детальне порівняння сольватохромії цих сполук у 20 розчинниках дозволяє зробити висновок, що специфічні взаємодії з протонними розчинниками, які сильно впливають на спектри флавону 3, у випадку 3b відсутні. Крім того, дані тонкошарової хроматографії (ТШХ) на силікагелі однозначно свідчать, що 3b в умовах експерименту не здатний утворювати водневі зв'язки з протонним середовищем, тоді як 3 такий зв'язок утворює.

Отже, шляхом усунення впливу специфічних взаємодій на спектральні властивості 3ГХ ми створили зонд, селективно чутливий до полярності середовища. Дійсно, у той час як флавон 3 у протонних розчинниках демонструє систематичні відхилення log(IN*/IT*) у бік вищих значень, для аналога 3b лінійна залежність log(IN*/IT*) від полярності f(е) підтримується для всього ряду розчинників (Рис. 4).

Таким чином, шляхом стеричного екранування 4-карбонілу в 3ГХ можна цілком виключити вплив специфічних взаємодій молекул оточення на спектри флуоресценції. Це свідчить, що в протонних розчинниках єдино важливою специфічною взаємодією, яка чинить суттєвий вплив на спектральні властивості 3ГХ є водневий зв'язок по 4-карбонільній групі.

З практичної точки зору, нами вперше створені флуоресцентні зонди, які здатні окремо вимірювати параметри універсальних і специфічних взаємодій у рідинних середовищах. Це має особливе значення у дослідженнях надмолекулярної організації біосистем, в яких розділення впливів полярності та гідратованості (протонодонорності) має вирішальну роль.

Розділ 5. Випробування нейтральних зондів у обернених міцелах

Однією з найпростіших мікрогетерогенних систем, що моделюють біологічні мембрани, є обернені міцели. Тестування нових зондів у такій системі надає інформацію про їхні сенсорні властивості, яка важлива для подальшої інтерпретації їх поведінки у більш складних системах.

Зв'язування зондів 3 і 4 з оберненими міцелами (0.1 М АОТ/гексан) веде до значного росту інтенсивності флуоресценції та збільшенню співвідношення IN*/IT* (відповідно у 100 і 40 разів). Підвищення вмісту води в міцелах (W0 = [H2O]/[AOT]) призводить до різкого зменшення IN*/IT* (Рис. 5). За величиною відповіді на зміну W0 зонди 3 і 4 не мають аналогів у літературі. Висока чутливість та мультипараметричність спектральної відповіді роблять ці зонди унікальними інструментами для вивчення мікрогетерогенних систем, і зокрема - обернених міцел.

Розділ 6. Мембранні зонди: дизайн, синтез і випробування у ліпосомах

Дизайн і синтез нових зондів. В дослідженнях біомембран першорядною задачею є однозначна локалізація зонду у визначеній області ліпідного бішару, яка досягається шляхом введення катіонної групи в молекулу зонду. З цією метою були синтезовані нові похідні 3ГФ, які містять кватернізований атом азоту: F2, F3 і F4.

Синтез F2 та F3 проводився у 5 стадій, починаючи з хлорометилювання 2'-гідроксиацетофенону, з наступною конденсацією у відповідні халкони та окислювальною гетероциклізацією у 6-етоксиметил-похідні 3ГФ. Останні були переведені у 6-бромометилпохідні, які, реагуючи з відповідними амінами, дали сполуки F2 та F3.

Для синтезу F4 отримано відповідний альдегід, який далі був переведений у похідне 3ГФ. Реакція останнього з 1,3-пропансультоном дала сполуку F4.

Спектральні властивості зондів в органічних розчинниках. В органічних розчинниках флавони F2 і F3 мають практично ідентичні спектральні властивості. Тим часом, у порівнянні з F1 їхні спектри поглинання і флуоресценції зміщені в довгохвильову область та їхні IN*/IT* значно більші. На противагу цьому, для флавону F4 спостерігаються протилежні ефекти. Ці істотні розходження ми приписуємо електростатичному впливу катіонного замісника на хромофор молекули 3ГФ, що стабілізує (F2 і F3) або дестабілізує (F4) збуджений N*-стан.

Локалізація зондів у фосфоліпідних мембранах. Щоб одержати інформацію про локалізацію зондів у бішарі, були проведені експерименти з гасіння флуоресценції зондів поверхневим, середнім і глибинним нітроксид-міченими фосфоліпідами в диолеїлфосфатидилхолінових (ДОФХ) ліпосомах (метод паралакса). За отриманими даними, хромофори зондів F1 і F2 локалізуються на відстані 16 і 15 від центру бішару, що відповідає області естерних груп фосфоліпідів. Тим часом, хромофори зондів F3 і F4 локалізуються значно глибше, у районі вуглеводневих залишків, на відстані відповідно 10 і 7 від центра бішару. Отримані результати узгоджуються з хімічною будовою зондів і дають можливість схематично представити їх розташування у мембрані.

Спектрально-люмінесцентна поведінка зондів у ліпосомах. При зв'язуванні зондів з ліпідними мембранами спостерігається майже 100-кратне збільшення інтенсивності флуоресценції. При цьому зонди F2 і F3 мають найбільші квантові виходи і найкраще розділення двох смуг емісії. Якщо у розчинниках спектри флуоресценції зондів F2 і F3 дуже схожі, то в усіх вивчених ліпідних мембранах вони значно відрізняються, що є наслідком їх принципово різної локалізації в мембрані. Важливою перевагою зондів F1, F2 і F3 є те, що їхні спектри флуоресценції не залежать від концентрації ліпіду в широких межах.

Зонди F1 і F4 демонструють залежність спектрів флуоресценції від складу залишків жирних кислот ліпідів ДОФХ і фосфатидилхоліну яєчного жовтка. Тим часом для зондів з більш точною локалізацією в мембрані - F2 і F3, цей ефект відсутній. Отже, фіксація зонду в мембрані дозволяє усунути побічні ефекти, пов'язані з різноманіттям складу жирнокислотних залишків, яке властиве біомембранам.

Заміна нейтральних ліпідів (ДОФХ або ЯЖФХ) у ліпосомах аніонними (диолеїлфосфатидилгліцерином, ДОФГ або фосфатидилгліцерином яєчного жовтка, ЯЖФГ) веде до збільшення співвідношення IN*/IT* для зондів F1, F2 і F3. У той же час протилежно орієнтований зонд F4 відповідає на ці зміни протилежним чином. Це свідчить про чутливість зондів до змін анізотропних властивостей бішару при зміні заряду його поверхні. Спектри флуоресценції зондів у моноламелярних ліпосомах, утворених ліпідами: ДОФХ (жирні суцільні криві), ДОФГ (жирний штрих), ЯЖФХ (тонкі суцільні криві) та ЯЖФГ (тонкий штрих). Концентрація зондів - 1 мкМ, ліпідів - 200 мкМ для F1, F2 і F3 та 800 мкМ для F4. Спектри нормовані до Т*-максимуму. Середовище: 15 мМ Hepes, pН 7.4.

Таким чином, нові зонди F2 і F3, які більш однозначно локалізуються у ліпідній мембрані в порівнянні з F1 і F4, є більш селективними до її електростатичних характеристик і мають в ній більш досконалі спектрально-люмiнeсцентні властивості. Ці зонди є перспективними у дослідженнях реальних біологічних мембран.

Висновки

1) Удосконалено метод синтезу 3-гідроксихромонів (3ГХ), що дозволило отримати недоступні раніше сполуки даного класу за короткий час і з задовільними виходами.

2) Розроблено нові двосмугові флуоресцентні барвники, що діють за принципом фотопереносу протону: 2-[бензо[d]фуран-2-іл]-3-гідроксихромони, 2-арил-3-гідроксифуро[3,2-g]хромони та 2-арил-3-гідроксибензо[f]хромони. У порівнянні з відомими хромонами, нові сполуки характеризуються найбільш довгохвильовими поглинанням та емісією, а також найвищими квантовими виходами емісії.

3) Показано, що зміною довжини хромофору молекули 3-гідроксихромону та положення -донорних замісників у ній можна направлено регулювати позиції та співвідношення інтенсивностей смуг кожного з таутомерів у спектрі флуоресценції. Квантовий вихід флуоресценції 3-гідроксихромону збільшується при збільшенні кількості конденсованих циклів у молекулі.

4) Показано, що 3-гідроксихромони являють собою новий тип раціометричних зондів полярності, що працюють за принципом фототаутомеризації, і для яких логарифм відношення інтенсивностей двох смуг флуоресценції перебуває у лінійній кореляції з емпіричним індексом полярності ЕТ(30) та з функцією діелектричної проникливості апротонного розчинника. Чутливість і робочий діапазон цих зондів полярності можна регулювати шляхом зміни довжини хромофору та позиції -донорних замісників у молекулі.

5) Показано, що 3ГХ є багатофункціональними зондами, які дозволяють вимірювати одночасно декілька фізико-хімічних параметрів мікрооточення: діелектричну проникливість, показник заломлення та протонодонорність.

6) Показано, що стеричне екранування 4-карбонілу в 3ГХ забезпечує повне усунення впливу протонодонорності середовища на їхні спектри флуоресценції. Це дає можливість розробки нових зондів з чутливістю виключно до полярності оточення.

7) Випробування в обернених міцелах показали, що 3ГХ зонди мають рекордну чутливість до змін параметрів мікрогетерогенного середовища, а їхня багатофункціональність дозволяє контролювати кілька таких параметрів.

8) На основі 3ГХ розроблені нові біомембранні зонди з певною локалізацією у ліпідному бішарі, в залежності від якої вони демонструють різну чутливість до поверхневого заряду та структурної неоднорідності гідрофобної області мембрани.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Klymchenko A.S., Duportail G., Ozturk T., Pivovarenko, V.G., Mйly Y., Demchenko A.P. Novel two-band ratiometric fluorescence probes with different location and orientation in phospholipid membranes// Chem. Biol.-2002.-Vol.-9.-№ 11.-P. 1199-1208.

2. Klymchenko A.S., Demchenko A.P. Electrochromic Modulation of Excited-State Intramolecular Proton Transfer: the New Principle in Design of Fluorescence Sensors// J. Am. Chem. Soc.-2002.-Vol. 124.-№ 41.-P. 12372-12379.

3. Klymchenko A.S., Ozturk T., Demchenko A.P. Synthesis of furanochromones: a new step in improvement of fluorescence properties// Tetrahedron Lett.-2002.-Vol. 43.-№ 39.-Р. 7079-7082.

4. Klymchenko, A.S and Demchenko, A.P. Probing AOT reverse micelles with two-color fluorescence dyes based on 3-hydroxychromone// Langmuir.-2002.-Vol. 18.-№ 15.-P. 5637-5639.

5. Sebnem E., Roshal A.D., Demchenko A.P., Klymchenko A.S. Excited-state proton transfer reaction in a new benzofuryl 3-hydroxychromone derivative: the influence of low-polar solvents// Polish J. Chem.-2002.-Vol. 76.-№ 9.-P. 1287-1299.

6. Demchenko A.P., Klymchenko A.S., Pivovarenko V.G., Ercelen S. Ratiometric probes: design and applications// Fluorescence Spectroscopy, Imaging and Probes - New Tools in Chemical, Physical and Life Sciences (Kraayenhof R, Visser AJWG, Gerritsen HC, eds.) Springer Series on Fluorescence Methods and Applications, Vol. 2, Springer-Verlag, Heidelberg, Germany.-2002.-P. 101-110.

7. Sebnem E., Klymchenko A.S., Demchenko A.P. An ultrasensitive fluorescent probe for hydrophobic range of solvent polarities// Anal. Chim. Acta.-2002.-Vol. 464.-№ 2.-P. 273-287.

8. Duportail G., Klymchenko A.S., Mйly Y., Demchenko A.P. On the coupling between surface charge and hydration in biomembranes. Experiments with 3-hydroxyflavone probes// J. Fluorescence.-2002.-Vol. 12.-№ 2.-P. 181-185.

9. Duportail G., Klymchenko A.S., Mйly Y., Demchenko A.P. Neutral fluorescence probe with strong ratiometric response to surface charge of phospholipid membranes// FEBS Lett.-2001.-Vol. 508.-№ 2.-P. 196-200.

10. Klymchenko A.S., Ozturk T., Pivovarenko V.G., Demchenko A.P. A new 3-hydroxychromone with dramatically improved fluorescence properties// Tetrahedron Letters.-2001.-Vol. 42.-№ 45.-P. 7967-7970.

11. Klymchenko A.S., Ozturk T., Pivovarenko V.G., Demchenko A.P. Synthesis and fluorescent properties of benzo- and naphthofuryl-3-hydroxychromones// Can. J. Chem.- 2001.-Vol. 79.-№ 4.-P. 358-363.

12. Demchenko A.P., Klymchenko A.S., Pivovarenko V.G. 3-Hydroxyflavones as fluorescence probes for molecular and cellular research// Luminescence.-2000.-Vol. 15.-№ 2.-P. 116-118.

13. Klymchenko A. S., Цztьrk T., Pivovarenko V. G., Demchenko A., P. Design of Fluorescent Probes Sensitive to Membrane Potential Based on Intramolecular Excited State Proton Transfer// Proceedings of the Third Conference" Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes" Ed. by A. Kotyk, Espero Publishing, Prague.-1999.-P. 153-158.

14. Pivovarenko V. G., Tuganova A. V., Klymchenko A. S., Demchenko. A. P. Flavonols as models for fluorescent membrane probes. 1. The response to the charge of micelles// Cell. Mol. Biol. Lett. 1997.-Vol. 15.-№ 2.-P. 355-364.

15. S. Klymchenko, T. Цztьrk, V. G. Pivovarenko, A. P. Demchenko Design of Fluorescent Probes Sensitive to Membrane Potential Based on Intramolecular Excited State Proton Transfer// 3rd Conference on Fluorescence Miscroscopy and Fluorescent Probes, Prague, 1999, P. 14.

16. P. Demchenko, A. S. Klymchenko, V. G. Pivovarenko, 3-Hydroxyflavones as Fluorescence Probes for Molecular and Cellular Research// IXth ISLS 2000 Luminescence Symposium , Montpellier, France, 15-17 May 2000, P. 104.

17. Duportail G., Mely Y., Klymchenko A. S., Demchenko A. P. 3-Hydroxyflavones as membrane probes. Dramatic response to lipid composition// 7th Conference on Methods and Applications of Fluorescence: Spectroscopy, Imaging and Probes, 16-19 September 2001, Amsterdam, Netherlands, P 45.

A. S. Klymchenko, T. Ozturk, V. G. Pivovarenko, A. P. Demchenko New 3-hydroxychromones with long-wavelength shifted spectra// 7th Conference on Methods and Applications of Fluorescence: Spectroscopy, Imaging and Probes, 16-19 September 2001, Amsterdam, Netherlands, P 110.

18. Demchenko A. P, Klymchenko A. C., Ercelen S. Fluorescent probes with dramatic change of emission color// 46th Annual Meeting of the Biophysical Society, February 23-27, 2002, San Francisco, California, P. 426a.

Климченко А.С. Флуоресцентні зонди на основі 3-гідроксихромону: синтез, вивчення спектральних і сенсорних властивостей, випробування в моделях біологічних систем. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2003.

На основі 3-гідроксихромонів (3ГХ) створена нова генерація двосмугових флуоресцентних зондів, які функціонують за принципом внутрішньомолекулярного фотопереносу протону. Удосконалено метод синтезу 3ГХ, завдяки чому одержано нові флуоресцентні барвники - похідні 3-гідроксифлавону та 2-[бензо[d]фуран-2-іл]-3-гідроксихромону, в яких варіюється довжина хромофору та -донорність замісників з протилежних його боків. У порівнянні з усіма відомими 3ГХ, нові сполуки характеризуються найбільш довгохвильовими поглинанням і емісією, та рекордними квантовими виходами. Показано шляхи направленої регуляції двосмугової емісії 3ГХ. Похідні 3ГХ запропоновані як багатофункціональні зонди для вивчення одночасно декількох параметрів мікрооточення: полярності, електронної поляризованості та протонодонорності. Показано шляхи направленої регуляції чутливості зондів до певного діапазону полярності. Стеричне екранування 4-карбонілу в 3ГХ забезпечує виключення ефекту протонодонорності середовища, що є новою методологією в створенні селективних зондів полярності. Випробування у обернених міцелах показали, що 3ГХ зонди мають рекордну чутливість до змін параметрів мікрогетерогенного середовища. На основі 3ГХ розроблені нові біомембранні зонди з певною локалізацією у ліпідному бішарі в залежності від якої вони демонструють різну чутливість до поверхневого заряду та структурної неоднорідності гідрофобної області мембрани.

Ключові слова: 3-гідроксихромони, внутрішньомолекулярний фотоперенос протону, двосмугові флуоресцентні зонди, сольватохромія, ліпідні мембрани.

Климченко А.С. Флуоресцентные зонды на основе 3-гидроксихромона: синтез, изучение спектральных и сенсорных свойств, испытания в моделях биологических систем. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоoрганическая химия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2003.

На основе 3-гидроксихромонов (3ГХ) создана новоя генерация двухполосных флуоресцентных зондов, функционирующих по принципу внутримолекулярного фотопереноса протона в возбужденном состоянии. Усовершенствован классический метод синтеза 3-гидроксихромонов, что позволило получать новые красители данного класса за короткое время и с хорошими выходами. Установлены новые закономерности между флуоресцентными свойствами полученных красителей в растворах и их строением: (а) замена 2-фенила на 2-[бензо[d]фуран-2-ил] а также повышение -донорности 2-арила за счет -донорных групп приводит к батохромным сдвигам в спектрах поглощения и флуоресценции, а так же к увеличению эмиссии нормальной возбужденной формы молекулы красителя относительно эмиссии фототаутомера; (б) введение -донора - метокси группы, по положению 7 приводит к противоположному эффекту - гипсохромным сдвигам в спектрах и уменьшению доли эмиссии нормальной формы; (в) замена 2-фенила на 2-[бензо[d]фуран-2-ил] приводит также к повышению квантового выхода флуоресценции; (г) аннелирование фуранового гетероцикла по грани g повышает квантовый выход флуоресценции до рекордных значений а также увеличивает разделение между двумя максимумами эмиссии. 3-Гидроксихромоны предложены как многофункциональные зонды для изучения одновременно нескольких параметров микроокружения: (а) полярности (индекса ЕТ(30) либо функции диэлектрический проницаемости); (б) электронной поляризуемости (функции показателя преломления); (в) протонодонорности среды. Чувствительность зондов к определенному диапазону полярности можно регулировать путем вариации длины хромофора и места установки -электронодонорного заместителя. Cтерическое экранирование 4-карбонила в 3-гидроксихромонах обеспечивает полное выключение специфического эффекта протонодонорности среды, что является новой методологией в создании зондов, избирательно чувствительных к полярности. Испытания зондов в среде обращенных мицелл показали, что они обладают рекордной чувствительностью к изменениям параметров микрогетерогенной среды, а их многофункциональность позволяет отслеживать несколько таких параметров. На основе 3ГХ разработаны новые биомембранные зонды с определенной локализацией в липидном бислое, в зависимости от которой они демонстрируют разную чувствительность к поверхностному заряду и структурной неоднородности гидрофобной области мембраны.

Ключевые слова: 3-гидроксихромоны, внутримолекулярный фотоперенос протона, двухполосные флуоресцентные зонды, сольватохромия, липидные мембраны.

Klymchenko A.S. Fluorescence probes based on 3-hydrohychromone: synthesis, spectral and sensing properties, and examinations in model biological systems. - Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) in Chemistry, speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2003.

Based on 3-hydroxychromone (3HC) a new generation of two-band fluorescent probes, operating by excited state intramolecular proton transfer (ESIPT) principle, was developed. Primarily, the classical method of synthesis of 3-hydtroxychromones was improved, which allowed obtaining new dyes of this class in a short time and with good yields. Сorrelations between structure and spectroscopic properties of the obtained 3HC dyes was established: (a) substitution of 2-phenyl group by 2-[benzo[d]furan-2-yl] and introduction of -donor groups into 2-aryl result in red shifts in absorption and emission spectra and also in increase of emission intensity of the normal excited state form with respect to that of the phototautomer; (b) introduction of -donor methoxy group at 7-position results in the opposite effects: corresponding blue shifts and decrease of the relative intensity of the normal emission; (c) substitution of 2-phenyl group by 2-[benzo[d]furan-2-yl] results also in increase of the fluorescence quantum yield; (d) fused furan ring in 2-aryl-3-hydroxyfuro[3,2-g]chromones increases the quantum yields to the record values and also improves the separation between the two emission bands. 3-Hydroxychromones are introduced as multifunctional probes to study simultaneously several characteristics of microenvironment: (a) polarity (correlated with ET(30) or a function of dielectric constant); (b) electronic polarizability (as a function of refractive index); (c) hydrogen bond donor ability. Sensitivity of the probes to a certain range of polarity can be regulated by variation of the chromophore length and by the introduction of -donor groups at certain positions. Steric screening of 4-carbonyl group in 3-hydroxychromones provides complete elimination of the specific effect of protic media, which can be considered as a new methodology in the development of probes with high selectivity to polarity. Examination of the probes in reversed micelles showed their record sensitivity to changes of structural parameters in microheterogeneous media and ability to sense simultaneously several of these parameters. New 3HC biomembrane probes were developed exhibiting in the bilayer certain localization. Dependent on the latter they demonstrate different sensitivity to the surface potential and structural heterogeneity in the hydrophobic region of the membrane.

Keywords: 3-hydroxychromones, excited state intramolecular proton transfer, two-band fluorescent probes, solvatochromism, lipid membranes.

Размещено на Allbest.ru