Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

УДК 577.164.11 + 547.789

МОДЕЛЮВАННЯ ПЕРЕТВОРЕНЬ ВІТАМІНУ В₁

І ЙОГО СТРУКТУРНИХ ТІАЗОЛІЄВИХ АНАЛОГІВ

В ПРОЦЕСАХ БІОЛОГІЧНОГО ТРАНСПОРТУ

02.00.10 - біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Бугас Роман Валерійович

Київ -2004

Науковий керівник доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Вовк Андрій Іванович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу механізмів біоорганічних реакцій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу хімії білка

доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Бальон Ярослав Григорович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач лабораторії

Провідна установа Інститут органічної хімії НАН України, відділ механізмів органічних реакцій

Захист відбудеться 19 листопада 2004 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 15 жовтня 2004 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

АНОТАЦІЇ

Бугас Р.В. Моделювання перетворень вітаміну В₁ і його структурних тіазолієвих аналогів в процесах біологічного транспорту. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2004. катіон дифузія тіазолій міцела

Встановлено кінетичні закономірності розкриття тіазолієвого циклу вітаміну В₁ і ряду його структурних аналогів. Методом ЕПР вивчено спектральні властивості парамагнітних солей тіазолію в модельних міцелярних системах. Звязування спін-міченого органічного катіону міцелою, що виявляється в збільшенні часу кореляції обертальної дифузії вільного радикалу, залежить від гідрофобності замісника в положенні 5 тіазолієвого циклу, температури і рН розчину. Значення констант швидкості реакції розкриття тіазолієвого циклу, що її каталізує основний компонент трис-НСI-буферу, корелюють з індуктивним ефектом замісників у положенні 3, в тому числі 4-аміно-2-метилпіримідиніл-5-метильного замісника тіаміну. Запропоновано модель участі екзоциклічної аміногрупи в механізмі розкриття 3-[(4-аміно-2-метилпіримідиніл-5)метил]бензтіазолієвого іону. Встановлено, що 3-бензил-4-метил-5-(2-ацилоксиетил)тіазолієві солі ефективно інгібують циклічне фотофосфорилювання в ізольованих хлоропластах гороху.

Ключові слова: тіамін, тіазолієвий іон, розкриття циклу, спіновий зонд, міцела, моделювання, хлоропласти, фотофосфорилювання, механізми реакцій.

Бугас Р.В Моделирование превращений витамина В₁ и его структурных тиазолиевых аналогов в процессах биологического транспорта. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертация посвящена моделированию превращений витамина В₁ и его структурных тиазолиевых аналогов в процессах биологического транспорта.

Впервые синтезированы парамагнитные 3-[(1-оксил-2,2,6,6-тетраметил-пиперидинил-4)аминокарбонилметил]-4,5-диметилтиазолий хлорид и 3-[(1-ок-сил-2,2,6,6-тетраметилпиперидинил-4)аминокарбонилметил]-4-метил-5-[2-(ада-мантил-1-карбонилокси)этил]тиазолий хлорид. Методом ЭПР-спектроскопии изучены свойства этих соединений в водных мицеллярных растворах в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и бромистого цетилтриметил-аммония (CTAB). Связывание спин-меченых органических катионов мицеллами, проявляющееся в увеличении времени корреляции вращательной диффузии (_с), зависит от природы мицеллы, гидрофобности заместителя в положении 5 тиазолиевого цикла, температуры и рН раствора. Существенное возрастание _с при взаимодействии 3-[(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидинил-4)аминокарбонилметил]-4-метил-5-[2-(адамантанил-1-карбонилокси)этил]тиа-золий хлорида с мицеллой СТАВ при рН 7,6 по сравнению с рН 6 вызвано раскрытием тиазолиевого цикла спин-меченого соединения.

Исследованы кинетические закономерности раскрытия тиазолиевого цикла тиамина и его структурных аналогов при катализе общим основанием в присутствии 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислоты в трис-НСI-буфере при 22^оС и ионной силе 1,0 моль/л. Установлено, что значения констант скорости реакции, катализируемой основным компонентом трис-НСI-буфера, коррелируют с индуктивным эффектом заместителей в положении 3 тиазолиевого цикла 3-R-4-метил-5-(2-гидроксиэтил)тиазолиевого иона, в том числе 4-амино-2-метилпиримидинил-5-метильного заместителя тиамина.

Константы скорости обратимого раскрытия цикла 3-[(4-амино-2-метилпиримидинил-5)метил]бензтиазолиевого иона в фосфатном буфере при рН 7,3-7,95 являются более низкими по сравнению с константами скорости превращения иона 3-бензилбензтиазолия. С помощью квантовохимических расчетов в валентном приближении РМ3 изучено пространственное и электронное строение предполагаемых интермедиатов раскрытия цикла 3-[(4-амино-2-метилпиримидинил-5)метил]бензтиазолий хлорида, катализиру-емого основанием. Вероятными являются V-конформеры с внутримолекуляр-ной N(4)-HO(2)-водородной связью.

Рассмотрены механизмы превращений 3-алкилоксикарбонилметил-4-метил-5-(2-гидроксиэтил)тиазолий хлоридов при взаимодействии с ацетилбензоилом и 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия в присутствии мицелл бромистого цетилтриметиламмония при рН 7,5. Превращения включают стадии образования аддукта тиазолиевого иона с субстратом, последующего раскрытия тиазолиевого цикла и окисления тиольной формы. Восстановление 2,6-дихлорфенолиндофенолята характеризуется первым порядком по тиазолиевой соли и первым порядком по окислителю. Порядок реакции по ацетилбензоилу изменяется от первого к нулевому. Наблюдаемые константы скорости второго порядка зависят от гидрофобности углеводородной части заместителя в положении 3 тиазолия.

Установлено, что циклическое фотофосфорилирование с феназин-метосульфатом в изолированных хлоропластах гороха ингибируется 3-бензил-4-метил-5-(2-ацилоксиэтил)тиазолиевыми солями, содержащими в положении 5 липофильный ацильный фрагмент норборнан-2-карбоновой, адамантан-1-карбоновой, адамантан-2-карбоновой, адамантил-2-уксусной, 3-метил-адамантил-1-уксусной и дифенилуксусной кислот. Степень ингибирования синтеза АТФ возрастала при совместном действии тиазолиевой соли и СТАВ в концентрациях, которые не обеспечивали значительного влияния этих соединений в отдельности. Проанализирована зависимость ингибирования фотофосфорилирующей активности хлоропластов от природы заместителей в положениях 3 и 5 тиазолиевого иона. Методом ЭПР изучено связывание хлоропластами спинового зонда - 3-[(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидинил-4)аминокарбонилметил]-4-метил-5-[2-(1-адамантоилокси)этил]тиазолий хлори-да.

Ключевые слова: тиамин, тиазолиевый ион, раскрытие цикла, спиновый зонд, мицелла, моделирование, хлоропласты, фотофосфорилирование, механизмы реакций.

Bugas R.B. The modelling of transformations of vitamin В₁ and its structural analogues in processes of biological transport. - Manuscript.

Thesis for the candidate degree in chemical sciences, speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. - Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.

Kinetic behaviours for thiazolium ring opening of thiamine and its structural analogues have been determined. Properties of paramagnetic thiazolium salts in model biomimetic systems were investigated by EPR spectroscopy. Binding of spin-labeled organic cations to the SDS and CTAB micelles revealed by increase of apparent rotational correlation time depends on the nature of the micelle, hydrophobisity of substituent in position 5 of thiazolium cycle, temperature and pH of solution. The values of the rate constants for reaction catalyzed by buffer base correlate with inductive effect of substituents at position 3 of thiazolium cycle of 3-R-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazolium ion, including 4-amino-2-methylpyrimi-dinyl-5-methyl substituent of thiamine. The model of participation of exocyclic amino group in the mechanism of ring-opening of 3-[(4-amino-2-methylpyrimidinyl-5)methyl]benzothiazolium ion was proposed. It was established that cyclic photophosphorylation in isolated pea chloroplasts is effectively inhibited by 3-benzyl-4-methyl-5-(2-acyloxyethyl)thiazolium salts.

Key words: thiamine, thiazolium ion, ring-opening, spin-labeled thiazolium ion, micelle, modelling, chloroplasts, photophosphorylation, mechanisms of reaction.

Актуальність теми. Вітамін В₁ (тіамін) відіграє важливу роль в процесах життєдіяльності, проявляючи високу нейроактивність і забезпечуючи функціо-нування тіаміндифосфат-залежних декарбоксилаз, дегідрогеназ, оксидаз б-кето-кислот, транскетолази та інших ферментів. Аналіз наукової літератури свідчить про значну кількість робіт, присвячених дослідженню шляхів метаболізму вітаміну В₁ та закономірностей каталітичної дії тіамінових ферментів. При цьому майже не з'ясованими залишаються питання, які стосуються механізмів біологічного транспорту тіаміну. Припускається, що при взаємодії вітаміну В₁ з мембранними структурами і транспортними білками можуть відбуватися його зворотні перетворення в ентіольну або нейтральну трициклічну форму (Brown, 1990; Kozik, 1996). Однак до цього часу подібні реакції тіаміну і його фосфорних естерів не були ідентифіковані з функціями конкретних ферментів чи тіамінзв'язуючих білків.

Актуальність досліджень механізмів біологічного транспорту вітаміну В₁ і тіамінфосфатів обумовлена відомими кореляціями поміж порушеннями їх обміну та розвитком ряду захворювань (Neufeld et al., 2001). Підхід, що застосовується в біоорганічній хімії, включає вивчення механізмів модельних хімічних реакцій тіаміну і його структурних аналогів, в тому числі реакції розкриття тіазолієвого циклу (Washabaugh et al., 1995). Детальні дослідження таких перетворень сприяють формуванню уявлень про реакційну здатність природних і синтетичних похідних тіазолію в живій клітині.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною науково-дослідних робіт Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (теми 2.1.10.13-99 "Дослідження біоміметичних реакцій з метою розробки теоретичних основ спряження одно- та дво-електронних стадій в біохімічних системах", № держреєстрації 0199U003949, ЦНП 25-02 „Дослідження модельних перетворень природних і синтетичних біорегуляторів. Фундаментальні основи пошуку і створення нових біологічно активних речовин”, № держреєстрації 0102U005104).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було встановлення властивостей і вивчення закономірностей перетворень вітаміну В₁ та його структурних тіазолієвих аналогів в модельних хімічних і біохімічних системах. Завдання дослідження включали:

- синтез спін-мічених солей тіазолію і вивчення взаємодії парамагнітних моделей вітаміну В₁ з катіонними та аніонними міцелами;

- визначення і порівняння кінетичних параметрів розкриття тіазолієвого циклу тіаміну і його структурних аналогів в присутності загальної основи;

- дослідження впливу 4-аміно-2-метилпіримідиніл-5-метильного замісника на швидкість розкриття бензтіазолієвого циклу і квантовохімічні розрахунки ймовірних інтермедіатів реакції;

- вивчення модельних перетворень 3-алкілоксикарбонілметилтіазолій хлоридів при взаємодії з карбонільними сполуками в змішаних міцелах;

- дослідження впливу ліпофільних тіазолієвих катіонів на фотосинтетичні мембрани в хлоропластах.

Обєкт дослідження - вітамін В₁ та інші солі тіазолію.

Предмет дослідження - механізми модельних перетворень тіаміну і його структурних аналогів.

Методи дослідження - хімічна кінетика, спектрофотометричний аналіз, органічний синтез, високоефективна рідинна хроматографія, ЕПР-спектроско-пія, ЯМР ¹Н-спектроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше продемонстровано залежне від температури і рН зв'язування парамагнітного тіазолієвого іону, що вміщував 2,2,6,6-тетраметилпіперидиніл-4-амінокарбонілметильний замісник в положенні 3, міцелами бромистого цетилтриметиламоній броміду та додецил-сульфату натрію. Визначено константи швидкості розкриття тіазолієвого циклу тіаміну та його структурних аналогів в присутності загальної основи і показано, що каталіз основним компонентом буферу корелює з індуктивним ефектом замісника, в тому числі 4-аміно-2-метилпіримідиніл-5-метильного, в положенні 3 тіазолієвого іону. На основі квантовохімічних розрахунків та результатів кінетики перетворення 3-[(4-аміно-2-метилпіримідиніл-5)метил]бензтіазолієво-го іону в тіольну форму представлено модель участі екзоциклічної 4?-аміно-групи в механізмі розкриття бензтіазолієвого циклу. Продемонстровано роль карбонільного субстрату в реакції розкриття тіазолієвого циклу в міцелярному середовищі. Встановлено закономірності інгібуючого впливу ліпофільних тіазолієвих солей на фотофосфорилюючу систему хлоропластів гороху.

Практичне значення одержаних результатів. Вперше синтезовано спін-мічені похідні тіазолію, які можуть бути використані на практиці для досліджень тіамінзв'язуючих білків та процесів біологічного транспорту вітаміну В₁. Синтезовано ряд нових солей тіазолію, що ефективно інгібують фотофосфорилювання в хлоропластах гороху. Результати роботи можуть бути важливими для обґрунтування зв'язку поміж структурою та біологічною активністю тіазолієвих аналогів тіаміну.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом виконано експериментальну частину дисертаційної роботи, проведено необхідні розрахунки кінетичних та інших параметрів, проаналізовано отримані результати. Планування роботи, обговорення механізмів і формулювання висновків відбувалося спільно з науковим керівником. Друковані роботи були підготовлені за безпосередньою участю дисертанта.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на наукових конференціях з біоорганічної хімії та нафтохімії ІБОНХ НАН України (Київ, 2002 р., 2003 р.), XIX та XX Українських конференціях з органічної хімії (Львів, 2001 р., Одеса, 2004 р.), VIII Українському біохімічному з'їздові (Чернівці, 2002 р.), Міжнародній конференції “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, 2002 р.), Міжнародній конференції з хімії азотвмісних гетероциклів (Харків, 2003 р.).

_{Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті в наукових фахових виданнях і тези 7 доповідей.}

_{Структура та обєм роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, викладу отриманих результатів та їх обговорення, висновків і списку літератури (141 найменування). Дисертаційна робота налічує 123 сторінки друкованого тексту і проілюстрована 6 таблицями та 21 малюнком.}

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В першому розділі представлено огляд літератури, яка присвячена вивченню механізмів модельних перетворень вітаміну В₁ і його структурних тіазолієвих аналогів.

В другому розділі описано синтези вихідних речовин, що були об'єктами дослідження, та умови проведення експериментів.

Третій розділ включає результати вивчення методом ЕПР спектральних властивостей спін-мічених іонів тіазолію в міцелярних системах. Представлено кінетичні дані реакції розкриття тіазолієвого циклу тіаміну і його структурних аналогів в присутності загальної основи. Розглянуто вплив 4-аміно-2-метил-піримідиніл-5-метильного замісника на швидкість розкриття бензтіазолієвого циклу і подано квантовохімічні розрахунки та стереохімічні моделі ймовірних інтермедіатів цієї реакції. Обговорюються результати дослідження перетворень солей тіазолію в міцелярному середовищі в присутності ацетилбензоїлу. Проаналізовано взаємодію ліпофільних тіазолієвих катіонів з фотофосфори-люючою системою хлоропластів.

Спін-мічений іон тіазолію: рН-залежне зв'язування міцелою

Стабільні нітроксильні радикали застосовуються в біоорганічній хімії для дослідження біорегуляторів та процесів, що відбуваються за їх участю, методом ЕПР (Жданов, 1981; Likhtenshtein et al., 2000). Нами вперше синтезовано парамагнітні структурні аналоги вітаміну В₁ - 3-[(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпі-перидиніл-4)амінокарбонілметил]-4,5-диметилтіазолій хлорид (1) і 3-[(1-ок-сил-2,2,6,6-тетраметилпіперидиніл-4)амінокарбонілметил]-4-метил-5-[2-(ада-мантил-1-карбонілокси)етил]тіазолій хлорид (2). Методом ЕПР досліджено властивості вільних радикалів 1 і 2 при взаємодії з катіонними та аніонними міцелами в фосфатному буфері (рН 6 і рН 7,6) в інтервалі температур від 20^оС до 60^оС. Вид спектрів ЕПР спінових зондів 1, 2 в міцелярному розчині визначається рядом факторів, найсуттєвішими з яких є константи надтонкої взаємодії та час кореляції обертальної дифузії (ф_с). За умов дослідів величина ф_с відповідала закономірностям „швидкого” ізотропного обертання.

Ці дані вказують на те, що ефективність взаємодії спін-міченого тіазолієвого іону з аніонною міцелою SDS може визначатися величиною рН середовища.

Зв'язування радикалу 1 міцелами, які утворені цетилтриметиламоній бромідом (CTAB), при рН 6 та 7,6 є менш значним (рис. 2). Однак у випадку радикалу 2, що вміщує гідрофобний замісник у положенні 5, при рН 7,6 з підвищенням температури інтенсивність обертання суттєво знижується (величина ф_с зростає), що свідчить про можливі перетворення тіазолієвого іону при взаємодії з гідроксид-іонами, які концентруються рядом з катіонними центрами надмолекулярного асоціату.

Таким чином, введення 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинільного залишку в структуру замісника в положенні 3 тіазолієвого циклу дозволяє методом ЕПР продемонструвати його властивості в міцелярних системах, зокрема: рН-залежне (конкурентний вплив протонів) зв'язування міцелою SDS; рН-залежне зв'язування міцелою CTAB, спричинене хімічними перетвореннями гідрофобного іону тіазолію за участю гідроксид-іонів.

Кінетику розкриття тіазолієвого циклу в присутності загальної основи (трис-HCl-буфер) досліджували, використовуючи спряжену реакцію тіол-дисульфідного обміну ентіольної форми, що утворюється, з 5,5-дитіобіс-2-нітробензоатом. Для того, щоб оцінити вплив 4-аміно-2-метилпіримідиніл-5-метильного замісника в положенні 3 тіазолієвого циклу, реакційну здатність вітаміну В₁ (3) порівнювали з реакційною здатністю його структурних аналогів 4-8.

Було встановлено, що початкова швидкість утворення 5-тіо-2-нітро-бензоату зростає пропорційно збільшенню концентрації тіаміну або солі тіазолію, а константи швидкості, що спостерігаються, не змінюються при різних концентраціях реагенту Еллмана. Це свідчить про перший порядок реакції за тіазолієвою сіллю і нульовий порядок за 5,5-дитіобіс-2-нітро-бензойною кислотою. З нахилу залежностей отриманих констант швидкості псевдопершого порядку (k₁^obs) від концентрації трис-НСl-буферу, що були лінійними в інтервалі рН 7,8-8,4, розраховано уявні константи швидкості каталізу трис(гідроксиметил)амінометаном у складі буферу. Відрізок, що відтинається на осі ординат, відповідає константі швидкості k_o, яка пов'язана з іншими реакціями, що каталізуються водою та іонами гідроксиду. Тобто, ці залежності описуються рівнянням:

k₁ ^obs = k_o + k _B [буфер],

де - k _B - уявна константа швидкості каталізу трис-НСl-буфером.

Згідно приведеної нижче схеми реакція включає нуклеофільну атаку гідроксид-іону в положення 2 тіазолієвого іону (Q), наступний розрив С(2)-S-зв'язку нейтрального тетраедричного інтермедіату Т^о з утворенням ентіоляту T^S і його взаємодію з реагентом Еллмана (RSSR).

При стаціонарності ентіоляту T^S швидкість реакції утворення 5-тіо-2-нітробензоату, що каталізується загальною основою (В), можна представити рівнянням де K_T - константа рівноваги на стадії утворення нейтрального тетраедричного інтермедіату Т^о, k_B - константа швидкості на стадії утворення інтермедіату Т^S, k₂ - константа швидкості взаємодії ентіоляту Т^S з 5,5-дитіобіс-2-нітро-бензоатом.

За умови, що k₂[RSSR]k_-1[BH⁺], справедливе рівняння

(k₁^obs - k_o)(1+ [H⁺]/K_WK_T ) = k_В [буфер]

де k_В - константа швидкості каталізу загальною основою з урахуванням вкладу нейтрального тетраедричного інтермедіату Т^о, а значення k_o визначається виразом:

k_o = (k_H2O + k_HO- [HO^-])/(1+ [H⁺]/K_WK_T )

Для ряду тіазолієвих солей K_T=10^6,9 (Washabaugh et al., 1993, 1996). Дані рис. 4 вказують на те, що немає суттєвих відмінностей в порядку значень констант швидкості k?_o при перетвореннях тіаміну та його структурного аналога - 3-(4-нітробензил)-4-метил-5-(2-гідроксиетил)тіазолій хлориду. При цьому зміна значень k?_o з підвищенням рН задовільно узгоджується зі зміною констант швидкості реакції розкриття тіазолієвого циклу у відсутності 5,5-дитіобіс-2-нітробензоату, визначених в карбонатному буфері при рН 10-10,7 (k^obs).

Уявні константи швидкості каталізу трис-НСl-буфером (k_В), що враховують частку Т^о у рівновазі з тіазолієвим іоном Q (розрахунки при K_T=10^6,9), прямо пропорційні концентрації непротонованого трис(гідрокси-метил)амінометану у складі буферу. Екстраполяція лінійної залежності до 100% загальної основи дає константу каталізу k_В.

Вплив замісників у положенні 3 тіазолієвого циклу вітаміну В₁ і його структурних аналогів 4, 5, 7, 8 на швидкість реакції розкриття тіазолієвого циклу, яка каталізується загальною основою, вкладається в кореляційні співвідношення Гаммета. Вплив трис-НСI-буферу на швидкість розкриття тіазолієвого циклу тіаміну представляється як каталіз загальною основою перетворення нейтрального тетраедричного інтермедіату реакції Т^о в ентіолят Т^S. Механізм цієї стадії може включати узгоджений чи послідовний перенос протону. Часткове зниження значення k_B розкриття тіазолієвого циклу при використанні як субстрату окситіаміну вказує на можливість реалізації внутрішньомо-лекулярних С(4)О•••Н-О-С(2)-взаємодій, що змінюють кислотність протону гідроксильної групи нейтрального тетраедричного інтермедіату.

Як модельні сполуки використовували 3-[(4-аміно-2-метилпіримідиніл-5)метил]бензтіазолій хлорид гідрохлорид (9) і 3-бензилбензтіазолій хлорид (10). В водних буферних розчинах (рН 5,2-7,95) сіль бензтіазолію 9 знаходиться в рівновазі з продуктом, не протонованим по атому азоту в положенні 1? (рК_а?=5,38, Washabaugh, 1996).

Розкриття бензтіазолієвого циклу сполук 9 і 10 в фосфатному буфері підкоряється закономірностям зворотних реакцій псевдопершого порядку. При рН 5,2-6,5 значення констант швидкості псевдопершого порядку обох реакцій приблизно рівні, але при рН>7 реакційна здатність бензтіазолієвого іону 9 нижча від реакційної здатності його бензильного аналога 10.

Для з'ясування можливої ролі 4-аміно-2-метилпіримідиніл-5-метильного фрагменту в процесі розкриття бензтіазолієвого циклу солі 9 за допомогою квантовохімічних розрахунків у валентному наближенні РМ3 нами вивчено просторову та електронну будову проміжних сполук реакції. За аналогіями з вітаміном В₁ (Shin et al., 1993) конформацію солі бензтіазолію представляли значеннями торсійних кутів _T=С(5)-С(3,5)-N(3)-C(2) і _Р= N(3)-С(3,5)-C(5)-С(4). Розрахунки Н_утв. свідчать, що найбільш ймовірними у вакуумі є V-форми (_T?±90^o и _Р?₊90^o) інтермедіатів розкриття 3-[(4-аміно-2-метилпіримідиніл-5)метил]бензтіазолієвого циклу з внутрішньомолекулярним N(4)-HO(2)-водневим зв'язком (структури 11 і 12). Віддаль між атомом водню 4-аміногрупи і атомом кисню (структура 12) складає 1,67 Е, а значення кута N(4)-Н-O(2) - 164,5^о. Можна припустити, що реалізація подібних взаємодій у розчині буде впливати на перехідний стан стадії розриву С(2)-S-зв'язку тетраедричного інтермедіату 12.

Перетворення 3-алкілоксикарбонілметилтіазолій хлоридів в змішаних міцелах при взаємодії з ацетилбензоїлом

Окиснювальний розклад 1,2-дикетонів в присутності СТАВ і гідрофобних солей тіазолію як каталізаторів моделює фосфорокластичні реакції ТДФ-залежних ферментів (Shinkai еt al., 1983). Методом ВЕРХ і спектрофотометрії нами досліджено перетворення ацетилбензоїлу та 2,6-дихлорфеноліндофенолу (фосфатний буфер, рН 7,5) в міцелах СТАВ в присутності 3-алкілоксикарбоніл-метил-4-метил-5-(2-гідроксиетил)тіазолій хлоридів 13-20. З'ясувалося, що за умов реакції відбувається не каталітична реакція, а розкриття тіазолієвого циклу і окиснення органічного каталізатора.

Ймовірна схема перетворень солей тіазолію 13-20 в змішаних катіонних міцелах включає утворення адукту тіазолієвого іону з ацетилбензоїлом і подальше розкриття тіазолієвого циклу та окиснення тіольної форми 2,6-ди-хлорфеноліндофенолом. При цьому швидкість розкриття тіазолієвого циклу в міцелярній системі з ацетилбензоїлом значно перевищує швидкість аналогічних реакцій у відсутності субстрату. Прискорення реакції тіолізації за наявності 1,2-дикетону спостерігається і при визначенні ентіоляту за допомогою 5,5-дитіобіс-2-нітробензойної кислоти.

Кінетичні дослідження показали, що відновлення 2,6-дихлорфенол-індофеноляту в міцелярному розчині характеризується першим порядком за тіазолієвою сіллю і першим порядком за окисником. Порядок реакції за ацетилбензоїлом змінюється від першого до нульового. Розраховані на основі даних кінетики константи швидкості k₂^obs зростають при переході від сполук 13, 16, 18 до солей 14, 15, 19, 20 зі збільшенням гідрофобності вуглеводневої частини замісника в положенні 3 тіазолію. В присутності 3-етил-оксикарбонілметил-4-метил-5-(2-гідроксиетил)тіазолій хлориду (17) концентра-ція 2,6-дихлорфеноліндофенолу не змінювалася.

Багато сполук, що взаємодіють з функціональними системами тилакоїдних мембран, є органічними катіонами з гідрофобними замісниками. Ми припустили, що лабільність тіазолієвого циклу з ліпофільним замісником може сприяти його переміщенню, а також фіксації природними мембранними структурами. З огляду на це були синтезовані та досліджені як інгібітори ФМС-залежного фотофосфорилювання в хлоропластах гороху солі тіазолію 21-28.

Виявилось, що важливим для інгібуючого впливу на активність хлоропластів є наявність бензильного замісника в положенні 3 тіазолієвого циклу інгібітора. Використання гідрохлориду 27 чи N-фенацильного похідного 28 приводило до зниження інгібуючого ефекту. Разом з тим, пригнічення активності хлоропластів в реакції фотофосфорилирования підсилювалось при спільній дії тіазолієвого іону та катіону цетилтриметиламонію. Так, окремо 3-бензил-4-метил-5-[2-(адамантил-2-ацетокси)етил]тіазолій хлорид (5•10^-5 М) (24) і СТАВ (5•10^-5 М) мало впливали на ФМС-залежну реакцію, а при спільній дії ці органічні катіони інгібували її більше, ніж на 60%. При цьому витрачання неорганічного фосфату в реакційній суміші корелювало з перетворенням АДФ в АТФ. Ймовірний механізм синергічної дії тіазолієвої солі і СТАВ може включати формування ними змішаних надмолекулярних асоціатів.

Зв'язування тіазолієвого іону хлоропластами вивчено нами за допомогою спін-міченого 3-[(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидиніл-4)амінокарбонілме-тил]-4-метил-5-[2-(адамантил-1-карбонілокси)етил]тіазолій хлориду (2). Залеж-ність ln_с від 1/T у середовищі без хлоропластів і з хлоропластами характеризувалася монотонною зміною інтенсивності обертання парамагнітної сполуки 2 в інтервалі температур від 20^оС до 60^оС (рис. 8, криві 1 і 2). При цьому нахил залежностей, що характеризує енергію активації обертальної дифузії вільного радикалу, в присутності хлоропластів є меншим (рис. 8, крива 2). За наявності 5•10^-5 М 3-бензил-4-метил-5-[2-(адамантил-2-ацетокси)етил]-тіазолій хлориду (24) спостерігалися якісні зміни характеру залежності ln_с радикалу 2 від 1/T. Отримані результати свідчать про іммобілізацію вільного радикалу 2 хлоропластними структурами та чутливість спінового зонду до змін у його найближчому оточенні.

Ступінь інгібування активності хлоропластів солями 21-26 зростала зі збільшенням ліпофільності замісника в положенні 5 тіазолієвого іону. Найменш ефективним був вплив похідних тіазолію 21 і 22. В ряду сполук 23-26 інгібування на фоні СТАВ (5•10^-5 М) найбільшою мірою виявлялося при дії 3-бензил-4-метил-5-[2-(адамантил-2-ацетокси)етил]тіазолій хлориду (24) і 3-бензил-4-метил-5-[2-(3-метиладамантил-1-ацетокси)етил]тіазолій хлориду (25). Інгібування початкової швидкості реакції відносно даних контрольних дослідів в присутності СТАВ (5•10^-5 М) і сполуки 25 в концентраціях 5•10^-5 М, 2,5•10^-5 М, 1•10^-5 М складало 99%, 81% і 72%, відповідно.

Очевидно, ліпофільні органічні катіони при концентруванні у внутрішньому просторі хлоропластів здатні адсорбуватися на гідрофобних ділянках тилакоїдних структур фотосистеми I. При цьому перетворення тіазолієвого іону, що супроводжуються розкриттям циклу, можуть сприяти переміщенню ефектора і його взаємодії з мембранними білками.

ВИСНОВКИ

1. Результати дисертаційної роботи свідчать, що для вивчення механізмів біологічного транспорту вітаміну В₁ може бути застосований метод спінового зонду. Синтезовано спін-мічені тіазолієві солі, не заміщені у положенні 2, та досліджено їх спектральні властивості в модельних міцелярних системах додецилсульфату натрію і цетилтриметиламоній броміду. Встановлено, що зв'язування тіазолієвого іону міцелою залежить від температури і рН середовища.

2. Аналіз кінетичних даних розкриття тіазолієвого циклу тіаміну і його структурних тіазолієвих аналогів при каталізі загальною основою в присутності 5,5-дитіобіс-2-нітробензойної кислоти дозволяє зробити висновок, що вплив 4-аміно-2-метилпіримідиніл-5-метильного замісника на константу швидкості реакції визначається його індуктивним ефектом і не пов'язаний з внутрішньомолекулярною дією 4?-аміногрупи вітаміну В₁. Разом з тим, специфічна роль замісника в положенні 3 проявляється в реакції розкриття тіазолієвого циклу окситіаміну.

3. Запропоновано модель участі екзоциклічної 4?-аміногрупи в механізмі розкриття бензтіазолієвого циклу 3-[(4-аміно-2-метилпіримідиніл-5)метил]-бензтіазолієвого іону, яка заснована на кінетичних даних та квантово-хімічних розрахунках ймовірних інтермедіатів реакції (у вакуумі) і включає утворення внутрішньомолекулярного N(4)-HO(2)-водневого зв'язку.

4. Результати дослідження біологічно активних 3-алкілоксикарбонілметил-4-метил-5-(2-гідроксиетил)тіазолій хлоридів в міцелах цетилтриметиламоній броміду вказують на те, що за наявності карбонільного субстрату (фосфатний буфер, рН 7,5) перебіг каталітичної реакції супроводжується розкриттям тіазолієвого циклу каталізатора. Константи швидкості окиснювальних перетворень солей тіазолію в присутності ацетилбензоїлу і 2,6-дихлорфеноліндофенолу зростають зі збільшенням гідрофобності вуглеводневої частини замісника в положенні 3 тіазолієвого циклу.

5. Знайдено, що 3-бензил-4-метил-5-(2-ацилоксиетил)тіазолієві солі ефективно інгібують ФМС-залежне фотофосфорилювання, а спіновий зонд - 3-[(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидиніл-4)амінокарбонілметил]-4-метил-5-[2-(адамантил-1-карбонілокси)етил]тіазолій хлорид - зв'язується хлоро-пластами гороху. Вплив тіазолієвого іону на функціонування фотосистеми I зростає за наявності цетилтриметиламоній броміду і забезпечується ліпофільним ацильним фрагментом в структурі замісника в положенні 5 та бензильним залишком біля четвертинного атому азоту.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бугас Р.В., Вовк А.И. Кинетика раскрытия тиазолиевого цикла тиамина и его структурных аналогов в присутствии 5,5?-дитиобис-2-нитробензойной кислоты // Журнал органічної та фармацевтичної хімії. - 2004. - Т. 2, вип. 2 (6).- С. 71-77.

2. Бугас Р.В., Вовк А.И., Мельник А.К. Спин-меченый ион тиазолия: рН-зависимое связывание мицеллой // Доповіді НАН України. - 2004.- № 3. - С. 128-133.

3. Бугас Р.В., Вовк А.И. Модельные превращения 3-алкилоксикарбонил-метилтиазолиевого иона в катионной мицелле // Укр. хим. журн. - 2003. - Т. 69, № 8. - С. 123-128.

4. Пархоменко Ю.М., Вовк А.И., Бугас Р.В. Моделирование функций биохимических тиаминсвязывающих систем // Фізіологічно активні речовини. - 2002. - № 2 (34).- С. 99-103.

5. Вовк А.І., Романенко О.В., Бугас Р.В., Шепелєв С.Є. Реакційна здатність і біологічна активність 3-алкілоксикарбонілметил-4-метил-5-(2-гідроксие-тил)тіазолій хлоридів // Укр. біохім. журн. - 2002.- Т. 74, № 4а.- С. 29-30.

6. Вовк А.І., Пархоменко Ю.М., Бугас Р.В. Механістичні аспекти взаємодії тіаміну з синаптосомами // XIX Українська конференція з органічної хімії. Тези доповідей. - Львів, 2001. - С. 149.

7. Вовк А.И., Романенко А.В., Бугас Р.В. Синтез, модельные превращения и биологическая активность 3-алкилоксикарбонил-метил-4-метил-5-(2-гидроксиэтил)тиазолий хлоридов // Межд. научно-практ. конф. “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ”. Тезисы докладов. - Алушта, 2002. - С. 13-14.

8. Vovk A.I., Bugas R.V. Мechanistic models for thiazolium ring opening of thiamin catalyzed by general base // International conference chemistry of nitrogen containing heterocycles. Abstracts. - Kharkiv, 2003. - P. 219.

9. Bugas R.V., Vovk A.I. The structure and reactivity of the intermediates of 3-[(4-amino-2-methylpyrimidinyl-5)-methyl]benzothiazolium ion ring opening // International conference chemistry of nitrogen containing heterocycles. Abstracts. - Kharkiv, 2003. - P. 131.

10. Бугас Р.В., Вовк А.І. Спін-мічений іон тіазолію: модельні рН-залежні перетворення // XX Українська конференція з органічної хімії. Тези доповідей. - Одеса, 2004. - С. 129.

11. Вовк А.І., Міщенко І.В., Харченко О.В., Бугас Р.В., Бабій Л.В., Харитоненко Г.І. Вплив ліпофільних тіазолієвих катіонів на фотофосфорилювання в хлоропластах гороху // XX Українська конференція з органічної хімії. Тези доповідей. - Одеса, 2004. - С. 395.

Размещено на Allbest.ru